CC BY
19
Методы исследования
УДК ei5.ei.01S.36.074
Б. М. Штабский, М. И. Гжегоцкий, М. Р. Гжегоцкий, В. И. Кудрина, Л. /(. Маненко, В. И. Федоренко
К МЕТОДИКЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СРЕДНЕСМЕРТЕЛЬНЫХ ДОЗ И КОНЦЕНТРАЦИЙ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Львовский медицинский институт
В данной работе предлагаются некоторые методические приемы, упрощающие определение сред-несмертельных доз (ЬО40) или концентраций (ЬК60) химических веществ.
Экспериментальное определение ЬЭ«, слагается из двух опытов — ориентировочного и развернутого. Первый обязателен в любом случае: в нем на небольшом числе животных получают необходимую предварительную информацию о диапазоне доз, близких к среднесмертельной. Далее в развернутом опыте испытывают пять или более различных доз (каждую не менее чем на 6 животных) при ус-6 ловии, что крайние дозы выступают как ЬО0 и ЬО100. Последующую оценку ЬБ60 осуществляют на основе пробит-анализа кривых летальности одним из графических методов по Миллеру — Тей-нтеру, Литчфильду — Уилкоксону (М. Л. Беленький) либо расчетом по В. Б. Прозоровскому.
Покажем, что объективно пробит-анализ излишен, а для оценки ЬО50 требуется испытание не более трех разных доз.
Эмпирически установлено, что в диапазоне доз ЬО0 —ЬО100 график зависимости частоты летального исхода (в процентах) от дозы имеет вид Б-об-разной кривой. По Миллеру — Тейнтеру, Литчфильду — Уилкоксону и др., кривая имеет пра-* вую асимметрию, исчезающую при логарифмировании доз. По В. Б. Прозоровскому, наоборот, логарифмирование доз приводит к появлению асимметрии (левой), в силу чего графики строятся в арифметической шкале. Конечные результаты в обоих случаях практически совпадают, поэтому к логарифмированию доз можно не прибегать.
Сущность пробит-анализа сводится к спрямлению симметричной кривой на основе ее сходства с кривой нормального распределения путем выражения доз в единицах среднего квадратического отклонения (а), причем число таких единиц увеличивают для удобства на 5, получая соответствующие пробиты, каждый из которых эквивалентен строго определенному проценту летальности. Считают, что зависимость между пробитами и логарифмами доз (дозами) близка к линейной. Однако и ЬО100 теоретически не существуют (теоретическая кривая приближается к 0 и 100% асимптотически), поэтому, чтобы «уложить» на прямую обе крайние точки, соответствующим испытанным
дозам приписывают некие «исправленные» проценты летальности и их «рабочие пробиты». Сама же прямая строится в сущности по трем средним точкам, которые достаточно хорошо ложатся на прямую и без обращения к пробитам, так как в своей средней части любая Б-образная кривая всегда может быть аппроксимирована прямой 1. При этом в отношении такой прямой сохраняет силу условие 2ст=Ь084—Ь01в, а средняя ошибка (т) средне-смертельной дозы по Миллеру — Тейнтеру равна 2 а
/71 = _ ,— .
Уы '
где N — общее число животных в группах, в которых погибло или выжило хотя бы одно животное (доверительные границы ЬО60 находят при Я =0,05 для числа степеней свободы —1).
Как видим, значения и ЬО100 нигде в расчет не принимаются. Следовательно, для оценки 1Л}50 в принципе достаточно испытать не более трех доз вещества, одна из которых приводит к гибели менее 50% животных, другая — более 50%, а третья является промежуточной. В этом диапазоне доз зависимость процента летальности (У) от дозы (X) практически имеет вид прямой и может быть описана уравнением прямой с угловым коэффициентом (а):
у = аХ + Ь, (1)
где Ь — свободный член. Значения а и Ъ находим из нормальной системы Гаусса (Б. М. Штабский и соавт.):
—У,
а = -(2)
6 =
X. X! 2К — аХХ
(3)
где Хх и Хг — значения двух крайних из трех испытанных доз (приводящих к гибели менее и более 50% животных соответственно); и К2 — соответствующие проценты летальности; п — число испытанных доз, равное 3.
1 Вероятностную оценку вообще всегда можно
получить непосредственно по Б-образной кривой, не прибегая к технике пробит-анализа, например методом Бе-ренса — Шлоссера (М. Л. Беленький).
Зная а и Ь, решаем уравнение (1) относительно X:
Затем, последовательно подставляя в (4) значения Y, равные 50%, 84 и 16%, находим LD50, LDI4, LDie и далее, как обычно, рассчитываем a, m, mt (t — критерий Стьюдента).
