CC BY
5
УДК 613.32:576.858.23]-078
К ВОПРОСУ О ПРИМЕНЕНИИ МЕТОДА ПЕННОЙ ФЛОТАЦИИ ДЛЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЭНТЕРОВИРУСОВ В ВОДЕ
Канд. мед. наук Г. А. Багдасарьян, канд. физ. наук В. Ф. Жевержеева
Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
Унифицированных методов отбора и первичной обработки проб воды открытых водоемов для санитарно-вирусологического анализа на присутствие вирусов кишечной группы не существует. В то же время исследователю часто приходится встречаться со сравнительно низкой концентрацией вирусов в речной воде. Следовательно, необходимым этапом санитарно-
вирусологического исследования ее (а еще в большей степени водопроводной воды, прошедшей соответствующую очистку) является первичная концентрация энтеровиру-сов в пробе.
В последние годы появились многочисленные сообщения об использовании эффекта пенообразова-ния для выделения из промышленных сточных вод ряда химических ингредиентов промышленного стока. Флотационный процесс в сточных водах сопровождается такими явлениями, как аэрация, снижение концентрации радиоактивных, поверхностно-активных и некоторых растворенных веществ, что способствует процессам очистки сточных вод. Некоторые авторы (A. Dognon; Hopper и McCowen; Boyles и Lincoln) успешно применили этот метод также для выделения и концентрации из воды вегетативных клеток и спор различных видов бактерий. Установлено, что бактериальные клетки в значительном количестве концентрируются в пене.
Нами была сделана попытка применить метод пенной флотации для концентрации в пробах воды Общий вид установки. энтеровирусов. Опыты проводили
на стеклянной колонке диаметром 25 мм и высотой 45 см (см. рисунок). В нижнюю часть колонки впаяна пористая фарфоровая пластинка для диспергирования воздуха. Последний продувают через пластинку ручным способом при помощи резинового баллона, соединенного с нижней частью колонки. Верхняя часть колонки отогнута вниз для отвода образующейся пены. В нижней суженной части колонки находится кран, с помощью которого регулируют слив очищенной воды.
В качестве модели мы использовали в опытах аттенуированный штамм LSc, 2ab вируса полиомиелита типа 1. Без добавления к исходной пробе пенообразующих веществ нам не удалось выделить вирус. Учитывая, что вирусы кишечной группы способны в значительном количестве адсорби-
роваться на белковых молекулах, мы попытались использовать для концентрации вируса полиомиелита в исследуемой воде нативную бычью сыворотку крови. Сыворотка выполняла двоякую роль: адсорбировала вирусы и одновременно служила пенообразующим веществом. Исследования проводили. с дехлорированной водопроводной водой. Возможности концентрации вирусов полиомиелита при помощи метода пенной флотации мы изучали следующим образом. В водопроводную дехлорированную воду (жесткость 10—12°, рН около 7,0) добавляли аттенуированный штамм Ь5с, 2аЬ вируса полиомиелита типа 1 в виде вируссодержащей жидкости с таким расчетом, чтобы содержание вируса в пробе составляло 2,0—1,0 ^ ТЦДбо мл ■ В исследуемую пробу объемом 100 мл добавляли 0,1 мл нативной бычьей сыворотки и пробу заливали в колонку, стерилизованную автокла-вированием.
При продувании воздуха через пористую пластинку в колонке образовывалась пена, которая постепенно заполняла ее верхнюю часть, выходила из загнутого вниз патрубка и собиралась в пеноприемник. В качестве пе-ноприемника мы использовали стерильный мерный стакан объемом 200 мл. По окончании процесса пенообразования открывали кран, находящийся в нижнем оттянутом конце колонки и очищенную воду собирали в стерильный стакан. Весь процесс отделения пены из исследуемой пробы, и, следовательно, извлечение пеной энтеровирусов из объема воды, равного 100 мл, длился 2—Змин. Введенный пенообразователь извлекали пеной почти полностью.
Опыт заканчивали в момент прекращения образования пены. Объем жидкости, образующейся после распада собранной в пеноприемник пены, составлял 4—6% объема обрабатываемой пробы. Эта величина, по-видимому, не является предельной, так как вынос воды пеной в значительной степени зависит от ряда моментов, которые могут быть учтены: рН среды, количества и свойств пенообразователя, конструктивных особенностей прибора и др. Естественно оптимальными условиями являются те, при которых максимальное количество вируса будет концентрироваться в минимальном объеме пены.
