CC BY
31
УДК 573.088.6
К ОБОСНОВАНИЮ ТЕПЛОВОГО РЕЖИМА В БИОРЕАКТОРЕ
В.В. Миронов, доктор технических наук
Всероссийский научно-исследовательский институт механизации животноводства E-mail: vniimzh@mail.ru
Аннотация. Техническим средством для реализации технологического процесса получения мяса in vitro как перспективного источника полноценного белка является биореактор. С целью обоснования рациональных режимов работы экспериментального образца биореактора рассмотрены тепловой и газовый режимы в камере роста биореактора на примере среднего слоя жидкой фазы с подводом теплоты со стороны обечайки камеры. Математический анализ баланса потоков теплоты жидкой фазы в камере роста биореактора позволил установить зависимость температуры от времени процесса при изменении конструктивных, режимных параметров биореактора и теплофизических, физико-химических свойств жидкой фазы. В результате численного моделирования для экспериментального образца биореактора получено текущее значение расхода теплоносителя 0,11210-3м3/с - дистиллированной воды с температурой 37,16оС, которое обеспечит стабильную требуемую температуру жидкой фазы в камере роста биореактора. Установлен диапазон рациональных значений диаметра отверстий барботера в камере смешивания, обеспечивающий равномерность насыщения жидкой фазы пузырьками газа и отсутствие струйного их течения. Проведено обобщение существующих результатов исследований по трехмерному (3D) культивированию мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток in vitro, приведены требуемые биологические параметры температуры жидкой фазы (37,0оС), концентрации СО2 (5%) в газовой фазе, периодичности смены среды (каждые четвертые сутки). Проведен сравнительный анализ требований кмат-риксам для культивирования опорозависимых клеток животных. Показана роль высокоскоростного центрифугирования матрикса с клетками в создании плотных межклеточных контактов. Ключевые слова: биореактор, in vitro, клетки, тепловой режим, смешивание, матрикс.
Животные ткани возможно выращивать в искусственных средах - процесс получения мяса in vitro, наиболее близко отвечающего важнейшим качественным показателям мяса говядины [1]. В основе данной технологии лежит способность стволовой клетки (СК) к самообновлению и дифференцировке в специализированные ткани [2, 3]. Разновидностью стволовых клеток являются мультипо-тентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК), которые способны дифференцироваться, в т.ч. в клетки мышечной ткани.
Техническим средством для реализации технологического процесса получения мяса in vitro является биореактор, назначение которого - создание оптимальных условий для жизнедеятельности культивируемых в нем клеток, а именно, обеспечение дыхания, подвод питания и отвод метаболитов путем обновления газовой и жидкой составляющих в биореакторе [4]. При этом нежелательно подвергать клетки механическому воздействию. С целью обоснования рациональных
режимов работы экспериментального образца биореактора для получения мяса in vitro как перспективного источника полноценного белка рассмотрены тепловой и газовый процессы в камере роста биореактора на примере среднего слоя жидкой фазы с подводом теплоты со стороны обечайки камеры.
Теплота от теплоносителя расходуется на потери во внешнюю среду и повышение температуры нагреваемой жидкой фазы в камере роста. Если выделить в жидкой фазе элементарный объем, то его тепловой режим будет определяться интенсивностью подвода теплоты и условиями потерь теплоты от этого элемента в окружающую среду.
Помещаемая в камеру жидкая фаза имеет определенные начальные параметры, такие как температура жидкой фазы ^ач, оС и плотность жидкой фазы рсм, кг/м3. Поток теплоты, выделяющейся в слой жидкой фазы от теплоносителя в единицу времени, равен Nb. Потоки теплоты, вышедшие из слоя за счет испарения влаги, конвекции, теплопередачи
в смежные слои и через изоляцию боковых сторон в окружающую среду в единицу времени, равны Ык, Ыт и Ыи соответственно. Потоком теплоты, выделяющейся и (или) поглощаемой клетками в результате жизнедеятельности, в силу его незначительности можно пренебречь.
Разница между этими величинами согласно закону сохранения энергии равна количеству теплоты, аккумулированной слоем жидкой фазы, т.е.
