CC BY
75
УДК 573.6:636
РАЗРАБОТКА БИОРЕАКТОРА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КУЛЬТУРАЛЬНОГО МЯСА
Ю.А. Иванов, член-корреспондент РАН, директор Е.Б. Петров, кандидат с.-х. наук, заведующий отделом
Всероссийский научно-исследовательский институт механизации животноводства E-mail: vniimzh@mail.ru
Аннотация. Рассмотрены вопросы новой технологии получения полноценного животного белка in vitro в биореакторе на микроносителях. Цель данных исследований заключается в создании технологии культивирования мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота (ММСК КРС) in vitro в биореакторе. В данных исследованиях использована система с микроносителями, которая позволяет сочетать положительные стороны монослойного и суспензионного культивирования. В исследованиях изучали процесс 3D культивирования ММСК КРС, который протекает в сложных многофазных системах: газ ^ жидкость ^ твердое тело. Проведен анализ конструктивных особенностей имеющихся биореакторов и предложен новый двухкамерный биореактор с гораздо более щадящим культивируемый биоматериал принципом работы. Разработана математическая модель роста плотности биомассы стволовых клеток, пригодная для различных видов биореакторов и различных типов носителей, на которых происходит наращивание биомассы. Создан пакет прикладных программ с начальным интерфейсом для компьютеров, который позволяет просчитать с учетом ряда параметров рост количества клеток ММСК КРС до объема, необходимого для дальнейшего получения биомассы на очередных этапах процесса культивирования in vitro клеточных культур.
Ключевые слова: биореактор, производство in vitro, культуральное мясо, биотехнологические разработки, микроносители, биомасса клеток мышечной ткани сельскохозяйственных животных.
Ведение. Технология выращивания куль-турального мяса в настоящее время разрабатывается в научных центрах Голландии, Австрии, США, Канаде, Китае. В России по данному направлению исследования проводятся с использованием мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота (ММСК КРС), которые выделены из костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖТ) КРС.
Цель исследования. На сегодняшний день методами клеточной биотехнологии получена биомасса, состоящая из клеток мышечной ткани, выращенных путем направленной миодифференцировки ММСК КРС in vitro [1-4]. Метод включает в себя поверхностное культивирование клеточной культуры. Недостатком метода является необходимость больших площадей для выращивания и затрат труда.
Цель данных исследований заключается в создании новой технологии культивирования ММСК КРС in vitro и разработке техниче-
ского средства - биореактора для производства биомассы клеток мышечной ткани сельскохозяйственных животных.
Объекты и методика исследования. В качестве объектов исследования проанализированы конструктивные технико-технологические характеристики существующих биореакторов, процесс роста плотности биомассы ММСК КРС на поверхностных и сферических носителях, особенности роста ММСК КРС применительно к условиям в биореакторе и процесс 3D культивирования стволовых клеток (СК) в многофазных системах: газ ^ жидкость ^ твердое тело.
Методы исследования - наблюдение, сбор экспериментальных данных, разработка математической модели, использование современных пакетов программ для компьютера. Компьютерная платформа, используемая в расчетах, основана на объектно-ориентированном языке Python, часто применяемом в научных математических расчетах с включениями фрагментов и модулей на языке про-
Journal of VNIIMZH №1(21)-2016
3
граммирования Си, позволяющих повысить быстродействие до необходимого уровня.
Результаты и обсуждение. Получение культурального мяса актуально из-за доступности биологического материала - КМ, ЖТ и периферической крови сельскохозяйственных животных, из которых можно выделить клетки со свойствами и признаками ММСК. Единократный забор биологического материала позволяет в дальнейшем организовать технологию с замкнутым циклом для получения культурального мяса, выращенного методом «in vitro».
Определение рациональных параметров процесса получения культурального мяса проведено на разработанной математической модели роста плотности биомассы стволовых клеток (исходный материал), которая пригодна для различных видов биореакторов и различных типов носителей, на которых происходит наращивание биомассы. Условия и уравнения для модели опираются на предположения, основанные на экспериментальных данных по культивированию in vitro биомассы клеток мышечной ткани из ММСК КРС [5]. Созданный пакет прикладных программ с начальным интерфейсом для компьютеров позволяет просчитать с учетом ряда параметров рост количества клеток ММСК КРС до объема, необходимого для дальнейшего получения биомассы на очередных этапах процесса культивирования.
Блок программ по расчету количества клеток ММСК предъявляет следующие минимальные требования к компьютеру: ОС Window XP, 7, 8, Linux, FreeBSD 8.0, ОЗУ 500 Мб, достаточное место на жестком диске для установки Python 2.7 и необходимых модулей (по минимуму от 100 Мб). Работа программы проходит в интерактивном режиме, запрашиваются необходимые для расчета параметры, которые пользователь программы вводит по запросу. Например, для вычисления массы выращенных клеток ММСК КРС вводятся параметры запросов, указанные ниже на скриншоте (рис. 1).
