CC BY
79
Борзенок С.А.1, Ролик О.И.1, Онищенко Н.А.2, Комах Ю.А.1, Делекторская В.В.3, Шацких А.В.1
1ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Росмедтехнологии , Москва 2ФГУ «ФНЦ трансплантологии и ИО им. акад. В.И. Шумакова», Москва 3Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
E-mail: oktarin@mail.ru
ПРИМЕНЕНИЕ ГОМОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПЕПТИДОВ ПРИ СРЕДНЕСРОЧНОЙ КОНСЕРВАЦИИ ДОНОРСКИХ РОГОВИЦ В ГИПОТЕРМИЧЕСКОМ РЕЖИМЕ
Исследовано защитное действие тканеспецифических регуляторных пептидов на эндотелиальные клетки донорских роговиц в процессе гипотермической консервации. Проанализирована плотность эндотелиальных клеток, проведена электронная микроскопия. Установлено, что тканеспецифические регуляторные пептиды оказывают защитное действие на ультраструктурную архитектонику ЭК.
Ключевые слова: эндотелий роговицы, трансплантат роговицы, цитоплазматические пептиды, регуляторные пептиды, консервация роговицы.
Актуальность
Проблема трупного тканевого донорства и трансплантации роговицы является одним из наиболее сложных и актуальных аспектов офтальмологии [3, 5, 1, 15, 14].
Для прозрачного приживления сквозного трансплантата роговицы необходима максимальная сохранность жизнеспособности эндотелиальных клеток (ЭК), обеспечивающих нормальную гидратацию и прозрачность посредством осуществления ими транспортной и насосной функций [14]. ЭК роговицы являются высокодифференцированными и имеют нейро-глиальное происхождение [8, 7, 2, 13]. Так как ЭК не способны к митотической регенерации, при их значительной потере в посттрансплан-тационном периоде возникает сначала функциональная декомпенсация, затем необратимое помутнение трансплантата [14].
Выкраивание и фиксация роговичного трансплантата при сквозной и задней послойной кератопластиках сопровождаются потерей ЭК, в связи с чем исходная плотность эндотелиальных клеток (ПЭК) должна быть не менее 2800-3000 кл/мм2 [15].
Однако уже на этапе консервации в ЭК трупных донорских роговиц возникает ряд мор-фо-фунциональных перестроек, сопровождающихся десквамацией ЭК и снижением их жизнеспособности [12, 14].
В этой связи повышение жизнеспособности и стабилизация плотности ЭК трупных донорских роговиц на этапе их консервации является крайне важной и актуальной задачей [1].
Из анализа публикаций по проблеме культивирования и консервации донорских роговиц можно сделать вывод, что первостепенной задачей на сегодняшний день для средне-срочно-го хранения и последующего выполнения сквозной и задней послойной кератопластик является усовершенствование составов консервацион-ных сред для сохранения жизнеспособности и морфо-функциональной сохранности эндотелиальных клеток трансплантатов донорских роговиц, путем повышения биохимической устойчивости к гипотермическому стрессу и временному фактору [10].
Наибольший интерес в этой области вызывает добавление в культуральные среды и растворы для консервации различных биологически активных веществ [16, 17, 18].
В целях восстановления и поддержания структуры и функции ЭК трупных донорских роговиц в процессе их консервации значительный интерес могут представлять фармакологические препараты на основе регуляторных клеточных пептидов, полученные из тканей глаза. К таким препаратам нового поколения относятся Цитамины отечественного производства [4, 9] и тканевая панель препаратов NeyDIL импортного производства [6, 11]. К сожалению, отечественная фармакологическая промышленность не производит препаратов регуляторных пептидов с адресным действием к эндотелиальным клеткам роговицы. До настоящего времени единственным органотропным препаратом, полученным из регуляторных пептидов клеточной цитоплазмы эмбриональных роговых обо-
лочек промышленных животных, является препарат NeyDIL №.37 «Cornea», который выпускается немецкой фирмой «VitOrgan», имеющий Государственную регистрацию в Российской Федерации.
Данные о фармакологической защите трупных донорских роговиц с помощью гомологичных регуляторных пептидов на этапе консервации в литературе отсутствуют.
Цель
Изучить влияние тканеспецифических регуляторных пептидов на морфо-функциональ-ную сохранность клеток эндотелия трупной донорской роговицы в процессе консервации методами нормотермического органного культивирования и гипотермической консервации.
Материалы и методы
Для эксперимента были отобраны 20 донорских роговиц лиц зрелого трудоспособного возраста. Средний возраст доноров составил 32±4 лет. Время от смерти до консервации составляло не более 12 часов.
Использовался моноорганный препарат NeyDIL Nr.37, полученный из фетальных и ювенильных роговиц крупного рогатого скота и содержащий гомологичные клеточные пептиды роговицы в концентрации 100 мкг/мл.
