CC BY
697
З. Н. Хисматуллина
СТРУКТУРА, ФУНКЦИЯ И ЗНАЧЕНИЕ ТРАНСЛЯЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ
ГЛАВНЫХ КОМПОНЕНТОВ БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ СИСТЕМЫ
Ключевые слова: белоксинтезирующая система, рибосомы, РНК, ДНК, генетический код, трансляция, инициация, элонгация, терминация, активация аминокислот, постсинтетический процессинг, регуляция синтеза белка.
Дано представление о молекулярных механизмах синтеза белка, для осуществления которого требуются источники энергии, наличие активированных свободных аминокислот и нескольких типов клеточных нуклеиновых кислот. Механизм синтеза белка обладает весьма тонкой и точной кодирующей системой, которая автоматически программирует включение каждого аминокислотного остатка в определенное место полипептидной цепи.
Key words: protein-synthesizing system, ribosomes, RNA, DNA, genetic code, translation, initiation, elongation, termination, activation of the aminoacids, postsintetating processing, regulation ofprotein synthesis.
Molecular mechanisms of the protein synthesis are given. The energy sources, activated free aminoacids and several types of cellular nucleic acids are required. The mechanism of the protein synthesis has a very fine and accurate coding system which automatically programs the inclusion of each aminoacid residue to the certain place of a polypeptide chain.
Особое место в многообразных превращениях веществ, характерных для всех живых организмов занимает обмен белков. Выполняя ряд уникальных функций, свойственных живой материи, белки определяют не только микро-и макроструктуру отдельных субклеточных образований, специфику организации клеток, органов и целостного организма, но и в значительной степени динамическое состояние между организмом и окружающей его средой. Белковый обмен строго специфичен, направлен и настроен, обеспечивая непрерывность
воспроизводства и обновления белков организма. В течение всей жизнедеятельности в организме постоянно и с высокой скоростью совершаются два противоположных процесса: распад органических макромолекул и надмолекулярных структур и синтез этих соединений. Эти процессы обеспечивают катаболические реакции и создание сложной структурной организации живого из хаоса веществ окружающей среды, причем ведущую роль играют именно белки. Все остальные виды обмена починены этой глобальной задаче живого -самовоспроизведению себе подобных путем программированного синтеза специфических белков. Для осуществления этого используются энергия обмена углеводов и липидов, строительный материал в виде углеродных остатков аминокислот, промежуточных продуктов метаболизма углеводов и др.
Современная биология и ее новейшие разделы - молекулярная биология, биоорганическая химия, физико-химическая биология - решают одну из важнейших задач: определяют молекулярные основы и механизмы синтеза белка, содержащего сотни, а иногда и тысячи остатков Ь-аминокислот. Последние располагаются в строго заданной последовательности, обеспечивая тем самым уникальность структуры синтезированной белковой молекулы. Иначе говоря, механизм синтеза
обладает весьма тонкой и точной кодирующей системой, которая автоматически программирует включение каждого аминокислотного остатка в определенное место полипептидной цепи. Установлено, что кодирующая система однозначно определяет первичную структуру белковой молекулы, в то время как вторичная и третичная структуры определяются физико-химическими свойствами и химической структурой радикалов аминокислот в полипептиде.
Первичную структуру важнейших биополимеров - белков и нуклеиновых кислот -можно сравнить с буквенной записью: и в том и в другом случае имеется не произвольное, а строго определенное, «имеющее смысл» чередование
элементов - мономеров или букв. На этом основании нуклеиновые кислоты и белки называют информационными молекулами. Чтобы получить такие молекулы, недостаточно смешать мономеры и обеспечить условия образования пептидной или фосфодиэфирной связи: необходима еще программа, определяющая последовательность присоединения разных мономеров к растущей цепи полимера. При биосинтезе новых молекул нуклеиновых кислот и белков носителями такой программы являются нуклеиновые кислоты; в этой роли их называют матрицами. Матрица в ходе матричного синтеза не расходуется и может использоваться многократно, в этом отношении она сходна с катализатором [4].
Различают три основных типа матричных биосинтезов:
1) биосинтез ДНК (репликация ДНК) с использованием в качестве матрицы уже существующих молекул ДНК;
2) биосинтез РНК на матрице ДНК (транскрипция);
3) биосинтез белков с использованием мРНК в качестве матрицы (трансляция).
Первоначально имелось в виду, что синтез белка могут катализировать те же протеолитические
ферменты, которые вызывают и его гидролиз, но путем обратимости химической реакции. Но оказалось, что синтетические и катаболические реакции протекают не только различными путями, но даже в разных субклеточных фракциях. Гипотеза о предварительном синтезе коротких пептидов с последующим их объединением в одну полипептидную цепь также не подтвердилась. Более правильным оказалось предположение, что для синтеза белка требуются источники энергии, наличие активированных свободных аминокислот и нескольких типов клеточных нуклеиновых кислот.
