CC BY
0А.Т. Бубеев, канд. биол. наук, преп. кафедры «Биотехнология», ВСГТУ Т.Е. Данилова, канд. техн. наук, доц. кафедры «Биотехнология», ВСГТУ В.Ж. Цыренов, д-р биол. наук, проф., заслуженный деятель науки РФ и РБ, академик РИА, ВСГТУ
УДК 637.661:66.099.4:543.545
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ БИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ КРОВИ
Методом электрофореза исследовано состояние белков крови убойных животных при обработке ее высококислотной молочной сывороткой. Показано, что в результате автолитических процессов и воздействия молочной кислоты наблюдается денатурация белков крови.
Ключевые слова: биоконсервированная кровь убойных животных, молочная сыворотка, белки плазмы, Lactobacillus acidophilus 20Т.
A.T. Bubeev, Ph.D., T.E. Danilova, PhD, Associate Prof., V.G. Tsyrenov, Dr. of Biol.Sci, Prof.
ELECTROPHORESIS OF BIOCONSERVED BLOOD PROTEINS
The article describes electrophoresis method processing of blood proteins of slaughtered animals which is processed by highly acidic whey. It is shown that as a result of autolytic processes and effects of lactic acid the denaturation of blood proteins is observed.
Key words: bioconserved blood of slaughtered animals, whey, plasma proteins, Lactobacillus acidophilus 20T.
Одним из интенсивных путей расходования компонентов аминокислотного пула организма является синтез белков плазмы крови, принимающих участие в поддержании рН, вязкости, коллоидно-осмотического давления, уровня катионов крови, транспорте гормонов, липидов, жирных кислот, пигментов, жирорастворимых витаминов, свертывании крови, иммунных и других процессах.
Плазма крови содержит свыше 300 белков. Большинство белков плазмы - гликопротеины, количество углеводных компонентов в их составе варьирует от 1%, например, в альбуминах до 40% - а1-глобулинах. Белки плазмы содержат дисульфидные связи и небольшое количество свободных тиоловых (-SH) групп: предполагают, что это имеет большое значение для предотвращения денатурации белков в плазме, которая возможна вследствие высокого парциального давления кислорода.
Исследования белков плазмы организма, кроме специфической нозологической информации, дают определенное представление о состоянии белкового обмена в целом. Исследованию подлежат количественные и качественные характеристики белкового состава плазмы.
Концентрация белков плазмы определяется тремя основными факторами: скоростью синтеза, скоростью метаболизма и объемом жидкости, в котором распределены белки.
В настоящее время различными методами можно получить от 5 до 100 фракций белков плазмы [1].
С помощью электрофореза выделяют 6 стандартных фракций: альбумины и четыре фракции глобулинов (а1-, а2-, р1-, р2-, и у- ). Соотношение этих основных белковых фракций в сыворотке крови следующее (%): альбумин - 56-60, а1-глобулин - 4-5, а2-глобулины - 8, Р-глобулины - 12, фибриноген - 4, у- глобулины - 16 [2].
Каждая фракция содержит многочисленные индивидуальные белки, среди которых имеются белки как свертывающей, так и противосвертывающей систем.
Цель работы: исследование влияния компонентов молочной сыворотки на белковую систему биоконсервированной крови.
Задачи эксперимента:
1. Провести электрофоретические исследования динамики состояния биоконсервированной крови в динамике хранения.
2. Установить наличие изменений в белковой системе биоконсервированной крови.
3. Сделать сравнительный анализ протеинограмм молочной сыворотки, биоконсервированной и стабилизированной крови.
Объекты исследования: Кровь, стабилизированная фосфатами (КСФ), биоконсервированная кровь (БК), высококислотная молочная сыворотка (МС), полученная в результате ферментирования обезжиренного молока культурой Lactobacillus acidophilus.
Методы исследования: электрофоретические исследования проводили на автоматическом анализаторе крови и ее компонентов фирмы Согшау [3].
Результаты эксперимента. БК получали путем смешивания изъятой из кровеносных сосудов крови убойных животных с ферментированной сывороткой. Стабилизированную таким образом кровь хранили в течение 20 суток при температуре плюс 4 - плюс 60С. Результаты электрофоретических исследований белковой системы биоконсервированной крови представлены в таблице 1 и на рисунках 1-6.
