К ВОПРОСУ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПЛЕНКООБРАЗНЫХ СТРУКТУР, ПОЛУЧАЕМЫХ В ПРОЦЕССЕ БИОКОНВЕРСИИ ОТХОДОВ ПТИЦЕПЕРЕРАБАТЫВАЮЩЕЙ ОТРАСЛИ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Л.Ю. Прудова, канд. техн. наук, и.о. доц. кафедры «Инженерная и компьютерная графика», ВСГТУ Т.Е. Данилова, канд. техн. наук, доц. кафедры «Биотехнология», ВСГТУ В.Ж. Цыренов, д-р биол.наук, проф., зав.кафедрой «Биотехнология», ВСГТУ У.Л. Мишигдоржийн, аспирант ВСГТУ

УДК 602.44 : 579.66

К ВОПРОСУ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПЛЕНКООБРАЗНЫХ СТРУКТУР, ПОЛУЧАЕМЫХ В ПРОЦЕССЕ БИОКОНВЕРСИИ ОТХОДОВ ПТИЦЕПЕРЕРАБАТЫВАЮЩЕЙ ОТРАСЛИ

В работе представлены результаты исследований по изучению пленкообразных структур (ПС), образующихся в процессе биоконверсии яичной скорлупы в высококислотных биологических жидкостях. Доказано, что образование ПС происходит без участия используемых культур микроорганизмов. Представлены гистохимические и микроскопические исследования поверхности ПС.

Ключевые слова: яичная скорлупа, биоконверсия, культуры микроорганизмов, пленкообразные структуры (ПС), подскорлупная оболочка (ПО), культуральная жидкость (КЖ)

L.Ju. Prudova, T.E. Danilova, V.Zh. Tsyrenov, U.L. Mishigdorjin

ON CHARACTERISTICS OF FILM-FORMING STRUCTURES OBTAINED IN IOCONVERSION PROCESS OF WASTE MATERIALS OF POULTRY-PROCESSING INDUSTRY

The work deals with the results of the research into film-forming structures (FFS) obtained in bioconversion process of the egg shell in high acid biological liquids. It has been proved, that film-forming structures are produced without involving microorganisms cultures used. Hystological and microscopic studies of film-forming structures surface are presented.

Key words: egg shell, bioconversion process, microorganisms cultures, film-forming structures (FFS), subshell membrane (SM), cultural liquid (CL).

Среди отходов птицеперерабатывающей отрасли значительные объемы составляет яичная скорлупа. Поскольку она формируется в живом организме, ее в полной мере можно отнести к сырью биогенного происхождения. Главным компонентом яичной скорлупы является кальций. Его можно перевести в растворимое состояние, обрабатывая скорлупу растворами кислот. При изучении биоконверсии яичной скорлупы в высоко кислотной биологической жидкости [1] обнаружено появление пленкообразных структур (ПС). При этом было отмечено, что их формирование наблюдалось в случае внесения цельной скорлупы (лома). По внешнему виду ПС напоминали подскорлупную оболочку (ПО), которую при подготовке яичной скорлупы к биодеградации, по возможности, тщательно удаляли.

Данная работа посвящена изучению ПС, получаемых в процессе биоконверсии яичной скорлупы, и установлению химической природы соединений, ее формирующих. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• провести микроскопические исследования поверхностей ПС и ПО;

• исследовать гистохимические препараты ПС и ПО;

• провести сравнительный анализ полученных результатов.

Материалы, объекты и методы исследования. В работе использовались следующие материалы:

• скорлупа от куриных яиц с удаленной ПО в цельном (лом) и измельченном (размер частиц не более 1 мм 2) виде;

• обезжиренное молоко кислотностью не более 190 Т, полученное из молока не ниже 1 сорта по ГОСТ 52054-2003;

• молочная сыворотка, полученная при производстве творога с титруемой кислотностью 55±50Т, пастеризованная перед применением;

• монокультура Lactobacterium acidophilum 20Т, приобретенная во ВНИИМП;

• ассоциация микроорганизмов, полученная на основании патента [2];

• природная ассоциация микроорганизмов - «Тибетский гриб» [3].