иь-и„-Мк-Мт-Ми=МсмСсм^ , (1)
где Мсм - масса воды в рубашке нагрева, кг; Ссм - теплоемкость воды, Дж/(кгоС); ^ -изменение температуры воды от времени .
Возникающие в слое тепловые потоки можно получить путем дифференцирования по времени количества теплоты, получаемой и расходуемой жидкой фазой за время т:
адк
м
йх йт йт йт ат 11смЬсмйт , (2) где Qb - количество теплоты от теплоносителя, Дж; Qw - потери теплоты на испарение влаги, Дж; Qk - потери теплоты за счет конвекции, Дж; Qm - потери теплоты за счет теплопередачи между смежными слоями, Дж; Qu - потери теплоты через изоляцию ограждающих элементов камеры роста, Дж.
Математический анализ баланса потоков теплоты (1) жидкой фазы в камере роста биореактора позволил установить зависимость температуры жидкой фазы в камере роста от времени процесса при изменении конструктивных, режимных параметров биореактора и теплофизических, физико-химических свойств жидкой фазы.
В результате численного моделирования для экспериментального образца биореактора получено текущее значение расхода теп-
3 3
лоносителя 0,112 10- м/с - дистиллированной воды с температурой 37,16оС, которое обеспечит стабильную температуру 37,0оС жидкой фазы плотностью 1020 кг/м3 в камере роста биореактора. Температура 37,0оС жидкой фазы и концентрация углекислого газа 5% в газовой фазе приняты для культивирования ММСК на основании результатов исследований ВНИИ экспериментальной ве-
теринарии им. ЯР. Коваленко [5]. Основным требованием к барботеру в камере смешивания является равномерность насыщения жидкой фазы пузырьками газа и образование пузырьков малого размера. Установлен диапазон рациональных значений диаметра отверстий барботера от 0,064 до 0,92 мм. Исходя из условия промышленной применимости биореактора, выбираем диаметр отверстий барботера D=0,3 мм. При данном диаметре отверстий образуются пузырьки сфериче-с к о й формы и не возникает струйное их течение. Энергия, затрачиваемая на микросмешение, реализуется в дроблении пузырей газа, увеличивая при этом удельную поверхность контакта фаз и объемный коэффициент массопередачи.
Данные режимные параметры процесса реализуются в разработанном биореакторе [6], отвечающем требованиям культивирования ММСК:
- созданные условия газового обмена, заполнения и смены жидкой фазы (ростовой среды) должны способствовать сохранению физических межклеточных связей, не допуская повреждений морфологической структуры клеток;
- необходимо обеспечить максимальное снабжение клеток питающими газами и удаление продуктов метаболизма из клеточного окружения, причем, вытеснение отработанных газов из газовой полости биореакторной емкости должно препятствовать накоплению токсичных газов - отходов дыхания клеток и оптимизировать аэрацию растущих клеток.
Культивирование ММСК ведется с использованием микроносителей [5, 7]. Мат-рикс (или матрица носитель) представляет собой синтетический или биологический комплекс для обеспечения механической прочности конструкции с заданными свойствами, трехмерного ориентирования нанесенной на него клеточной культуры. Основными критериями биологически совместимой матрицы для создания тканеинженерной конструкции должны быть: отсутствие цито-токсичности, поддержание адгезии, фиксации, дифференцировки, предотвращение де-дифференцировки помещенных на ее по-
Лоигпа! оГ УШТ^Н №1(29)-2018
29
верхность клеток, отсутствие воспалительной реакции на материал и иммунного ответа, достаточная механическая прочность в соответствии с назначением.
Отмечены недостатки искусственных матриксов [8]:
- ограниченность применения микроносителя одного типа для культивирования разных типов опорозависимых клеток животных;
- многие из микроносителей предназначены для однократного применения;
- поверхность микроносителя неоднородна как по размеру, так и по форме;
- размер микроносителя колеблется в широком диапазоне, т.е. дисперсия по данному параметру у микроносителя достаточна велика;
- стерилизация микроносителя не может осуществляться любым способом.