Пример 1. М. Л. Беленький приводит результаты определения наркотической среднеэффектив-ной дозы (ED50), соединения 35V при внутрибрю-шинном введении белым крысам. Испытано пять доз: 167, 200, 233, 266 и 300 мг/кг (каждая на 6 животных). Частота эффекта соответственно составляла: 0, 33, 3, 66,6, 83,3 и 100%. При обработке по Миллеру — Тейнтеру ED60=217,0 мг/кг (191,3+242,7 мг/кг}, по Литчфильду— Уилкоксо-ну — 215 мг/кг (185—249 мг/кг). Оценим EDw, как описано выше, отбросив ED0 и ED100. При этом Хх =200 мг/кг, Х2 =266 мг/кг, Yx =33,3%, У2 =83,3%, SX =200+233+266 =699, 2 Y =33,3+ +66,6+83,3=183,2. По формулам (2) и (3) находим:
83,3 — 33,3 226 — 200
= 0.76; Ь =
183.2 — 0,76 699
Отсюда
= — 116,01,
у I 11А Л|
Согласно равенству (4) х = —д 76'—
50+116,01 ЕО,в=-— = 218,4 мг/кг.
84+116,01 ЕОм =--= 263,2 мг/кг,
16+116,01 Е0" =- 0,76 = 173-7 мг/кг'
2о = 263,2 — 173,7 = 89,5 мг/кг, п = 6-3 = 18, яг =89,5/1/2-18 =14,9 мг/кг. Для [=18—1=17 при Р =0,05 табличное значение /2,11. Отсюда ш1 = =14,9-2,11=31,4 мг/кг. В итоге получаем: ЕО60 = =218,4 мг/кг (187,0—249,8) мг/кг, что практически совпадает с оценками по Миллеру — Тейнтеру и Литчфильду — Уилкоксону.
Пример 2. В. Б. Прозоровский приводит результаты определения 1_О&0 физостигмина для мышей при подкожном введении. Испытано пять доз: 0,75, 0,80, 0,90 и 0,95 мг/кг (каждая на 10 животных). Летальность в группах составляла соответственно 0, 40, 50, 50 и 100%. Несмотря на такой «расклад» частот эффекта, автор счел возможным проиллюстрировать технику своей методики именно на этом примере и пришел к ЬОБ0 =0,858+ ±0,028 мг/кг против 0,855+0,017 мг/кг при построении прямой самим же автором на глаз (в арифметической шкале). Переходя к методу трех точек, в этом «неправильном» опыте, вероятно, правильнее отбросить не крайние, а вторую и четвертую дозы (разумеется, в порядке исключения и только в целях сопоставления оценок). Тогда ЬО50 =0,850+0,018 мг/кг. Отбрасывая же крайние дозы (и тем самым нарушая требование о «раз-
Ш
мещении» их по обе стороны от ЬО^,), получаем =0,883+0,009 мг/кг, что, вообще говоря, согласуется с экспериментальными данными не менее, чем все предыдущие оценки. В отличие от В. Б. Прозоровского мы не видим необходимости добиваться скрупулезного уточнения или ее <
ошибки (геБр. доверительного интервала), так как воспроизводимость результатов определения ЬО50 всегда относительна. При пероральном введении, например, различия в 2—3 раза абсолютной величины Ь£)60 одного и того же вещества представляют собой обычную межлабораторную ошибку и даже в одной и той же лаборатории не принимаются во внимание при выявлении видовых различий в чувствительности к ядам (И. В. Саноцкий и И. П. Уланова). Поэтому при всей несомненной важности вероятностной оценки доз ее подлинная роль остается служебной, особенно при учете эффектов в альтернативной форме, когда речь идет не более чем о выявлении пределов индивидуальной вариабельности реакции организма на стимул одной и той же (вполне определенной в токсикологическом смысле) эффективности (что нашло отражение и в самих наименованиях доз: смертельная, наркотическая и др.).
В фармакологии оценки ЬО50 (вообще ЕО60) нередко получают методом двух точек. Пробит-аналитический вариант последнего в изложении В. Ю. Урбаха включен в 10-е издание «Государственной фармакопеи СССР» (М., 1968) и, следовательно, является официальным. Метод предусматривает испытание двух доз вещества, избранных с таким расчетом, чтобы частота регистрируемого альтернативного эффекта в одном случае была менее 50%, в другом — более. Если при этом отказаться от замены частот на пробиты и логарифмирования доз, технику расчетов можно упростить, используя уравнение прямой, проходящей через две точки:
К,— у1 ~ Х2 — Х1 [а> *
Пример 3. Воспользуемся подходящими данными из примера 1, полагая, что Хх=200 мг/кг, Х2 = =266 мг/кг, ^=33,3%, У2=83,3%. Подставляя эти значения в равенство (5) и решая его относительно X, получаем: Х=1,32К+156,04. Отсюда ЕО60=1,32-50+156,04 =222,0 мг/кг. Доверительные границы, как и ранее (естественно, при п = =6-2=12 и Г=11). В итоге Е080=222,0 мг/кг (181,4—262,3 мг/кг). По данным того же примера 1, в качестве Х2 и У2 можно также принять 233 мг/кг и 66,6% .Тогда ЕОм=216,5 мг/кг( 186,4-246,6 мг/кг). Все оценки практически совпадают.