Объектами изучения являлись системы: "ферментированное обезжиренное молоко: яичная скорлупа", "ферментированная молочная сыворотка : яичная скорлупа", "растворы молочной кислоты : яичная скорлупа", "растворы уксусной кислоты : яичная скорлупа", ПО, ПС. В работе использовали общепринятые микробиологические [4], биохимические [5] и гистохимические[6,7] методы исследования. Изображения поверхности ПС и ПО получали на растровом электронном микроскопе 1ЕОЬ-18М-651ОЬУ в лаборатории электронной микроскопии и рентгеноспектрального микроанализа Центра Коллективного Пользования «Прогресс» ВСГТУ. При использовании гистохимических методов для изучения структуры и химического состава ПС и ПО, в зависимости от используемых методик, фиксацию проводили спиртом или формалином. Проводили цветные гистохимические реакции на следующие полимеры: гликоген, коллаген, липиды и мукополисахариды. В качестве контроля использовали натив-ную ПО. Фотографии гистохимических препаратов получали с помощью оптического микроскопа Био-лам ЛОМО Р11 и цифровой фотокамеры ЬеуепЬик С510.

Результаты и их обсуждение. Формирование скорлупы в организме кур происходит на последнем этапе образования цельного яйца. В скорлупе различают 2 слоя, так называемые сосочковый и губчатый. Между сосочковым слоем и подскорлупной оболочкой формируются фибриллярные нити, которые осуществляют прочную связь между этими структурами. Образование ПС на внутренней поверхности яичной скорлупы при внесении ее в ферментированное культурами микроорганизмов обезжиренное молоко возможно по одной из следующих причин:

• синтез ПС культурой микроорганизмов;

• отслаивание пронизывающего скорлупу тончайшего слоя подскорлупной оболочки в процессе вымывания из нее минеральной части;

• деление клеток животного происхождения, находящихся в скорлупе или подскорлупной оболочке;

• самосборка ПС на поверхности яичной скорлупы, выступающей в качестве матрицы.

В научной литературе имеется множество сведений о способностях микроорганизмов различных таксономических групп синтезировать экзогенно вещества, представляющие собой полимеры. Некоторые виды уксуснокислых бактерий (к примеру, Лсе1;оЬас1ег хуНпиш) способны образовывать внеклеточную слизистую пленку, состоящую из целлюлозы [8]. Целлюлозные фибриллы образуют рыхлую массу, обволакивающую клетки бактерий. Эта способность ярко проявляется и в ассоциациях. Одна или несколько групп микроорганизмов выделяют слизь, называемую «зооглея» (zoogloea), в которую включаются клетки других микроорганизмов ассоциации [3,9]. Образование «зооглея» носит приспособительный характер, так как благодаря его вязкой консистенции легко осуществляется адсорбция не только клеток, но также и питательных веществ из окружающей среды. В качестве примера можно привести такие ассоциации, как чайный гриб, молочный тибетский гриб, морской индийский рис и т.п. По оценкам специалистов, «зооглея» состоит из полисахаридов и азотистых веществ[3,9].

В эксперименте ПС образовывались в присутствии яичной скорлупы с удаленной подскорлупной оболочкой при определенных условиях ферментации обезжиренного молока ассоциацией микроорганизмов с кислотностью 300±400Т [2]. Формирование ПС на поверхности скорлупы наблюдалось и при ферментации (в тех же условиях) обезжиренного молока монокультурой Ьас1;оЬас1егшт ас1^рЫ1ит, входящей в состав данной ассоциации. Пределом кислотообразования в молоке монокультурой Ь. ас> ^рЫ1ит является 300 0Т [10], что в пересчете на концентрацию молочной кислоты в системе составляет 2,7±0,1%.

