CC BY
66
УДК 617.7
Канюков В.Н., Стадников А.А., Трубина О.М., Подопригора Р.Н., Казеннов А.Н.
Оренбургский филиал ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова
Росмедтехнологии»
ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБОВ КОНСЕРВАЦИИ РОГОВИЦЫ НА ОСНОВЕ ПРИНЦИПОВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИСТОЛОГИИ
В данной статье изучены критерии оценки сохранности биологической целостности роговицы, консервируемой в вакууме и в среде Борзенка - Мороз, методами культивирования по Ф.М. Лазаренко и определения апоптоза (соотношение р 53/bcl-2). Результаты культивирования по Ф.М. Лазаренко свидетельствуют о сохранности биологической целостности роговицы в результате консервации в вакууме и в среде Борзенка - Мороз, а исследования на апоптоз показывают, что при консервации роговицы в вакууме преимущественно сохраняются фибробластические клетки, а в среде Борзенка - Мороз - эпителиальные.
Ключевые слова: консервация роговицы, фибробластические клетки, эпителиальные клетки
Актуальность
Проблема заготовки и консервации донорской роговицы продолжает оставаться актуальной (Каспаров А.А., Магден Ю., 2001). В этой связи необходимы создание и разработка новых способов консервации (Kwok L., 2005; Sato E.H., 2005). Сегодня по мере распространения методологии доказательной медицины признается, что правильность действий врача должна быть подтверждена доказательствами. В данном аспекте экспериментально-гистологический метод в настоящее время приобретает все большее значение, так как он позволяет доказательно установить всю совокупность морфологических изменений, наблюдаемых в тканях при разных условиях существования организма во всей динамике их превращений. Большую информационную нагрузку несут в себе такие операционные процедуры экспериментальной гистологии, как культивирование клеток и тканей in vivo, изучение явлений апоптоза. Восполнить дефицит знаний может экспериментально-гистологический метод культивирования тканей in vivo, разработанный видным отечественным гистологом, чл.-корр. АМН СССР, профессором Ф.М. Лазаренко (1959). В настоящее время в арсенале морфологов и клиницистов имеются достаточно убедительные лабораторные методики идентификации апоптоза, позволяющие провести иммуногистохимическую объективную оценку репаративных потенций различного генеза, а также установить прогрессию изменений клеточных и тканевых структур.
Цель исследования
Установить морфологические критерии оценки биологической целостности роговицы,
консервируемой в вакууме и в среде Борзенка -Мороз.
Материал и методы
Экспериментальные исследования проводились на 48 изолированных свиных роговицах. Из свежеэнуклеированного глаза после соответствующей обработки иссекался роговично-склеральный диск. В одном случае материал помещался в емкость для консервации. В емкости создавали разряжение воздуха 0,5 атм., и она хранилась в условиях бытового рефрижератора при температуре +2±4 оС (В.Н. Канюков, 2007). В другом случае роговично-склеральный диск хранился в среде Борзенка - Мороз. Сроки консервации составляли 3, 7, 10, 30 суток.
Для оценки гисто- и органотипических свойств трансплантатов были проведены экспериментально-гистологические исследования при культивировании in vivo по Ф.М. Лазаренко (1959). При культивировании была использована роговица в сроке консервации 7 суток. Были изучены имплантаты на стадии культивирования 3, 6, 10, 15 суток. Опыты проводились на 12 кроликах породы Schinschilla. Кроликам-реципиентам с соблюдением правил асептики под апоневроз передней брюшной мышцы производили имплантацию кусочков роговицы с целлоидиновым песочком (в пропорции 1:2), согласно рекомендациям Ф.М. Лазаренко. При этом у каждого животного было сформировано по 4 имплантата.
Оценку программированной клеточной гибели (ПКГ) и потенциальных регенераторных возможностей клеток роговиц, консервированных в различных условиях, осуществляли имму-ноцитохимическим методом идентификации
апоптоза. Оценивалось прогностическое значение уровня экспрессии биологических маркеров p53 (останавливает рост клеток и индуцирует апаптоз) и bcl-2 (антиапоптотический пептид).
Результаты и обсуждение
В условиях культивирования роговица, консервированная в вакууме, сохраняет свою гистоархитектонику. Данный факт в условиях асептического воспаления может свидетельствовать о вероятной иммунологической толерантности организма реципиента к трансплантируемым объектам. Это в свою очередь дает основание полагать, что вакуум как среда может подавлять антигенные свойства консервируемой роговицы.
Роговица, консервированная в среде Борзенка - Мороз, в условиях культивирования (3 суток) также сохраняла свою структурную организацию. При этом отмечалось расслаивание переднего эпителия лейкоцитами на уровне шиповатого слоя, а также его разрастания в собственное вещество роговицы. Собственное вещество роговицы отечно, наблюдались сосуды микроциркуляторного русла.