Пользователь может выбрать оконный режим и вводить данные сразу, как это видно из следующего скриншота (рис. 2).
Отдел биотехнологий ВНИИГЕК Расчет наращиваемой массы ИИСК первый этап технологического процесса
Введите рздиус сферического носителя (м) : Введите диаметр клетки (м):
Введите радиус круга посева, он меньше радиуса носителя (м). Введите режим посева (целое число центров посева): Введите число клеточных циклов: Введите плотность монослоя:
Биомасса после укапанного числа циклов деления составляет:
Рис. 1. Расчет наращиваемой биомассы ММСК КРС
| VNIIMG, Biotechnology Department
Flie Help
VNIIMG, Biotechnology Department
im рии p.
Sum put в
КШШ
impute p
Run Operation for M
Рис. 2. Ввод данных в расчет наращиваемой биомассы ММСК КРС
Описание отдельных параметров и шагов работы с программой дается в окнах стандартного выпадающего меню окна Help, также имеются поясняющие скриншоты программы.
Нами проведен анализ конструктивных особенностей биореакторов, и на основе существующих конструктивных видов биореакторов (таблица) разработаны конструктивные технико-технологические характеристики экспериментального биореактора, опирающиеся на требования к параметрам технологического процесса смешивания в биореакторе культуральной среды с объемными носителями (матриксами).
Таблица. Основные конструктивные виды биореакторов
По способу использования Одноразовые Х
Многоразовые
« Без перемешивания Х
о £ а Эрлифтные с внутренней циркуляцией
с внешней циркуляцией
О Ч & ^ я X По способу С перемешиванием Барботажные
перемешивания Газо-вихревые
ю а ч я Механические Пневматические
м ^ Э 2 Циркулярные Х
£ н а Непрерывные
Л ^ Я « « Я « « По способу массо- и энергообмена клеток со средой Глубинные Полного Полунепрерывные или объемно -доливочные Х
ь & И « ^ о & £ перемешивания Периодические
Многоциклические
а « £ В Полного вытеснения Турбулярные
¡а Й Поверхностные
* ^ « 3 2 5 По способу культивирования Закрытые (накопительное культивирование)
Открытые Турбодистаты
Я ч о с: Хемостаты Х
К газовой фазе
По способу подвода энергии К жидкой фазе
Комбинированные Х
Из таблицы видно, что в настоящее время разработано значительное количество способов обеспечения контакта газа с жидкостью (барботажный, газлифтный, механическое перемешивание, струйный и др.). Однако имеющиеся биореакторы с интенсивным перемешиванием, которые позволяют успешно культивировать бактерии, грибы и другие клеточные образования, не в полной мере подходят для существенно более «нежных» стволовых клеток. Причина существующих проблем носит принципиальный характер, связанный с тем фактом, что в существующих биореакторах среда перемешивается вместе с культивируемым биоматериалом.
Основываясь на биологических особенностях стволовых клеток, а именно, их повышенную травмируемость, отсутствующую у других видов культивируемых клеточных культур и микроорганизмов, а также особенностях их роста на матриксах, сделан вывод о возможностях создания биореактора экспериментального образца без перемешивания во время культивирования клеток. В частности, биологические исследования [6] позволили сделать вывод о возможности выращивания ММСК КРС на матриксах без перемешивания, позволяющее избежать гидро-
ударов, кавитации, высокотурбулентных и застойных зон. Так, ранее были созданы кусочки хрящевой ткани, полученные в результате культивирования ММСК в трехмерных носителях, представленных ОРЬЛ в индукционной среде в течение 30 суток в «мини биореакторе», который представлял собой коническую пробирку.
В разработанном во ВНИИМЖе двухкамерном экспериментальном биореакторе среда готовится отдельно, увеличение биомассы происходит в неподвижном слое, и таким образом в биореактор можно вносить посевной материал очень низкой плотности. Необходимое количество и объем прекуль-туры существенно снижается. В результате, упрощаются технологические процессы, существенно снижается количество ручных операций и сопутствующие затраты.
При разработке биореактора учтена его возможная универсальность, поэтому биореактор может работать в двух режимах, без перемешивания в камере роста, когда достаточно одной диффузии, и с перемешиванием, помогающим процессам диффузии равномерно распределять компоненты среды.
Роль камеры перемешивания может выполнять любая камера существующих био-
Лоигпа! оГ VNIIMZH №1(21)-2016
5
реакторов для клеточных технологий, причем к параметрам перемешивания в данном случае не предъявляются требования, связанные с необходимостью наличия биообъектов в среде.