Тибетский гриб также способен синтезировать значительные количества кислоты, которая растворяет минеральную часть скорлупы. Культивирование тибетского гриба на обезжиренном молоке в присутствии яичной скорлупы также способствовало получению ПС. Поскольку образование ПС на поверхности скорлупы происходило независимо от микробиологического состава изучаемой системы, дальнейшие исследования проводили в условиях, исключающих жизнедеятельность микроорганизмов.

С целью инактивации жизнедеятельности микроорганизмов ферментированные среды перед внесением яичной скорлупы подвергали термической обработке. При этом замена обезжиренного молока на молочную сыворотку позволила исключить влияние основного белка молока - казеина на формирование ПС. На ферментированной разными микроорганизмами сыворотке, термически обработанной, имело место образование фрагментов ПС (табл.1). Следовательно, образование ПС не является резуль -татом микробиологического синтеза. Далее проведена апробация возможности роста ПС на модельных системах. В качестве источников углерода выбраны продукты жизнедеятельности используемых культур микроорганизмов - молочная и уксусная кислоты, для азотного питания введен аспарагин. Во всех

случаях получали ПС. Даже при экспонировании измельченной скорлупы в ферментированной L. acidophilus молочной сыворотке выявлено наличие тонких ПС, формирующихся в культуральной жидкости (КЖ). Только две экспозиции- "цельная скорлупа : раствор натрия двууглекислого" (рН=8), "цельная скорлупа: вода дистиллированная" (рН=7) давали отрицательный результат относительно образования ПС. В таблице 1 представлены результаты эксперимента по влиянию состава питательных сред на образование ПС.

Таблица 1

Влияние состава питательных сред на образование ПС

№ пробы Питательная среда Наблюдения Наличие ПС

1 10% раствор уксусной кислоты + 0,1% аспарагина Растворение минеральной части скорлупы, наличие на дне емкости ПС белого цвета ++

2 10% раствор молочной кислоты + 0,1% аспарагина Частичное растворение минеральной части скорлупы, формирование на остатках скорлупы ПС цвета КЖ ++

3 Сыворотка ферментированная Lactobac-terium acidophilus, термически обработанная Частичное растворение скорлупы, ПС (рыхлая) на поверхности КЖ, ПС внутри нерастворенной скорлупы +

4 Сыворотка ферментированная тибетским грибом, термически обработанная Частичное растворение скорлупы, ПС (рыхлая) на поверхности КЖ, ПС внутри нерастворенной скорлупы +

5 Сыворотка ферментированная Lactobac-terium acidophilus Частичное растворение минеральной части скорлупы, ПС (рыхлая) на поверхности КЖ ++

6 Сыворотка ферментированная тибетским грибом Частичное растворение минеральной части скорлупы, ПС (отдельные фрагменты) в толще КЖ, ПС (рыхлая) на поверхности КЖ ++

7 1,5%раствор молочной кислоты Наличие нерастворенной скорлупы с ПС цвета КЖ на внутренней поверхности ++

8 Фосфатно-цитратный буфер рН=6 Частичное растворение минеральной части скорлупы ПС внутри КЖ ++

9 Контроль: раствор натрия двууглекислого (рН=8) Без изменений -

10 Контроль: вода дистиллированная (рН=7) Без изменений -

Обозначения: "+"-наличие отдельных фрагментов ПС; "++"- ПС в виде сплошной пленки; "-" - отсутствие ПС на поверхности скорлупы и в КЖ

По окончании эксперимента ПС отмывали от питательной среды и высушивали при комнатной температуре. Сканирование поверхности образцов на растровом электронном микроскопе позволило выявить у всех полученных ПС нити, подобные фибриллам. Снимки поверхностей ПС (х1000), полученных на питательных средах различного состава, представлены на рисунке 1.