В процессе пенообразования большую роль играют скорость подачи воздуха и степень диспергирования его пузырьков. Минимальную скорость продувания воздуха через пористую пластинку мы определяли порогом давления, достаточного для преодоления гидростатического напора в колонке и сопротивления пористой пластинки. Увеличение скорости продувания воздуха нежелательно, так как при этом ухудшаются условия пенообразования и полного извлечения из пробы пенообразователя — нативной бычьей сыворотки крови, что в свою очередь отрицательно влияет на концентрацию вирусов — происходит значительный вынос воды пеной.
В каждом опыте мы исследовали следующие фракции пробы на наличие вируса полиомиелита: исходную воду, распавшуюся пену и фильтрат (очищенная вода, слитая из колонки по окончании процесса пенообразования). Каждую фракцию помещали в пенициллиновые флаконы, добавляли пенициллин и стрептомицин из расчета 1000 ЕД на 10 мл пробы для подавления бактериальной флоры и хранили в замороженном состоянии до проведения вирусологических исследований. Вирус титровали в однослойной пробирочной культуре почечной ткани обезьян (зеленых мартышек) по 4 пробирки на разведение. Титр вируса вычисляли по методу Рида и Менка и выражали в ТЦД50)ЛЛ.
Были поставлены 2 серии опытов (по 10 в каждой) с искусственно зараженной дехлорированной водопроводной водой для изучения концентрации вируса полиомиелита в пене. В первых 2 опытах каждой серии использовали разведение вируса 10—5, в остальных — разведение вируса 10-6. Результаты опытов, обработанные методом Рида и Менка, приведены в таблице.
Как видно из таблицы, вирус определялся в исходной воде лишь в первых 2 опытах каждой серии (разведение вируса 10~5). В остальных пробах разведение вируса было настолько значительным, что в исходной воде без предварительной концентрации его не удавалось обнаружить. В то же время в пене во всех опытах нами был обнаружен вирус. В результате концентрации вируса в процессе пенообразования и выноса его с пеной титр повышался от 1,36 до 2,2 lg ТЦД50|ЛЛ. Среднее повышение титра вируса отмечалось в пределах 1,68.
Таким образом, при использовании метода пенной флотации для концентрации вируса полиомиелита в пробах воды в условиях эксперимента получена концентрация его в среднем в 50 раз. Из 20 опытов в 3 в фильтрате обнаружен вирус в незначительном количестве (в 1—2 из 4 пробирок, зараженных неразведенным фильтратом, отмечался слабый цитопатический эффект). Эти результаты относятся к 1-му и 2-му опытам, в которых использованы большие исходные концентрации вируса.
После того как метод был отработан и в экспериментальных условиях получены положительные результаты, свидетельствующие о возможности концентрации вирусов кишечной группы в пене, мы при помощи метода пенной флотации обследовали 10 проб воды из р. Москвы и р. Сходни на наличие энтеровирусов. Ни в одной пробе ци-топатогенные энтеровирусы без предварительной концентрации не были выделены. При посредстве метода пенной флотации в 4 пробах удалось обнаружить цитопатогенные энтеровирусы. Типирование выделенных цитопатогенных агентов с типоспецифическими сыворотками позволило определить в 2 пробах вирус ЕСНО-7 и вирус полиомиелита в смеси 3 иммунологических типов. В 2 пробох примененном набором типоспецифических сывороток типировать выделенные цитопатогенные агенты мы не смогли.
Таким образом, при использовании метода пенной флотации почти из половины исследованных проб речной воды были выделены цитопатогенные агенты. Следует учесть, что первичный объем пробы, из которого концентрировались энтеровирусы, составлял всего 100 мл. Выделение цитопатогенных энтеровирусов в таких случаях было возможным лишь при условии значительного загрязнения исследуемой речной воды. Полученные нами в экспериментальных и натурных условиях данные позволяют считать, что метод пенной флотации является перспективным в отношении выделения энтеровирусов из открытых водоемов при условии значительного увеличения первоначального объема пробы.
ЛИТЕРАТУРА
В о у 1 е s W. A., L i п с о 1 n R. Е., Appl. Microbiol., 1958, v. 6, p. 327.—D ognonA., Bull. Soc. Chim. biol., 1941, v. 23, p. 249,—H о p p e r S. N.. M с Co wen M. C., J. Am. Water Works. Ass., 1952, v. 44, p. 719.
Поступила 28/VI 1966 r.
Концентрация вируса полиомиелита методом пенной флотации
Титр вируса в lg ТЦД50/*л
в исходной воде
Повышение титра
1,2 2,70 1,50
0,7 2,36 1,66
0 1,36 1,36
0 1,50 1,50
0 2,20 2,20
0 1,70 1,70
0 2,04 2,04
0 1,50 1,50
0 1,36 1,36
0 2,04 2,04
Среднее повышение титра
1,68