При исследовании имплантатов роговицы, консервированной в вакууме, отмечались меньшая отечность и лучшая сохранность фибриллярных структур стромальных компонентов роговицы.
Исследования имплантатов культивированной роговицы (консервированной в среде Борзенка - Мороз) на стадии 6-10 суток, проведенные на светооптическом уровне, выявили наличие деструктивных изменений переднего эпителия. При этом достоверно нарастали явления отека и дис-комплексации фибриллярных структур собственного вещества роговицы. В участках, где ранее отмечались сосуды микроциркуляторного русла, определялись полиморфноклеточные периваску-лярные локальные инфильтраты.
На месте полиморфноклеточных инфильтратов формировались кистозные полости, что отмечалось на более поздних стадиях культивирования (15-е сутки). Данные кистозные полости расслаивали строму роговицы, что нарушало прочностные качества трансплантационного материала. Подобную активную васкуля-ризацию с развитием периваскулярного воспалительного процесса можно наблюдать и in situ (т. е. в условиях кератитов, конъюнктивитов, в том числе и при пересадках).
Исследование имплантатов роговицы, консервированной в вакууме в те же сроки культивирования, не показало подобных изменений. При этом отмечались сохранность фибриллярных пластин собственного вещества роговицы, незначительный отек стромальных компонентов, сохранность десцеметовой мембраны вплоть до 15 суток культивирования. Данный факт свидетельствовал о механических, прочностных характеристиках роговицы, консервированной в вакууме.
В результате проведенных исследований отмечено, что у эпителиальных и фибробласти-ческих клеток роговицы имела место проапо-птотическая доминанта (в большей степени у клеток многослойного плоского ороговевающе-го эпителия). Было определено соотношение между экспрессией синтеза антиапоптотическо-го белка Ьс1-2 к синтезу р53: у эпителиальных клеток оно составляло - 2,1, а у фибробластов -2,6. Полученные данные в роговице до консервации свидетельствовали о гомеостатической регуляции нормального объема клеточной массы.
После консервации роговицы, как в вакууме, так и в среде Борзенка - Мороз, наблюдались явления угнетенного синтеза обоих белков. Изменения отмечались в соотношении экспрессии Ьс1-2/р53, которые утрачивали гомеостатический характер. Данные факторы свидетельствовали о серьезных нарушениях клеточных циклов в эпителиоцитах и фибробластах. Выраженность подобных нарушений в меньшей степени отмечалась у эпителиальных клеток роговицы, консервированной в среде Борзенка - Мороз, и у клеток фибробластического ряда роговицы, консервированной в вакууме.
Таким образом, данные, полученные в результате проведенных исследований, свидетельствовали о различной реакции клеток роговицы (переднего эпителия или фиброблас-тов). При этом совокупность факторов консервации не может рассматриваться только с позиций ингибиторов или индукторов апоптоза, о чем свидетельствовала тканеспецифичность синтеза р53 и Ьс1-2, указывающая на большую резистентность к условиям консервации у эпи-телиоцитов в среде Борзенка - Мороз, у фиб-робластов в вакууме.
Выводы
Исходя из полученных результатов, можно сделать следующие выводы:
1. Результаты культивирования по Ф.М. Лазаренко свидетельствуют о сохранности биологической целостности роговицы в результате консервации в вакууме и в среде Борзенка - Мороз.
2. Исследования на апоптоз показывают, что при консервации роговицы в вакууме преимуще-
ственно сохраняются фибробластические клетки, а в среде Борзенка - Мороз - эпителиальные.
3. Не сопоставляя два этих метода, можно сделать заключение, что данные способы по-разному отражаются на биологических свойствах роговицы, их гисто- и органотипических свойствах.
Список использованной литературы:
1. Каспаров А.А., Магден Ю. Криокератопластика и кератопластика в лечении буллезной хронической кератопатии // Вестн. офтальмологии. - 2001. - №2. - С. 8-10.
2. Лазаренко Ф.М. Закономерности роста и превращения тканей и органов в условиях культивирования их в организме. -М.: Медицина, 1959. - 400 с.
3. Пат. 2310327 РФ Способ консервации донорских тканей для офтальмохирургии: патент на изобретение / Канюков В.Н.; опубл. 20.11.2007.
4. Kwok L. Effect of Donor Age on Corneal Swelling // V World Cornea Congress: Program abstracts. - Washington, DC, 2005. - P. 16.
5. Sato E.H. Current Status of Corneal Storage // V World Cornea Congress: Program abstracts. - Washington, DC, 2005. - P. 16.