Сравнительный анализ изображений опытных образцов и изображений нативной ПО позволяет прийти к выводу об их идентичности. Исследуемые ПС, в отличие от нативных ПО, имеют значительное количество включений (структурных образований), напоминающих встроенные в фибриллярную сеть клетки. Возможно, в силу рыхлости структуры ПС наблюдается их лучшая экранизация. Анализ результатов эксперимента дает основание предположить, что при удалении ПО с поверхности скорлупы остаются фибриллярные нити, соединяющие ПО с ее сосочковым и губчатым слоями. Попадая в кислую среду, минеральные вещества растворяются, а вышеупомянутые слои остаются. Однако заметное утолщение и ресинтез ПС при близких к нейтральному значениях рН (проба №8), когда процесс растворения минеральной части скорлупы практически отсутствует, позволяет сделать предположение о несколько других механизмах образования ПС, чем простое вымывание минеральных компонентов из оставшихся слоев ПО.

ВЕЭ 20кУ WD14mm 5Э78 77Ра х1,000 — 10|лп

ЕЭвТи Эатр1е 0000 01 Арг2010

Ш

4 г* 4 , 1 ¥

ВЕЭ 20кУ У\Ю13тт Э578 76Ра х1,000 — Юмт

ЕвБТО 5атр!е 0000 01 Арг2010

ш

К V V

ВЕЭ 2бкУ \Л/013тггд -3581 76Ра х1,000 - / 10|лп

ЕЭЭТи 5атр1е 0000 01 Арг 2010

д е

Рис.1. Изображение поверхности пленкообразных структур (ПС), полученных на растровом электронном микроскопе ШОЬ-18М-651ОЬУ (*1000): а- проба №2; б-№3; в-№4; г-№5; д- №6 (номера проб соответствуют номерам образцов, представленных в табл.1); е- образец нативной подскорлупной оболочки

Проведена гистохимическая окраска ПС и ПО. При просмотре гистохимических препаратов ПС и ПО, окрашенных любым из используемых методов, также как при электронном микроскопировании, обнаружена упорядоченная структура в виде нитей, расположенных сетчатообразно. Выявлены включения неправильной формы (структурные образования), которые были также более выражены на препаратах ПС. Результаты окрашивания препаратов ПС и ПО представлены в таблице 2, фотографии (*900)-на рисунке 2.

у ; Н* У + т

А Г

. .Ы I

; ъШГа ,5

■Р -

'■■ ; I ¿Л/'-

■уш^тш ¿¡¡¿шШШкж

■■ к*

• 1* ч ",•;«. > •

I II

Рис. 2. Фотографии гистохимических препаратов, окрашенных шифф-йодной кислотой-ШИК-реакция (*900):

1-ПО; 11-ПС.

а

в

г

Выявление химической природы пленкообразных структур гистохимическими методами

№ Реакция Соединения, структуры Типичная окраска ПС ПО

Окраска на препарате Налич. со-ед. Окраска на препарате Налич. со-ед.

1. Реакция шифф-йодная кислота (ШИК) гликоген Темно- пурпурная, темно-вишневая Коричневые волокна, включения грязно-бордовые Светло- коричневые волокна -*[12]

2. Окраска суданом III липиды Интенсивно оранжевая Коричневый цвет волокон, включения-интенсивно-красные ± Не окрашивали Нет данных

3. Метод ван Гизона Коллаген Ярко-красная Буровато-красный цвет нитей (неравномерный), включения окрашены темнее, неравномерно ± Не окрашивали +*[11]

Мышечные и эластические волокна Буровато-красная или желто-зеленая ± +*[11]

ядра клеток темно-синие или темно-красные - Нет данных

4. Реакция с аль-циановым синим (по Стид-мену) Кислые мукопо-лисахариды Сине-зеленая Неравномерно-бордовая окраска волокон, темно-бордовая включений волокна светло- бордовые +*[12]

5. ядра клеток Темно-синяя или темно-красная ± не выявлены Нет данных

Обозначения: "±" - недостаточно специфическое окрашивание; "+" - наличие выявляемого соединения; "-" - отсутствие выявляемого соединения(структуры); *-из литературных источников.

