CC BY
11тировке нефти и нефтепродуктов / В. М. Мелкозе-ров, С. И. Васильев. Berlin: Lambert Academic Publishing 2011. 259 с.
2. Пат^О 03/055596 A1. Метод получения сорбента и устройство для его осуществления / В. В. Олейник, В. М. Мелкозеров, Л. Д. Нагорный.
3. Рекультивация почв сельскохозяйственного назначения с применением сорбента «Униполимер-М» /
А. Г. Левченко, М. И. Витковский, А. С. Федотова, В. А. Куркин // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. 2013. № 10. С. 42-46. 4. Сакодынский, К. И. Полимерные сорбенты для молекулярной хроматографии / К. И. Сакодынский, Н. И. Панина.
ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ГЛИЦИЛ-ТРНК СИНТЕТАЗЫ
С IRES-ЭЛЕМЕНТОМ ТИПА I.
Никонова Екатерина Юрьевна
Кандидат биологических наук, научный сотрудник, Федеральное Государственное Бюджетное
Учреждение Науки Институт белка РАН, г. Пущино Никонов Олег Станиславович
Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Федеральное Государственное Бюджетное
Учреждение Науки, Институт белка РАН, г. Пущино Леконцева Наталья Владимировна аспирант, Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки
Институт белка РАН, г. Пущино Гарбер Мария Борисовна
Доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией, Федеральное Государственное
Бюджетное Учреждение Науки, Институт белка РАН, г.Пущино
STUDYING OF THE INTERACTION OF HUMAN GLYCYL-tRNA SYNTHETASE WITH IRES-ELEMENT TYPE I. Nikonova Ekaterina Yurjevna, Candidate of sciences, researcher, Institute of protein research, Pushchino Nikonov Oleg Stanislavovich, Candidate of sciences, researcher, Institute of protein research, Pushchino Lekontseva Natalya Vladimirovna, PhD student, Institute of protein research, Pushchino
Garber Maria Borisovna, Doctor of sciences, professor, head of laborotary, Institute of protein research, Pushchino
АННОТАЦИЯ
В настоящее время во всем мире ведутся активные исследования IRES-элементов, на которых происходит кэп-независимая трансляция, открывая альтернативный путь инициации белкового синтеза. Изучение структурных основ этого процесса представляет собой несомненный интерес для фундаментальной науки. Более того, любая информация, касающаяся этого вопроса, потенциально имеет огромное практическое значение для борьбы с многочисленными, в том числе и смертельно опасными для человека, вирусными заболеваниями. Тем не менее, до сих пор нет ясного понимания процессов, происходящих в ходе инициации трансляции на вирусных IRES-элементах.
ABSTRACT
At present active researches of viral IRES-elements is actively pursued. Cap-independent translation initiation which opens up an alternative way of initiation of protein synthesis is of great interest for the fundamental science. Furthermore, any information concerning this question potentially has a great practical importance for a struggle with a large number of viral diseases, including deadly to humans. Nevertheless, there is still no clear understanding of the processes occurring in the course of translation initiation on the viral IRES-elements.
Ключевые слова: Вирусы, энтеровирус, риновирус, полиовирус, инициация трансляции, глицил-тРНК синте-таза, сайт внутренней посадки рибосомы, РНК-белковые взаимодействия.
Keywords: Viruses, enterovirus, rhinovirus, poliovirus, translation initiation, glycyl-tRNA synthetase, IRES, RNA-protein interaction.
Участки внутренней посадки рибосомы (Internal Ribosome Entry Site, IRES-элементы) - это специфические структурные элементы РНК, располагающиеся в 5'-не-транслируемой области мРНК. Именно на этих участках мРНК происходит кэп-независимая инициация ее трансляции. Изначально они были описаны у пикорнавирусов [11, с. 320], а позже найдены и в мРНК вирусов из других семейств. IRES-элементы пикорнавирусов в зависимости от их вторичной структуры сейчас подразделяют на 4 типа:
тип I (такие как в мРНК энтеровирусов и риновирусов), тип II (такие как в мРНК вируса энцефаломиокардита), тип III (такие как в мРНК вируса гепатита А) и тип IV (такие как в мРНК тешовируса) [2, c.542;8, c. 529]. IRES-элементы пикорнавирусов типов II и IV изучены значительно лучше, чем типов I и III, так как только с ними удалось реконструировать 48S трансляционный комплекс из очищенных компонентов [15, с. 4487; 14, с. 2028; 13, с. 67; 12, с. 6859]. Попытки же собрать 48S инициаторный комплекс на IRES
элементах типа I не увенчались успехом. Объяснением этому может быть то, что для инициации трансляции на IRES-элементах типа I необходимо значительно большее количество специфических мРНК-связывающих белков (IRES trans acting factors, ITAFs). В отличие от мРНК пикор-навирусов с IRES-элементами типа II, мРНК пикорнавиру-сов имеющая IRES-элементы типа I в лизате ретикулоци-тов кролика (RRL) транслируется с низкой эффективностью и с ошибками. Добавление в систему экстракта клеток HeLa значительно стимулирует трансляцию таких мРНК [6, c. 507]. На данный момент известно как минимум 7 факторов (ITAF), которые связываются с IRES-элементами типа I. Однако, механизм их действия не известен. Предполагается, что они могут модулировать третичную структуру IRES-элементов. Наиболее изученным из них является по-липиримидин-связывающий белок (PTB). Этот белок влияет на связывание одного из ключевых факторов инициации трансляции eIF4G. Считается, что сайт связывания РТВ находится недалеко от домена V IRES-элемента I-го типа [7, с. 3710].