Выводы. Предложен двухкамерный биореактор, позволяющий избежать гидроударов, кавитации, высокотурбулентных и застойных зон. Разработан принцип функционирования двухкамерного биореактора и создана принципиальная схема. В настоящее время проводится расчет динамических параметров смешивания и подачи культураль-ной среды в камеру роста и на основе модели расчета нарастания плотности биомассы проводится расчет рационального объема камер экспериментального биореактора.
Литература:
1. Пат. 2314719 РФ. Способ получения мясного продукта / Рогов И.А. и др. Заяв. 06.06.06; Бюл. №2.
2. Мясо in vitro как перспективный источник полноценного белка / И.А. Рогов и др. // Всё о мясе. 2013. №4. С. 22-25.
3. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота, в клетки мышечной ткани in vitro / И.А. Рогов и др. // Сельскохозяйственная биология. 2012. №6. С. 66-72.
4. Способ выращивания мяса in vitro / Рогов И.А. и др. // Биозащита и биобезопасность. 2012. №3. С. 26-32.
5. Перспективы использования стволовых клеток сельскохозяйственных животных в АПК / Рогов И.А., Волкова И.М., Иванов Ю.А. и др. // Биотехнология. Взгляд в будущее: Мат. 3-й Межд. науч. конф. Казань, 2014. Т. 1.
6. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека в клетки хрящевой ткани при культивировании их в трехмерных матриксах, представленных биополимером OPLA in vitro / Тепляшин А.С. и др. // Цитология. 2007. Т. 49. №7. С. 544-552.
Literatura:
1. Pat. 2314719 RF. Sposob polucheniya myasnogo pro-dukta / Rogov I.A. i dr. Zayav. 06.06.06; Byul. №2.
2. Myaso in vitro kak perspektivnyj istochnik polno-cennogo belka / I.A. Rogov i dr. // Vsyo o myase. 2013. №4. S. 22-25.
3. Differencirovka mul'tipotentnyh mezenhimnyh stvolo-vyh kletok, vydelennyh iz kostnogo mozga i zhirovoj tkani krupnogo rogatogo skota, v kletki myshechnoj tkani in vitro / I.A. Rogov i dr. // Sel'skohozyajstvennaya bi-ologiya. 2012. №6. S. 66-72.
4. Sposob vyrashchivaniya myasa in vitro / Rogov I.A. i dr. // Biozashchita i biobezopasnost'. 2012. №3. S. 26-32.
5. Perspektivy ispol'zovaniya stvolovyh kletok sel'skoho-zyajstvennyh zhivotnyh v APK / Rogov I.A., Volkova I.M., Ivanov YU.A. i dr. // Biotekhnologiya. Vzglyad v budushchee: Mat. 3-j Mezhd. nauch. konf. Kazan', 2014. T. 1.
6. Differencirovka mul'tipotentnyh mezenhimnyh stro-mal'nyh kletok kostnogo mozga cheloveka v kletki hrya-shchevoj tkani pri kul'tivirovanii ih v trekhmernyh matrik-sah, predstavlennyh biopolimerom OPLA in vitro / Tep-lyashin A.S. i dr. // Citologiya. 2007. T. 49. №7. S. 544552.
THE BIOREACTOR FOR CULTURED MEAT MAKING'S DEVELOPMENT Y.A. Ivanov, RAN member-corresponding, director
E.B. Petrov, candidate of agricultural sciences, biotechnology department head All-Russian research Institute animal husbandry mechanization
Abstract. New technology's issues of the full-valued animal protein in vitro in a bioreactor on the bead using are shown. The aim of this research is to create a technology of multipotent mesenchymal stem cells of cattle (MMSS KRS) cultivation in vitro in a bioreactor. The given studies are used a system with the bead, which allows to combine the positive aspects of monolayer and suspension cultivation. The research studied the process of 3D cultivation of cattle MMSC, which flows in complex multiphase systems: gas ^ liquid ^ solid. The analysis of design features of existing bioreactors is conducted and a new dual-chambers' bioreactor with cultured biomaterial much more gentle processing's principle is proposed. A mathematical model of stem cells biomass density's growth is developed, that is suitable for different kinds of bioreactors and media on which the biomass growth is occurred. The package of applied software with an computers initial interface that allows to calculate with a number of parameters using the increase in the number of cattle MSC cells till the bulk that is necessary for further biomass getting at the recurrent stages of the process MSC cultivation in vitro is created. Keywords: bioreactor, in vitro production, cultured meat, biotechnological developments, the bead, the farm animals muscle cells tissue biomass.