Результаты идентификации соединений, лежащих в основе ПС, гистохимическими методами свидетельствуют об отсутствии в их составе гликогена, полисахаридов соединительной ткани - мукополи-сахаридов. В отношении липидов нельзя сказать однозначно. Наличие в составе ПС коллагена и кератина точно не установлено. По типу волокон, обнаруженных в ПС, их можно отнести к эластическим.

Известно, что ПО в своем составе содержит белок [11]. Однако нет единого мнения о ее строении - некоторые исследователи относят ее к кератиновой, другие — к овокератиновой (белок с пониженным содержанием цистеина), есть мнение о ней как о коллагеновой, а также о белковой части подобной белку хрящевой ткани. С полной уверенностью относительно белковой части можно сказать только то, что она состоит из структурных белков. В научной литературе приводится следующий химический состав ПО: 80% сухих веществ, из них доля органических соединений — 87,5%, минеральных — 12,5%. В состав органического вещества входят галактозамин, глюкозамин, сиаловые кислоты, глюкоза, манноза, фуко-за, сульфатированные мукополисахариды, гликопротеины. [12]. Известно, что комплексы протеоглика-новой природы представляют собой поливалентные анионы, способные связывать катионы, в том числе кальция [13].

Были проведены предварительные исследования химических свойств ПС, сравнительный анализ которых с ПО представлен в таблице 3.

Отмечено, что нативная ПО обладает высокой эластичностью при растирании, резании, устойчивостью к замораживанию, кислотному гидролизу, растворяется только при значениях рН=9^12, после высушивания становится хрупкой. Получаемые ПС также после высушивания становятся хрупкими, проявляют устойчивость к действию кислот, растворяются в растворах сильных щелочей.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать следующие выводы:

• образование пленкообразных структур (ПС) на внутренней поверхности скорлупы куриных яиц в высококислотных биологических жидкостях не является результатом микробиологического синтеза;

Растворимость пленкообразных структур (ПС) и подскорлупных оболочек (ПО)

Реагенты растворимость

ПС ПО

1. Вода дистиллированная, водопроводная - -

2. HCl, HNO3,H2SO4 (4%-ные растворы) - -

3. HCl, HNO3, H2SO4 (конц.) - -

4. №ОН,КОН (4%-ные растворы) - -

5. №ОН,КОН (10%-ные растворы) + +

6. №ОН,КОН (33%-ные растворы) + +

7. Спирт этиловый (96%) - -

Обозначения: "-" - не растворяется; "+"- растворяется.

• образование ПС происходит в питательных средах различного состава при рН<6;

• морфологическая картина поверхности пленкообразных структур ПС сходна с таковой под-скорлупной оболочки (ПО) куриных яиц и содержит нити, напоминающие фибриллы белков соединительной ткани, о чем свидетельствуют гистохимические и микроскопические исследования;

• в составе пленкообразных структур (ПС) отсутствует гликоген;

• ПС и ПО имеют ряд сходных физико-химических свойств (растворимость при значениях рН=9^12, устойчивость к замораживанию и т.д.);

• микроскопическая картина ПС отличается от ПО наличием структурных образований.

Библиография

1.Прудова Л.Ю. Разработка способа биологической утилизации отходов птицеперерабатывающей и молочной отраслей: Автореф. дис. ... канд. техн. наук. -Улан-Удэ, 1999. - 19 с.

2. Патент на изобретение RU №2147405, А 23 С 9/12, С12 N 1/20: Способ получения закваски для высококислотного продукта/ Прудова Л.Ю., Данилова Т.Е., Инешина Е.Г., Цыренов В.Ж., дата подачи заявки 13.04.1998, опубл. 20.04.2000 бюл.№11, приоритет от 13.04.1998.

3.http://www.fungo.ru/library/quotes/zoogley/gr_kot_nas_lech.html#l_sv_zoo

4.Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учеб.пособие/ Под ред. Н.С. Егорова. 3-е изд.,доп.и перераб.-М.: Изд-во МГУ, 1995. - С. 81-128.