По мнению Кандаракова и др., микроноситель, представляющий собой полимерную поверхность, выполненную из природных полимеров клеточной стенки пыльцы, отвечает требованиям к микроносителям для культивирования опорозависимых клеток животных - нетоксичен, устойчив к физико-химическим и биологическим факторам, многократного применения, однородный по размеру и форме, с широким диапазоном методов стерилизации [8]. Показано, что традиционные методы роста клеток и манипуляции на двумерных (2D) поверхностях являются недостаточными для новых задач клеточной биологии и биохимии [9]. В трехмерной (3D) окружающей среде клетки образуют внутриклеточные структуры, сходные с тканью, в которой организуются межклеточные функции, включая быстрое увеличение и дифференцировку [5].
Достижения в области химии материалов, технологий изготовления и обработки материалов и биологии развития привели к созданию матриц трехмерной клеточной культуры, которые лучше представляют геометрию, химию и среду естественного внеклеточного матрикса [9]. Матриксы для трехмерного культивирования ММСК могут быть выполнены из различных полужидких,
твердых и порообразных материалов [10]: желатин, коллаген, альгинат натрия, спидро-ин и др. Показана возможность направленной дифференцировки ММСК в клетки хрящевой ткани при культивировании их в трехмерных твердых порообразных матрик-сах, представленных коллагеном 1-го типа в среде с индукторами хондрогенеза.
Важное значение в технологии in vitro играет процесс загрузки клеток в матрикс. Согласно Наставлениям по трехмерному культивированию мультипотентных мезенхим-ных стволовых клеток сельскохозяйственных животных in vitro метод динамического насыщения матриксов клетками позволяет достичь 60-процентную загруженность мат-рикса и дальнейшую пролиферацию ММСК [5]. Суть метода заключается в наслоении клеточной суспензии в концентрации 5х106 клеток на матрикс и инкубировании в течение 2 ч при постоянном помешивании на шейкере. Также исследованиями Савченко-вой И.П. и др. установлено, что при загрузке клеток в матрикс ключевым моментом является не столько максимальное насыщение матрикса клетками, сколько уплотнение клеток в матриксе [10]. Инкубирование клеточной суспензии с матриксом в течение 2 ч при непрерывном покачивании на шейкере позволило авторам добиться 72% загрузки мат-рикса клетками, а последующее высокоскоростное центрифугирование матрикса с клетками - создать плотные межклеточные контакты (pellet culture).
Согласно принятой технологической схеме, матриксы, насыщенные клетками, необходимо перенести в камеру роста биореактора. После этого камера роста должна быть осторожно по стенкам заполнена жидкой фазой (ростовой жидкостью) из камеры смешивания. Культивирование ММСК проводится со сменой среды на каждые четвертые сутки [5]. Таким образом, в результате проведенных исследований по обоснованию рациональных режимов работы экспериментального образца биореактора и обобщения существующих результатов исследований других авторов по трехмерному культивированию мультипотентных мезенхимальных
стволовых клеток in vitro получены новые знания о параметрах технологического процесса и режимах работы биореактора - нового технического средства для реализации технологического процесса получения мяса in vitro, как полноценного белка.
Задачей дальнейших исследований является определение эксплуатационно-технических показателей работы экспериментального образца биореактора, в т. ч. параметров температурного и газового режимов при непрерывной работе установки, а также стабильности поддержания заданных технологических параметров при нахождении мат-рикса в камере роста.
Литература:
1. Волкова И.М. Разработка технологии получения мяса in vitro и перспективы его использования: автореф. к.т.н. М., 2013. 24 с.
2. Дифференцировка мультипотентных мезензимных стромальных клеток костного мозга человека в клетках хрящевой ткани при культивировании их в трехмерных матриксах OPLA // Цитология. 2007. Т. 49.
3. Методические наставления по выделению мульти-потентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков / И.П. Савченкова и др. М., 2010.
4. Сравнительный анализ существующих изобретений установок для культивирования ММСК / Е.Б.Петров и др. // Вестник ВНИИМЖ. 2017. №4(28). С. 21-29.
5. Наставления по трехмерному культивированию ММСК с.-х. животных in vitro. М., 2014.