5'-нетранслируемый участок мРНК энтеровирусов и риновирусов содержит 6 шпилек, II-VI из которых собственно и образуют IRES-элемент первого типа. При этом Домены IV и V играют наиболее важную роль в его функционировании [2, c. 5602; 8, c. 529]. Домен V связывает комплекс инициаторных факторов, осуществляющих связывание 40S рибосомной субчастицы с IRES-элементом (eIF4G и eIF4A) [4, c.9197; 10, c. 115], а также фактор eIF4B, активирующий хеликазную активность eIF4A [9, c. 2113]. Мутации в этом домене влияют на способность полиови-руса поражать нейроны [9, c. 2113; 10, c. 115; 5, c. 6281]. На данный момент существует гипотеза, что 40S рибосом-ная частица в комплексе с каноническими инициатор-ными факторами и инициаторной Met-тРНК связывает IRES-элемент энтеровирусов или риновирусов в районе доменов V и VI и кратковременно узнает АUG триплет (в позиции 586 у полиовируса или в соответствующей позиции у риновирусов). Однако иницииации трансляции с этого (586 AUG) кодона не происходит. Трансляция инициируется на следующем AUG (743) кодоне, находящемся от первого на расстоянии 160 н. у энтеровирусов и 35 н. у риновирусов [3, c. 869].
Несмотря на активное изучение IRES-элементов типа I [2, c. 542; 8, c. 529], до сих пор нет ясного понимания механизма их функционирования. Более того, до сих пор нельзя быть уверенными, что определены все участники кэп-независимой инициации трансляции на этом типе IRES-элементов. Недавно в лаборатории И. Н. Шатского (ИФХБ МГУ) был проведен скрининг факторов, участвующих в процессе посадки рибосомной субчастицы на IRES-элемент [1, c. 5602]. В результате был обнаружен новый компонент, необходимый для трансляции полиовирусной РНК, - глицил-тРНК синтетаза (GlyRS) [1, c. 5602]. Было показано, что этот «хозяйский» фермент специфически связывается с пятым доменом IRES-элемента полиовирусной мРНК.
Предполагают, что участок связывания человеческой глицил-тРНК синтетазы (hGlyRS) на IRES-элементе I-го типа располагается в непосредственной близости от места связывания факторов eIF4G+eIF4A [4, c. 9197; 10, c. 115]. Апикальная часть домена V, расположенная в непосред-
ственной близости от участка связывания ключевого канонического инициаторного фактора eIF4G, имитирует анти-кодоновую шпильку глициловой тРНК и содержит глициновый «антикодон» АСС. От антикодоновой петли глициловой тРНК «антикодоновая петля» данного участка вирусной мРНК отличается тем, что содержит на 1 нуклеотид больше. Аналогичные структуры присутствуют во всех ^ЕБ-элементах !-типа. В лаборатории И. Н. Шатского было показано, что мутация этого «антикодона» приводит к драматическому падению активности полиовирусного ^ЕБ-элемента, а делеция антикодон-связывающего домена глицил-тРНК синтетазы лишает её свойства стимулировать трансляцию мРНК полиовируса. Анализ последовательностей мРНК пикорнавирусов, показавший абсолютную консервативность глицинового «антикодона» у всех вирусов с IRES-элементами первого типа, позволил авторам выдвинуть обоснованное предположение о необходимости глицил-тРНК синтетазы для осуществления эффективной трансляции мРНК таких вирусов [1, с. 5602].