Из таблицы 1 и рисунков 1,2,3,4,5 видно, что фракции альбуминов, а1-, а2-, р2-, у- глобулинов имеют тенденцию к уменьшению. В данном случае возможен протеолиз белков собственными ферментами. Вероятно, и молочная кислота оказывает определенное влияние на распределение белковых фракций.
В норме альбумин синтезируется в печени и его период полураспада составляет около 20 суток. Следовательно, постепенное уменьшение фракции альбуминов в изучаемой системе связано с отсутствием процессов пополнения их пула (процессов синтеза) и воздействием молочной кислоты, что существенно влияет на скорость их естественного распада.
Таблица 1
Изучение белковых фракций БК в процессе хранения при 4 - 6°С
Наименование фракции Содержание белковых фракций, г/л
МС КСФ БК, сроки хранения, сут
0 6 13 17 20
1 2 3 4 5 6 7 8
альбумины 1,25±0,21 5,6±0,55 12,36± 0,91 11,40± 1,10 3,51± 0,59* 2,78± 0,55* 0,02± 0,01*
агглобулины 0,52±0,020 0,08±0,01 5,61± 0,78 1,11± 0,18* 0,10± 0,02* 0,13± 0,02* 0,66± 0,07*
а2-глобулины 0,25±0,050 0,44±0,06 6,67± 0,32 1,79± 0,06* 11,7± 0,64* 0,65± 0,07* 0,29± 0,075*
в 1 -глобулины 0,38± 0,040 15,97±2,72 5,3± 1,05 2,02± 0,016* 14,2± 0,38* 29,2± 5,40* 38,13± 0,88*
в2-глобулины 1,07± 0,025 68,90±8,90 21,9± 3,89 2,36± 0,36* 1,27± 0,09* 1,56± 0,16* 1,10± 0,13*
у- глобулины 1,86±0,56 6,35±2,30 10,6± 10,36 9,66± 1,62 1,70± 0,25* 2,70± 0,09* 2,77± 0,29*
белок 5,3±0,18 97,40±11,12 62,1± 11,9 28,40± 1,50* 32,5± 2,90* 37,0± 1,17* 46,20± 1,80*
Обозначение: * - достоверно при р < 0,05
время, сут
♦ ал ьбумины |
Рис. 1. Изменения содержания альбуминов в БК в процессе хранения при 1 =4 - 6°С
Анализируя данные таблицы 1, можно обнаружить наличие в процессе хранения белковой системы БК локального увеличения а^глобулинов (рис. 3) и стабильного возрастания - Р^глобулинов (рис. 4). Вместе с тем параллельно наблюдается общая тенденция изменения фракций а1-, а2-глобулинов в сторону уменьшения.
Учитывая тот факт, что кровь в присутствии молочной сыворотки не свертывается, можно предположить образование комплексов между белками фракций а1-, а2-глобулинов, а именно а^ антитрипсином и а2-макроглобулином, с плазминогеном.
время, сут р ♦ a1-глобулины |
Рис. 2. Изменения содержания ai-глобулинов в БК в процессе хранения при t =4 - 6°С
Кроме того, известно, что в состав а1-глобулинов входят гаптоглобины, которые составляют 25% от всего их содержания. Эта группа белков плазмы крови связывает свободный гемоглобин с образованием комплексов. В живых организмах данный комплекс метаболизируется в ретикуло-эндотелиальной системе, что необходимо для предотвращения потерь железа и повреждения почек гемоглобином [1]. Следовательно, низкие уровни a1-глобулинов могут быть обусловлены также снижением в их составе гаптоглобинов, которые при гемолизе связывают гемоглобин. Наличие гемолиза в изучаемой системе обнаружено на 4-е сутки.
Резкое увеличение а2-глобулинов (рис. 3) на 13-е сутки хранения, возможно, связано и с автолизом клеток Lactobacillus acidophilus. Снижение клеток Lactobacillus acidophilus установлено на 5-е сутки.
время, сут
р ♦ а2-глобулины
Рис. 3. Изменения содержания а2-глобулинов в БК в процессе хранения при 1 =4-6°С
Как уже указывалось выше, в процессе хранения имеет место стабильное увеличение содержания только фракции р1 - глобулинов (рис. 4).
