CC BY
57
УДК 617.713-089.843:612.014.462.5
Стадников А.А., Канюков В.Н., Трубина О.М., Подопригора Р.Н., Казеннов А.Н.
Оренбургский филиал ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова
Росмедтехнологии», г.Оренбург Е-mail: [email protected]
К ВОПРОСУ О КОНСЕРВАЦИИ ДОНОРСКОЙ РОГОВИЦЫ: СОВРЕМЕННЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОБОСНОВАНИЯ
По результатам консервации донорской роговицы в вакууме и в среде Борзенка-Мороз отмечалась хорошая структурная организация на сроках до 7 суток. Инкубированные в вакууме объекты на этапах культивирования сохраняли фибрилло- и цитоархитектонику. В ходе экспериментальной послойной кератопластики получены положительные гистологические результаты. По оценке апоптозной доминанты клеточных элементов роговицы прогнозируются биологические свойства эпителия и собственного вещества роговицы.
Ключевые слова: консервация, вакуум, апоптоз, кератопластика
Актуальность
В настоящее время в офтальмотрансплантологии наибольшее практическое значение имеет донорская роговица, обеспечивающая при многих заболеваниях восстановление зрения у пациентов. При высокой потребности в кератопластике возрастает необходимость в наличии достаточного количества качественного донорского материала, а, следовательно, в усовершенствовании методов его консервации (Каспаров А.А., Магден Ю., 2001; Heck E., Krachmer J.H., Mannis M.J. Holland E.J., 2005).
Цель работы изучить структурно-функциональные особенности изменения роговицы, консервированной в вакууме и в среде Борзенка-Мороз на светооптическом и ультраструк-турном уровне, а также с использованием им-муноцитохимических методик и культивирования in vivo (по Ф.М. Лазаренко, 1959).
Материал и методы
Для изучения особенностей гистоструктуры консервированной роговицы было использовано 56 препаратов роговицы свиньи (как наиболее близкой по структуре к человеческой), из которых 44 было консервировано оригинальным методом и 12 в среде Борзенка-Мороз. Сроки консервации варьировали в пределах 3, 7, 10, 30 суток.
Для культивирования по методу Ф.М. Лазаренко была использована роговица свиньи на стадии консервации 7 суток. Реципиентами служили 9 половозрелых кроликов - самцов породы Шиншилла массой 3,5-4,0 кг. 24 имплантата роговицы были консервированы в вакууме при гипотермии и 12 в среде Борзенка-Мороз. У
каждого животного было сформировано по 4 имплантата. Имплантаты экстирпировали на 3, 6, 10, 15 сутки.
Для определения трансплантабельности аллогенных донорских роговиц, консервированных в вакууме при гипотермии, были проведены экспериментально-морфологические исследования биологического результата приживления 12 послойных аллотрансплантатов у кроликов. Пересаженные роговицы были подвергнуты структурно-функциональному исследованию на 10, 30 сутки со дня пересадки.
Определение готовности к апоптозу тканевых элементов консервированной роговицы проводили по оценке экспрессии синтеза про- и антиапоптотических генов белков p53, bcl-2.
Результаты и обсуждения
Проведенные исследования показали, что характер гистологической организации свиньи оказался очень близким к таковой, свойственной человеку. На светооптическом уровне установлено, что донорская роговица свиньи состоит из следующих слоев: передний эпителий (многослойный, плоский, неороговевающий), передняя базальная мембрана Боумена, собственное вещество (substantia propria corneae), задняя базальная мембрана Десцемета и задний эпителий (эндотелий).
Помимо этого, при светооптическом изучении роговиц донора, приготовленных в условиях консервации в вакууме, либо в среде Бор-зенка-Мороз, было установлено следующее:
Оба способа консервации в основном не приводили к существенным изменениям тканевых и клеточных элементов роговицы с точки зрения их
повреждения. Вместе с тем, мы отметили локальное расслоение и частичное разрушение эпители-оцитов переднего эпителия (при консервации в вакууме) при хорошей сохранности собственного вещества роговицы, что подтверждено и электронно-микроскопическими данными.
При консервации в среде Борзенка-Мороз многослойный плоский эпителий не повреждается. Однако в межклеточном веществе нами были обнаружены овальные щели, залегающие между пластинками. Подобные структуры описываются в научной литературе как «соковые каналы».
Поскольку данных образований не было отмечено нами у донорского материала до консервации, следует предположить, что их появление в условиях наших исследований отражает возможность рекапитуляции структурной организации роговицы у млекопитающих, при ее использовании в экспериментальных условиях после консервации.
Исследования по оценке синтеза про- и ан-тиапоптотических генов белков p53, bcl-2 показали, что у эпителиальных и клеток фибробла-стического ряда роговицы (до консервации) имеет место проапоптотическая доминанта (в большей степени у клеток многослойного плоского ороговевающего эпителия). При этом соотношение между экспрессией синтеза анти-апоптотического белка bcl-2 к синтезу р53 было 2,1±0,01, а у фибробластов - 2,6±0,02. Эти данные свидетельствуют о гомеостатической регуляции нормального объема клеточной массы.
При консервации роговицы наблюдаются явления угнетенного синтеза обоих белков и изменения в соотношении экспрессии Ьс1-2/р53, которые утрачивают гомеостатический характер. Это свидетельствовало о нарушениях клеточных циклов как эпителиоцитов, так и фибробластов. Однако меньшая степень и выраженность подобных нарушений отмечена у эпителиальных клеток (консервация объектов в среде Борзенка-Мороз), и у клеток фибробласти-ческого ряда (при консервации в вакууме).