6. ЗИ №2017140751. Биореактор для получения мяса in vitro. Заяв. 22.11.17
7. Volkova I., Korovina D. Three-dimensional matrixes of natural and synthetic origin for cell biotechnology // Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. Vol. 51.
8. Пат. 2328527 РФ. Микроноситель для культивирования субстратзависимых клеток животных in vitro. Заяв. 30.10.06; Опубл. 10.07.08.
9. Lee J. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art // Tissue engineering. 2008. Vol. 14. Р. 61-86.
10. Отчет ВНИИЭВ за 2015 год. М., 2015. С. 25-28.
Literatura:
1. Volkova I.M. Razrabotka tekhnologii polucheniya my-asa in vitro i perspektivy ego ispol'zovaniya: avtoref. k.t. n. M., 2013. 24 s.
2. Differencirovka mul'tipotentnyh mezenzimnyh stroma-l'nyh kletok kostnogo mozga cheloveka v kletkah hryash-chevoj tkani pri kul'tivirovanii ih v trekh-mernyh matrik-sah OPLA // Citologiya. 2007. T. 49.
3. Metodicheskie nastavleniya po vydeleniyu mul'tipo-tentnyh mezenhimnyh stvolovyh kletok iz tkanej vzroslyh osobej mlekopitayushchih, izucheniyu ih svojstv i prizna-kov / I.P. Savchenkova i dr. M., 2010.
4. Sravnitel'nyj analiz sushchestvuyushchih izobretenij ustanovok dlya kul'tivirovaniya MMSK / E.B.Petrov i dr. // Vestnik VNIIMZH. 2017. №4(28). S. 21-29.
5. Nastavleniya po trekhmernomu kul'tivirovaniyu MMSK s.-h. zhivotnyh in vitro. M., 2014.
6. ZI №2017140751. Bioreaktor dlya polucheniya myasa in vitro. Zayav. 22.11.17
7. Volkova I., Korovina D. Three-dimensional matrixes of natural and synthetic origin for cell biotechnology // Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. Vol. 51.
8. Pat. 2328527 RF. Mikronositel' dlya kul'tivirovaniya substratzavisimyh kletok zhivotnyh in vitro. Zayav. 30.10.06; Opubl. 10.07.08.
9. Lee J. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art // Tissue engineering. 2008. Vol. 14. R. 61-86.
10. Otchet VNIIEHV za 2015 god. M., 2015. S. 25-28.
THE JUSTIFICATION OF BIOREACTOR'S THERMAL REGIME V.V. Mironov, doctor of technical sciences All-Russian research institute of livestock mechanization
Abstract. The technical tool for cultured meat as high-grade protein perspective source's technological process's production in vitro realization is bioreactor. In order to justify the rational operation regimes of the experimental bioreactor's sample, the bioreactor's thermal and gas regimes in the growth chamber are considered on the liquid phase middle layer's example with heat supply from the chamber's cylinder. Mathematical analysis of the liquid phase heat flow balance in the bioreactor's growth chamber made it possible to determine the temperature's depen -dence on time of process at design, regime bioreactor's parameters changing, and thermophysical, physico-chemical properties of the liquid phase. As a result of numerical modeling for the bioreactor's experimental sample it is received of the heat carrier current value exactly 0,112*10-3 m3/s of distilled water at 37,16°C of temperature, that will provide a liquid phase's stable desired temperature in the bioreactor's growing chamber. It is established in the mixing chamber a bubbler's holes diameter's rational values range, that ensures the liquid phase saturation uniformity with gas bubbles and its jet flow's absence. The generalization of the existing research results on the three -dimensional (3D) of multipotent mesenchymal stem cells' in vitro cultivation, the liquid phase's required biological parameters of temperature (37,0°C), CO2 concentration (5%) in the gas phase, the medium change periodicity of the (every fourth day) is given. A comparative analysis of the matrices' requirements for the adhesiodependent an i-mal cells' cultivation. The role of high-speed matrix with cells centrifugation at the intercellular dense contacts creation is shown.
Keywords: bioreactor, in vitro, cells, thermal regime, mixing, matrix.
Journal of VNIIMZH №1(29)-2018
31