время, сут
р Ф в1-глобулины
Рис.4. Изменения содержания р1-глобулинов в БК в процессе хранения при t =4 - 6°С
К фракциям р1-глобулинов относятся трансферрин, гемопексин [4], которые характеризуют интенсивность процессов распада гемоглобина. Так, in vivo гемопексин ф-глобулин) связывает гем и предотвращает его выделение почками. Сродство гемопексина к гему значительно выше, чем у альбумина. Комплекс гем-гемопексин поступает из крови в печень, где освобождается Fe3+ для образования гемоглобина [1]. Трансферрин, связывая свободный гем, также поступает на деструкцию или ресинтез гемоглобина. То есть накопление и устойчивость гем - Р-глобулиновых комплексов также способствует вы -сокому уровню данной фракции (р1-глобулинов) к 20 суткам хранения БК.
Снижение фракции р2- глобулинов (рис. 5) согласуется с результатами проведенных исследований коагуляционной и фибринолитической систем БК [5], которые показали достоверное уменьшение содержания основного белка свертывания крови - фибриногена. Данный белок имеет заряд и молекулярную массу, позволяющие отнести его к фракциям р2- глобулинов.
время, сут
р Ф в2-глобулины
Рис. 5. Изменения содержания р2-глобулинов в БК в процессе хранения при 1=4-6°С
Наиболее значительная в количественном отношении фракция белков молочной сыворотки - это фракция иммуноглобулинов. Снижение исходного содержания у- глобулинов молочной сыворотки и БК в процессе хранения свидетельствует, вероятно, об их связывании с антигенными детерминантами клеток крови и последующей биодеградации комплексов (рис. 6).
время, сут
Рис. 6. Изменения содержания у -глобулинов в БК в процессе хранения при 1 =4 - 6°С
Таким образом, исследования электрофоретической подвижности белков БК показали следующие изменения белкового профиля: уменьшение альбуминов и большинства глобулиновых фракций, за исключением фракции Р1-глобулинов, которая претерпевает резкое избирательное увеличение.
Выводы
1. Определена динамика распределения общего белка биоконсервированной крови по отдельным белковым фракциям.
2. Установлено изменение профиля электрофореграмм биоконсервированной крови под действием компонентов высококислотной сыворотки.
3. Показано наличие процессов комплексообразования и денатурации белков биоконсервирован-ной крови.
Библиография
1. Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Завгородний И.В. Клиническая биохимия: учебное пособие для студентов медицинских вузов. — М.: Триада-Х, 2002. - 504 с.
2. Трансфузионная гематология / под ред. д.м.н., проф. В. Серафимова - Димитрова. - София: Медицина и физкультура, 1974. - 402с.
3. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). - М.: Наука, 1981. 288 с.
4. Медведев В.В., Волчек Ю.З. Клиническая лабораторная диагностика: Справочник для врачей. - СПб.: Гиппократ, 1995. - 532с.
5. Бубеев А.Т. Влияние молочной сыворотки на свертывающую систему крови убойных животных и разработка биотехнологического способа получения протопорфирина: Автореф. дис. на соиск. уч. ст. к.б.н., 03.00.23 -биотехнология: Улан-Удэ, 2006. 23 с.
Bibliography
1. Tsyganenko A.J., Zhukov V.I., Myasoedov V.V., Zavgorodny I.V. The clinical chemistry: textbook for medical students. - М.: Triada-X, 2002.-504 p.
2. Transfusion Hematology / edited by MD, Prof. Serafimova-Dimitrova V. - Sofia: Health and Physical Education, 1974. - 402 p.
3. Osterman L.A. Methods for studying proteins and nucleic acids: Electrophoresis and ultracentrifugation (Practical Handbook). Moscow: Nauka, 1981. 288 pp.
4. Medvedev V.V., Volchek Yu.Z. The clinical laboratory. Guide for Physicians. - St. Petersburg: Hippocrates, 1995. - 532 p.
5. BubeevA.T. The effect of whey on blood coagulation system of slaughtered animals and the development of bio-technological method of producing protoporphyrin. Dissertation for the PhD degree, 03.00/23 - "Biotechnology", Ulan-Ude, 2006. 23 p.