5.Крусь Г.М., Шалыгина А.М., Волокитина З.В. Методы исследования молока и молочных продуктов. -М.: Колос,2000. - 368 с.

6. Луппа X. Основы гистохимии: Пер.с нем. И.Б. Бухвалова, Е.Д.Вальтер/ под ред.Н.Т.Райхлина - М.: Изд-во «Мир», 1980. - 342 с.

7.Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. -М.: Изд-во «Медици-на»,1982. - 304 с.

8.МишустинЕ.Н., ЕмцевВ.Т. Микробиология. - М.:Колос,1978. - С. 117.

9.http://ru.wikipedia.org/wiki/

10.Микробиологические основы молочного производства: Справочник/Л.А. Банникова, Н.С. Королева, В.Ф. Семенихина/ под ред. Я.И.Костина. - М.: Агропромиздат, 1987. - С. 17.

11.Выдрицкая И.В. Влияние ионного состава рациона на физиолого-биохиимческие показатели и качество скорлупы яиц кур-несушек: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1986. - 18 с.

12. Околелова Т.М. К вопросу о химическом составе подскорлупных оболочек яиц кур и его изменениях при инкубации // Науч. труды Омского сельхозинститута «Научные основы животноводства и птицеводства/ отв.ред.Г.П.Еремеев. Т. 152. - Омск, 1976. С. 82-86.

13.Биохимия/под ред.Е.С.Северина. - М.:Изд-во ГЭОТАР-МЕД-2002. - С.170.

Bibliography

1.Prudova LJu. Development of the way of biological recycling of waste materials of poultry-processing and dairy industry.- Abstr. of the dissert.cand. of sciences /technical/-Ulan-Ude, 1999-19 p-s.

2.Patent on the invention RU №2147405, А23 С9/12, С12 N1/20: The method of producing a starter for a high acid product /L.Ju.Prudova, T.E.Danilova, E.G.Ineshina, V.Zh.Tsyrenov, the date of application 13.04.1998, publ. 20.04.2000 bul.№11, priority from 13.04.1998

3.http://www.fungo.ru/library/quotes/zoogley/gr_kot_nas_lech.html#l_sv_zoo

4.Instruction to practical classes in microbiology: The textbook/ed.by N.S.Egorov- 3d edition, rev. ed.-Moscow State University Press- 1995-p.p.81-128.

5.Krus G.M., Shalygina A.M., Volokitina Z.V. Research methods of milk and dairy products- Moscow: Kolos, 2000-368p-s.

6.Luppa Kh. Fundamentals of hystology/ transl. from German I.B. Bukhvalov, E.D.Valter, ed.by N.T.Raikhlin.-Moscow: "Mir" Press-1980-342p.

7. Volkova O.V.,Eletskii Ju.^ Fundamentals of hystology and hystological equipment- Moscow: "Medicine" Press,1982-304 p-s.

8.Mishustin E.N., Emtsev V.T. Microbiology- Moscow: Kolos,1978- p. 117.

9.http://ru.wikipedia.org/wiki/

10.Microbiological fundamentals of dairy production: Reference book/ L.A. Bannikova, N.S. Koroleva, V.F. Semenikhina, ed. by Ja.I. Kostin.-M.: Agropromizsat-1987-p.17.

11.Vydritskaya I.V. Influence of ionic composition of the diet upon physiological and biochemical indices and the shell quality of egg-layers.- Abstr. of the dissert...cand. of sciences /biology/-Moscow, 1986-18 p-s.

12. Okolelova T.M. On chemical composition of subshell membrane of hen eggs and its changes during incuba-tion./Scientific proceedings of the Omsk agricultural institute fundamentals of cattle breeding and poultry farming. -ch.ed.G.P.Eremeev-V.152-Omsk,1976-p.p.82-86.

13.Biochemistry/ed.by E.S.Severin- Moscow: "GEOTAR-MED" Press, 2002-P.170