При необходимости применения метода одной точки (проверка ЬО^ нового образца соединения, оценка ЬО^ для животных другого пола, вида и др.) используем уравнение прямой, проходящей < через одну точку:
\У — Уг = а (X — Х0 (6)
где Хх — единственная испытанная доза, У\ —
соответствующий ей процент летальности. Значение а должно быть известно из предшествующих опытов. Если в них определяли ЬОм методом двух точек, значение а находим, решая равенство (5) относительно У.
Пример 4. Перед нами стояла задача определить ЬКбо при часовом купании белых крыс в подогретых до температуры тела водных растворах а-метилбензилового эфира двухлорацетоук-сусной кислоты. Ввиду малой растворимости вещества в воде использовать метод трех или двух точек при заданной экспозиции оказалось невозможным и пришлось прибегнуть к определению ЬКм шри 2-часовой экспозиции (опыт 1), а затем оценить ЬКао при часовой экспозиции методом одной точки (опыт 2). В опыте 1 испытаны концентрации 950 и 1425 мг/л (каждая на 12 животных). Летальность в' группах составляла соответственно 16,7 и 75,0%. Подставляя эти данные в равенство (5) и решая его относительно У, получаем У = =0,12Х—99,90 (т.е. а=0,12), откуда ЬКм> = =1249,2 мг/л (1088,9—1409,5 мг/л). В опыте. 2 на 12 животных испытана концентрация 1900 мг/л, летальность составила 33,3%. Подставляя эти данные и значение а =0,12 в равенство (6) и решая
его относительно х, получаем
I
33,3
0,12 1 0,12 = 8,ЗЗК + 1622,5.
+ 1900 =
Отсюда искомая ЬК6о—2039, 0 мг/л. Чтобы найти ее доверительный интервал, не допуская его искусственного расширения за счет неравенства числа животных в опытах 1 и 3, условно принимаем, что в обоих опытах п—24. При этом абсолютная величина (А) доверительного интервала в обоих случаях заведомо одинакова и равна 1409,5— 1088,9=320,6 мг/л, а доверительные границы ЬК50 равны значению ЬК6о±1/2А. В итоге для часовой экспозиции ЬКБО=2039,0 мг/л (1878,7—
2199,3 мг/л).
В заключение отметим, что нами выполнено более 500 контрольных расчетов ЬО60 и ЬК&0- Все результаты оказались идентичными описанным. Это лишний раз подтверждает, что предложенные простые методические приемы могут найти широкое применение в токсиколого-гигиенических исследованиях.
ЛИТЕРАТУРА
Беленький М. Ji. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., 1963. Прозоровский В. Б. — Фармакол. и токсикол., 1962, № 1, с. 115—119.
Саноцкий И. В., Уланова И. П. Критерии вредности в
гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений. М., 1975. Штабский Б. М., Красовский Г. Н., Кудрина В. Н. и др. — Гиг. и сан., 1979, № 9, с. 41—45.
Поступила 21/1Г 19*0 г.
УДК 612.825.8
Э. Э. Саркисянц, О. П. Сараджева, Т. Ш. Миннибаев
НОВЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО состояния ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ У ЛИЦ, ЗАНЯТЫХ УМСТВЕННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬЮ
I Московский медицинский институт им. И. М. Сеченова
Благодаря научно-техническому прогрессу расширился круг профессий, связанных с напряженной умственной деятельностью и необходимостью постоянной концентрации внимания. В процессе учебной, научно-педагогической и производственной деятельности в современных условиях человек должен быть в постоянной готовности быстро отреагировать на изменившуюся ситуацию. Поэтому оценка этой функции как показателя работоспособности весьма важна.
В настоящее время в гигиенических исследованиях для изучения функции внимания используются такие методы, как корректурный, различные варианты операций с числами и пр. Указанные ме-* тоды имеют определенные недостатки, главными из которых являются большой разброс полученных данных и зависимость показателей от тренированности и уровня мотивации испытуемого. Для этих
методов, в которых, как правило, используется бланковый способ предъявления стимулов, параметры экспериментальной процедуры неизменны и не могут быть изменены в процессе исследования для обеспечения оптимальной степени трудности выполнения теста в зависимости от психофизиологических возможностей испытуемого в данный момент, что не позволяет дать характеристику внимания с требуемой точностью. В связи со сказанным возникла необходимость разработки физиологического метода, позволяющего более полно и в количественном выражении охарактеризовать функциональное состояние центральной нервной системы.
С этой целью нами разработан новый метод — метод различения перепадов яркости (РПЯ), который основан на способности человека различать световые стимулы разной интенсивности. При разработке метода исследования проводили в следую-