Имеющаяся на данный момент информация позволяет предположить, что специфическое взаимодействие глицил-тРНК синтетазы с IRES-элементами энтеровирусов и риновирусов может быть использовано в качестве мишени при борьбе с соответствующими заболеваниями. Изучение РНК-связывающих свойств глицил-тРНК синтетазы важно также потому, что кодирующий её ген ассоциирован с различными нейродегенеративными заболеваниями, в том числе с синдромом Шарко-Мари-Тута, затрагивающим функции периферической нервной системы. В большинстве случаев при этом синдроме классическая (тРНК-синтетазная) активность продукта мутантного гена не нарушена, и проявления заболевания связаны с некой нейрон-специфичной ролью глицил-тРНК синтетазы. Обнаружение у глицил-тРНК синтетазы альтернативной функции (функции регуляции трансляции специфических мРНК) может пролить свет на ее роль в подобных заболеваниях.
Ранее в наше распоряжение И.Н. Шатским была любезно предоставлена плазмида, несущая ген человеческой глицил-тРНК синтетазы (hGlyRS). При экспрессии данного гена белок нарабатывался практически полностью в нерастворимой форме и его не удавалось выделить в препаративных количествах с чистотой пригодной для кристаллизации. Поэтому мы перенесли ген глицил-тРНК синтетазы в другой экспрессионный вектор. Целевой реком-бинантный белок соответствует цитоплазматической версии hGlyRS, т.е. не содержит ^концевую сигнальную последовательность, необходимую для импорта белка в митохондрии. Цитоплазматическая форма hGlyRS состоит из трех доменов: неструктурированного так называемого WHEP-домена, каталитического корового домена и анти-кодон-связывающего домена (ABD). Ранее было показано, что активность (способность стимулировать трансляцию) как полноразмерного фермента, так и его фрагмента с обрезанным WHEP-доменом одинакова [1, с. 5602]. Обрезание же ABD-домена приводит к потере способности усиливать инициацию трансляции. Чтобы снизить негативное влияние подвижного неструктурированного N концевого домена на кристаллизацию, мы получили укороченный вариант глицил-тРНК синтетазы, содержащий
только 2 и 3 домены, необходимые для функционирования белка. Для этих белков подобраны оптимальные условия наработки и разработана схема выделения.
Нами были получены также конструкции ДНК, несущие гены различных фрагментов вирусного IRES-эле-мента первого типа. Соответствующие фрагменты мРНК наработаны в препаративных количествах. На основании известной структурной информации [16, с. 20359] мы провели гомологичное моделирование структуры комплекса
минимального из полученных фрагментов IRES элемента (Рис 1.): IRES фрагмент, содержащий антикодоновую шпильку, в комплексе с мономером фрагмента глицил-тРНК-синтетазы, содержащим каталитический и ABD домены. На основании анализа полученной модели можно предположить, что именно ABD домен глицил-тРНК син-тетазы отвечает за узнавание IRES элемента (Рис 2.)
Рисунок 1.
Минимальный фрагмент IRES элемента полиови-руса, использованный в экспериментах по связыванию. Ход сахарофосфатного остова показан пунктирной линией, стекинг-взаимодействия показаны серыми бло-
ками, Взаимодействие вобл-пар показаны кружками, взаимодействия канонических пар показаны тремя точками. Три первые G-C пары внесены дополнительно для придания стабильности фрагменту, они выделены белым и не пронумерованы.
2.
Стереоизображение теоретической модели комплекса минимального из полученных фрагментов IRES элемента (содержащего антикодоновую шпильку) с мономером фрагмента глицил-тРНК-синтетазы, содержащим каталитический и ABD домены. Модель получена методом гомологичного моделирования на основе известной
структурной информации о взаимодействии глицил-тРНК синтетазы с тРНК [16, с. 20359].
Методом гель-электрофореза нуклеиновых кислот в ПААГ в неденатурирующих условиях нами было показано, что цитоплазматическая форма глицил-тРНК синтетазы полностью связывает такой фрагмент IRES-элемента в эквимолярном соотношении (Рис 3.).
1 2
Рисунок 3.
Электрофоретический анализ комплекса цитоплаз-матической формы глицил-тРНК синтетазы с минимальным фрагментом IRES-элемента.
Дорожка 1 - минимальный фрагмент IRES-эле-
мента.