В эксперимент вошли донорские роговицы, консервированные в гипотермических условиях при +4°С. Консервация трансплантатов донорских роговиц проводилась в среде Борзен-ка-Мороз.
Опытная группа состояла из 10 роговиц, консервированных в среде Борзенка-Мороз с добавлением в опытную среду пептидного препарата NeyDIL Nr.37. Контрольная группа состояла из 10 роговиц парных глаз от тех же доноров. Сроки консервации составили 3, 6, 9 суток, в эти же сроки проводился анализ морфометрических и ультраструктурных характеристик эндотелиальных клеток с помощью электронной сканирующей и трансмиссионной микроскопии.
Сканирующая микроскопия проводилась на растровом ионно-электронном микроскопе Quanta 200 3D (Голландия) с возможностью проведения исследований объектов в режиме естественной среды без применения глубокого вакуума, напыления и жесткой фиксации с по-
мощью альдегидов, что не нарушало архитектонику и морфометрию клеток.
Для трансмиссионного электронно-микроскопического исследования материал фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида по стандартной методике с последующей заливкой в эпоксидную смолу ЭПОН-812. Ультратонкие и полу-тонкие срезы готовили на ультрамикротоме LКВ-III (Швеция). Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкие срезы контрастировали насыщенным раствором уранила-цетата и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе^М 1200 ЕХ II (Япония).
Исследования ПЭК, площади, показателя гексагональности эндотелиальных клеток донорских роговиц, проводились неинвазивным способом с помощью компьютерного Кератоа-нализатора для Глазных банков Копап (Япония). Для подсчета плотности эндотелиальных клеток, а также для более полной оценки состояния эндотелиального пласта применялся инвертированный световой микроскоп 307 -143.003 Leitz Wetzlar GmbH (Германия) с цифровой камерой-окуляром DCM510 (Китай).
Результаты
Для ультраструктуры эндотелия роговицы в норме характерна богатая органеллами цитоплазма, содержащая большое количество митохондрий. Такое обильное содержание орга-нелл обеспечивает выполнение эндотелием энергозатратной помпальной функции, при нарушении которой роговица быстро набухает и мутнеет. Поэтому при анализе результатов электронной микроскопии в первую очередь обращали внимание на ультраструктурную сохранность митохондриального аппарата эндотелиальных клеток.
При трансмиссионной микроскопии на 3 сутки гипотермической консервации не было выявлено существенной разницы в ультраструк-турной архитектоники эндотелиальных клеток опытной и контрольной групп (Рис. 1 А, Б). Но на 6 сутки консервации в эндотелиальных клетках контрольной группы наряду с ультраструктурно сохраненными органеллами присутствуют митохондрии с совершенно прозрачным матриксом, кристы которых либо отсутствовали либо были фрагментированы (Рис. 1Г).
На 9 сутки консервации в эндотелиальных клетках опытной группы митохондрии имели
округлую форму, отмечался начинающейся отек митохондриальных мембран, кристы митохондрий были сохранены (Рис. 2А, Б), в то время как в контроле выявлены грубые ультраструк-турные изменения, цитоплазма фрагментирована, цитоплазматический матрикс просветлен, в нем видны многочисленные пузырьки различного размера практически полное отсутствие сохранных органелл, что является явным признаком аутолиза (Рис. 2В, Г).
При сканирующей ЭМ на 9 сутки в опыте отмечался полимегитизм, но клетки сохранили гексо- и пентогональность (Рис. 3А,Б) В контроле выявлено выраженное разрушение межклеточных взаимоотношений, уменьшение электронно-оптической плотности внутри клеток, свидетельствующее о деструкции цитоскелета и липидного слоя мембран, что не наблюдалось в опытной группе (Рис. 3В,Г).
Было проведено дополнительное электронно-микроскопическое исследования роговиц опытной и контрольной групп на 12 сутки консервации. И в опытной, и в контрольной группах были выявлены грубые ультраструктурные повреждения пласта эндотелия.
За 9 сут гипотермической консервации потеря ЭК в опытной группе составила 4,1%, в контрольной - 7,2%.
Площадь клеток в опыте увеличилась на 1,8%, в контроле на 2,9%, процент гексагональных клеток к 9 суткам в опыте снизился на всего 6,86%, а в контроле - на 28%.
Заключение
Выполненное исследование показало, что присутствие регуляторных клеточных пептидов в средах для гипотермической консервации донорской роговицы в процессе средне-срочной консервации, способствовало стабилизации ПЭК. При гипотермической консервации донорских роговиц человека (до 9 суток) с применением клеточных регуляторных пептидов роговицы, потеря эндотелиальных клеток была всего 4,1% и допустимо возможной для выполнения сквозной кератопластики по сравнению с роговицами контрольной группы, где потеря составила - 7,2%.