В условиях культивирования in vivo фрагментов донорских роговиц, консервированных указанными способами, мы получили сведения, свидетельствующие об иммунологической толерантности организма реципиента к имплантированным объектам (в наблюдаемые нами сроки опытов). Исходя из того факта, что одним из методов коррекции процесса
репаративной регенерации является предотвращение или уменьшение реакции биологической тканевой несовместимости на донорские ткани, подобные условия достигаются путем консервации, которая направлена на снижение процессов аутолиза, а также сохраняет структурные и пластические качества консервированного материала.
Электронно-микроскопические данные свидетельствуют о дезорганизации стромаль-ных компонентов роговицы, что подтверждается результатами гистохимических исследований (понижение содержания гликозаминогликанов и возрастание нейтральных фракций гликопротеидов).
Анализ гистологических препаратов показал, что при культивировании роговицы, консервированной в среде Борзенка-Мороз на стадии 610 суток, происходят деструктивные изменения с передним эпителием, нарастают явления отека и дискомплексации фибриллярных структур собственного вещества роговицы. При этом обнаруживаются полиморфноклеточные локальные инфильтраты в периваскулярных зонах.
В более поздние сроки культивирования (15 суток) на месте данных полиморфноклеточных инфильтратов формируются кистозные полости, расслаивающие соединительнотканные пластинки собственного вещества роговицы, что существенно нарушает прочностные качества материала.
Описанные изменения имплантированной роговицы можно объяснить активной ее васку-ляризацией с последующим развитием перивас-кулярных воспалительных процессов.
Культивирование фрагментов роговицы, консервированной в вакууме, не показало подобных процессов ее структурной реорганизации. При этом, особо важным, следует подчеркнуть морфологические признаки, характеризующие механические, ее прочностные характеристики.
С другой стороны следует отметить (особенно 6-10 сутки культивирования) активизацию клеток фибробластического ряда, последнее обстоятельство мы можем расценивать как факт, свидетельствующий о возможности ремоделирования (роговица, консервированная в условиях вакуума), которое возможно будет инициировать процессы репаративного гистогенеза соединительной ткани.
По результатам послойной пересадки роговицы консервированной в вакууме отмечали хорошую фиксацию в собственном веществе роговицы реципиента с формированием соединительнотканной капсулы, содержащей функционально-активные фибробласты. Постепенно новообразованная соединительная ткань приобретала фиброархитектонику, свойственную роговичным пластинкам.
Интракорнеальной фиксации трансплантата способствовали процессы миграции фиб-робластических клеток «ложа» между пучками коллагеновых волокон донорского материала с последующим фибриллогенезом.
Ультраструктурное изучение трансплантата показало хорошую его сохранность без признаков деструкции и дискомплексации клеточных элементов, волокон, аморфного матрикса.
Характер описанных морфологических процессов не зависел от сроков консервации,
что доказывало сохранение высоких пластических свойств донорских роговиц, консервированных при гипотермии в вакууме.
Выводы
1. На светооптическом и ультраструктур-ном уровне доказана хорошая сохранность роговицы, консервированной в вакууме.
2. Метод культивирования тканей in vivo (Ф.М. Лазаренко, 1959), оценка экспрессии про- и антиапоптотических генов белков p53, bcl-2 является эффективным для изучения потенциальных репаративных и индуцирующих возможностей донорских роговиц.
3. В условиях экспериментальной послойной кератопластики получены положительные гистологические и клинические результаты при использовании донорских роговиц, консервированных в вакууме.
14.10.2011
Список литературы:
1. Каспаров А.А., Магден Ю. Криокератопластика и кератопластика в лечении буллезной хронической кератопатии // Вестн. Офтальмологии. - 2001. - №2. - С. 8-10.
2. Лазаренко Ф.М. Закономерности роста и превращения тканей и органов в условиях культивирования их в организме. -М.: Медицина, 1959. - 400с.
3. Heck E. Structure and Function of Eye Banks // Krachmer J.H., Mannis M.J., Holland E.J. Cornea. Fundamentals, Diagnosis and Management, 2nd Edition. - Elsevier-Mosby, 2005. - Vol. 1. - P. 96-100.
UDC 617.713-089.843:612.014.462.5
Stadnikov A.A., Kanyukov V.N., Trubina O.M., Podoprigora R.N., Kazennov A.N.
TO THE QUESTION OF DONOR CORNEA PRESERVATION: INNOVATIVE TRENDS, EXPERIMENTAL AND MORPHOLOGICAL FOUNDATIONS
According to the results of donor cornea preservation in vacuum and in Borzenok-Moroz environment there was noticed good structural organization at the period of 7 days. Incubated in vacuum objects at the stages of cultivation kept fibrillo- and cytoarchitectonics. During experimental lamellar keratoplasty there were obtained positive histological results. Due to the evaluation of apoptosis dominant cell elements of cornea there forecasted biological features of epithelium and self cornea material.
Key words: preservation, vacuum, apoptosis, keratoplasty
Bibliography:
1. Kasparov A.A., Magden Yu. Cryokeratoplasty and keratoplasty in treatment of bullous chronic keratopathy // Vestn.Ophthalmology. - 2001. - No.2. - P. 8-10.
2. Lazarenko F.M. Regularities of growth and transformation of tissues and organs in conditions of their preservation in organism. - M.: Meditsina, 1959. - 400p.
3. Heck E. Structure and Function of Eye Banks // Krachmer J.H., Mannis M.J., Holland E.J. Cornea. Fundamentals, Diagnosis and Management, 2nd Edition. - Elsevier-Mosby, 2005. - Vol. 1. - P. 96-100.