Дорожка 2 - РНК-белковый комплекс. Эти данные дают надежду на получение кристаллов данного комплекса и определение его структуры методом рентгеноструктурного анализа. Мы планируем также получить изолированный ABD домен и протестировать его способность связывать соответствующие фрагменты IRES элемента первого типа. Константы связывания для данных комплексов и для комплексов с другими наработанными фрагментами IRES будут определяться в дальнейшем методом поверхностного плазмонного резонанса. Наиболее стабильные комплексы будут отобраны для экспериментов по кристаллизации с целью определения их структуры.
Выражаем благодарность И.Н.Шатскому и сотруднику его лаборатории Дмитрию Андрееву за предоставление плазмид.
Данная работа была выполнена при поддержке гранта РНФ №15-14-00028.
Список литературы
1. Andreev D.E., Hirnet J.,. Terenin I.M., Dmitriev S.E., Niepmann M. and Shatsky I.N. (2012) Glycyl-tRNA synthetase specifically binds to the poliovirus IRES to activate translation initiation. NAR, 40 (12), 56025614.
2. Balvay,L., Soto Rifo,R., Ricci,E.P., Decimo,D. and Ohlmann,T. (2009) Structural and functional diversity of viral IRESes. Biochim. Biophys. Acta, 1789, 542-557.
3. Belsham,G.J. and Jackson,R.J. (2000) Translation initiation on picornavirus RNA. In: Sonenberg,N., Hershey,J.W.B. and Mathews,M.B. (eds), Translational Control of Gene Expression. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 869900.
4. de Breyne,S., Yu,Y., Unbehaun,A., Pestova,T.V. and Hellen,C.U. (2009) Direct functional interaction of initiation factor eIF4G with type 1 internal ribosomal entry sites. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 106, 9197-9202.
5. Campbell,S.A., Lin,J., Dobrikova,E.Y. and Gromeier,M. (2005) Genetic determinants of cell type-specific poliovirus propagation in HEK 293 cells. J. Virol., 79, 6281-6290.
6. Dorner,A.J., Semler,B.L., Jackson,R.J., Hanecak,R., Duprey,E. and Wimmer,E. (1984) In vitro translation of poliovirus RNA: utilization of internal initiation sites in reticulocyte lysate. J. Virol., 50, 507-514.
7. Kafasla,P., Morgner,N., Robinson,C.V. and Jackson,R.J. (2010) Polypyrimidine tract-binding protein stimulates the poliovirus IRES by modulating eIF4G binding. EMBO J., 29, 3710-3722.
8. Niepmann,M. (2009) Internal translation initiation of picornaviruses and hepatitis C virus. Biochim. Biophys. Acta, 1789, 529-541.
9. Ochs,K., Saleh,L., Bassili,G., Sonntag,V.H., Zeller,A. and Niepmann,M. (2002) Interaction of translation initiation factor eIF4B with the poliovirus internal ribosome entry site. J. Virol., 76, 2113-2122.
10. Ochs,K., Zeller,A., Saleh,L., Bassili,G., Song,Y., Sonntag,A. and Niepmann,M. (2003) Impaired binding of standard initiation factors mediates poliovirus translation attenuation. J. Virol., 77, 115-122.
11. Pelletier,J. and Sonenberg,N. (1988) Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature, 334, 320-325.
12. Pestova,T.V., Hellen,C.U. and Shatsky,I.N. (1996) Canonical eukaryotic initiation factors determine initiation of translation by internal ribosomal entry. Mol. Cell. Biol., 16, 6859-6869.
13. Pestova,T.V., Shatsky,I.N., Fletcher,S.P., Jackson,R.J. and Hellen,C.U. (1998) A prokaryotic-like mode of cytoplasmic eukaryotic ribosome binding to the initiation codon during internal translation initiation of hepatitis C and classical swine fever virus RNAs. Genes Dev., 12, 67-83.
14. Pilipenko,E.V., Pestova,T.V., Kolupaeva,V.G., Khitrina, E.V., Poperechnaya,A.N., Agol,V.I. and Hellen,C.U. (2000) A cell cycle-dependent protein serves as a template-specific translation initiation factor. Genes Dev., 14, 2028-2045.
15. Pisarev,A.V., Chard,L.S., Kaku,Y., Johns,H.L., Shatsky,I.N. and Belsham,G.J. (2004) Functional and structural similarities between the internal ribosome entry sites of hepatitis C virus and porcine teschovirus, a picornavirus. J. Virol., 78, 4487-4497.
16. Qin X, Hao Z, Tian Q, Zhang Z, Zhou C, Xie W. (2014) Cocrystal structures of glycyl-tRNA synthetase in complex with tRNA suggest multiple conformational states in glycylation. J Biol Chem. 289(29):20359-69.