На основании анализа сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии можно сказать, что гомологичные клеточные пептиды оказали выраженное протективное действие как на липопротеидный слой клеточных
мембран, так и на ультраструктурную архитектонику органелл эндотелия донорских роговиц в процессе гипотермической консервации.
10.11.2011 3 сутки 6 сутки
Рисунок 1 9 сутки
Рисунок 3
Список литературы:
1. Борзенок С.А. Медико-технологические и методологические основы эффективной деятельности Глазных тканевых банков России в обеспечении операций по сквозной трансплантации роговицы // Дис. ... д-ра мед. наук. - М. - 2008. - С. 309.
2. Вит В.В. Строение зрительной системы человека.- Одесса: «АстроПринт», 2003. - 655 с.
3. Каспаров А.А., Ермаков Н.В., Раппопорт Ю.М. Эндотелий трансплантата донора после сквозной кератопластики // Вестн. офтальмол. - 1990. - т. 106. - № 5. - С. 12-16.
4. Максимов И.Б. Применение препарата ретиналамин в офтальмологии. // Пособие для врачей. СПб., 2005.-20с.
5. Мороз З.И., Тахчиди Х.П., Калинников Ю.Ю. и др. Современные аспекты кератопластики //Федоровские чтения -
2004. «Новые технологии в лечении заболеваний роговицы». - М., 2004. - С. 280-288.
6. Ролик И.С. Пептидотерапия: клиническое применение. - М.: РегБиоМед, 2010. -448 с.
7. Ронкина Т.И. Закономерности возрастных изменений эндотелия роговицы человека в норме и патологии, возможности активации пролиферации эндотелия и их назначение в офтальмологии: Дис. д-ра мед. наук в форме науч. доклада. - М., 1994. - 48 с.
8. Федоров С.Н., Ронкина Т.И., Явишева Т.М. Эндотелий роговицы человека. - М.: МНТК «Микрохирургия глаза», 1993.
- 126 с.
9. Хавинсон В.Х., Трофимова С.В. Пептидные биорегуляторы в офтальмологии. // СПб, 2003. - 44 с.
10. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Кирпатовский В.И. Фармакологическая защита трансплантата. - М.: Медицина, 1983.
- 232 с.
11. Heine H. Wissenschaftliche Grundlagen der Organtherapie. // Tie^rztliche Umschau.- 1996.51.- P.71-73.
12. Hsu J.K.W., Cavanagh H.D., Jester J.V. et al. Changes in corneal endothelial apical functional protein organization after corneal cold storage //Cornea. - 1999. - Vol. 18. - N 6. - P. 712-720
13. Hwang D.G. Proliferative Capacity of the Corneal Endothelium //V World Cornea Congress.- Washington, DC, 2005. - P. 16.
14. Krachmer J.H., Mannis M.J., Holland E.J. Cornea. Fundamentals, Diagnosis and Management: 2nd Edition. - Elsevier-Mosby,
2005. - Vol. 1. - 1409 p.
15. Melles G.R., Eggink F., Lander F. A surgical technique for posterior lamellar keratoplasty // Cornea. - 1998. - № 17. - P. 618-626.
16. Tripathi B.J., Kwait P.S., Tripathi R.C. Corneal growth factors: a new generation of ophthalmic pharmaceuticals //Cornea. -1992. - Vol. 9. - P. 2-9.
17. Vincent P. T. Hoppenreijs, Elisabeth Pels, Gijs FJ. M. Vrensen and W. Frits Treffers. Basic fibroblast growth factor stimulates corneal endothelial cell growth and endothelial wound healing of human corneas // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 1994. Vol.35.-№.3.-P.931-944.
18. Xin Gu, EunDuck P. Kay. Distribution and Putative Roles of Fibroblast Growth Factor-2 Isoforms in Corneal Endothelial Modulation// Invest Ophthalmol Vis Sci.- 1998. - Vol. 39.- №. 12.- Р. 2252-2258.
UDC 617.713
Borzenok S.A.1, Rolik O.I.1, Oniscenko N.A.2, Komakh Y.A.1,
Delektorskaya V.V.3, Shatskikh A.V.1
1The S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Moscow
2Academician V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Moscow
3N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
THE USE OF HOMOLOGOUS CELLULAR PEPTIDES DURING MEDIUM-TERM CORNEAL COLD STORAGE
There was studied the protective effects of homologous cellular peptides on corneal graft endothelium cells during the medium-term corneal cold storage. The analysis of endothelial cell density, scanning and transmission electronic microscopy were performed. Tissue-specific regulatory corneal peptides exhibited clear protective effect on ultra structure of grafts’ endothelial cells during the preservation.
Key words: cornea endothelium cells, corneal graft, cytoplasm peptides, regulatory peptides, cornea preservation.