В синтезе белка, протекающем в основном в цитоплазме, решающую роль играют нуклеиновые кислоты, в частности ДНК. После того, как было установлено, что ДНК является носителем и хранителем наследственной информации, был поставлен вопрос о том, каким образом эта генетическая информация, записанная в
химической структуре ДНК, трансформируется в фенотипические признаки и функциональные свойства живых организмов, передающиеся по наследству. В настоящее время можно дать однозначный ответ на этот вопрос: генетическая информация программирует синтез специфических белков, определяющих в свою очередь специфичность структуры и функции клеток, органов и целостного организма. В природе, как известно, существует два типа биополимерных макромолекул: так называемые неинформативные биополимеры, которые представлены
повторяющимися мономерными единицами и/или разветвленными структурами, например
полисахариды, поли-АДФ-рибоза, пептидогликаны, гликопротеины и информативные биополимеры, несущие первичную генетическую информацию (нукленовые кислоты) и вторичную генетическую, точнее фенотипическую, информацию (белки). Эти общие представления могут быть выражены следующей последовательностью событий: ДНК^ РНК^- Белок ^ Клетка ^ Организм.
ДНК локализована в ядре клетки, в то время как синтез белка протекает главным образом в микросомах цитоплазмы. Экспериментально была доказана необходимость нуклеиновых кислот для синтеза белка. Было показано также, что присутствующие в цитоплазме рибонуклеиновые кислоты контролируют синтез цитоплазматических белков. Таким образом, можно говорить о тесной связи между ДНК, локализованной в ядре, и синтезом белка, протекающим в цитоплазме и регулирующимся рибонуклеиновыми кислотами, которые были открыты как в цитоплазме , так и в ядре. На основании этих чисто морфологических данных было сделано заключение, что биосинтез белка, хотя непосредственно и регулируется рибонуклеиновыми кислотами, опосредованно связан с контролирующим влиянием ДНК ядра и что РНК сначала синтезируется в ядре, затем поступает в цитоплазму, где выполняет роль матрицы в синтезе белка. Уже значительно позже экспериментальные данные подтвердили гипотезу о
том, что основными функциями нуклеиновых кислот являются хранение генетической информации и реализация этой информации путем программированного синтеза специфических белков.
В последовательности ДНК^ РНК ^ Белок недоставало сведений о том, каким образом происходят расшифровка наследственной информации и синтез специфических белков, определяющих широкое разнообразие признаков живых существ. В настоящее время выяснены основные процессы, посредством которых осуществляется передача наследственной информации: 1) репликация, т.е. синтез ДНК на матрице ДНК; 2) транскрипция, т.е. синтез РНК на матрице ДНК или перевод языка и типа строения ДНК на молекулу РНК; 3) трансляция, т.е. процесс, в котором генетическая информация, содержащаяся в молекуле мРНК, направляет синтез соответствующей аминокислотной
последовательности в белке. Однако многие тонкие механизмы транскрипции и трансляции окончательно еще неясны.
Белоксинтезирующая система включает набор 20-и аминокислот, входящих в состав белковых молекул; минимум 20 разных тРНК, обладающих специфичностью к определенному ферменту и определенной аминокислоте; набор минимум 20-и различных ферментов - аминоцил-тРНК-синтетаз, также обладающих двойной специфичностью к какой-либо определенной аминокислоте и к одной тРНК; рибосомы; АТФ и АТФ-генерирующую систему ферментов; ГТФ, принимающий специфическое участие в стадиях инициации и элонгации синтеза белка в рибосомах; ионы М^2+ в концентрации 0,005 - 0,008 М; мРНК в качестве главного компонента системы, несущей информацию о структуре белка, синтезирующегося в рибосоме; наконец, белковые факторы, участвующие в синтезе на разных уровнях трансляции [1].
Процесс трансляции имеет
непосредственное отношение к механизмам передачи наследственной информации, или
экспрессии генов, что означает перевод
«четырехбуквенного языка нуклеиновых кислот на двадцатибуквенную речь белков». Другими словами, трансляция сводится к синтезу белка в рибосомах. В этом процессе только последовательность
расположения нуклеотидов в мРНК определяет
первичную структуру белка, т.е. строго упорядоченную последовательность расположения отдельных аминокислотных остатков в молекуле синтезируемого белка. Живые организмы, как известно, в зависимости от структуры клеток делятся на две группы - прокариоты и эукариоты. Первые не содержат ограниченного мембраной ядра и митохондрий или хлоропластов.; они представлены главным образом микроорганизмами. Клетки эукариот животных и растений, включая грибы, напротив, содержат ядра с мембранами, а также митохондрии (в ряде случаев и хлоропласты) и другие субклеточные органеллы.
Оба типа клеток имеют рибосомы, причем рибосомы эукариот значительно большего размера (23 нм в диаметре), чем рибосомы прокариот (8 нм в диаметре). Химически рибосомы представляют собой нуклеопротеины, состоящие из РНК и белков, причем 808 рибосомы эукариот содержат примерно равное их количество, а у 708 рибосом прокариот соотношение РНК и белка составляет 65 % и 35 % соответственно. РНК рибосом принято называть рибосомными и обозначать рРНК. Как 808, так и 708 рибосомы состоят из двух субчастиц, которые можно увидеть под электронным микроскопом или после обработки рибосом растворами, содержащими низкие концентрации ионов Mg2+. При этих условиях рибосомы диссоциируют на субчастицы; последние могут быть отделены друг от друга методом ультрацентрифугирования. Одна из субчастиц по размерам в 2 раза превышает вторую. Так, у 708 рибосом величины 8 для субчастиц равны 508 и 308, у 808 рибосом - соответственно 608 и 408. Рибосомные белки не только все выделены, но и секвенированы; отличаются большим
разнообразием молекулярной массы (от 6000 до 75000). Считается, что все 55 бактериальных рибосомных белков участвуют в синтезе полипептидов в качестве ферментов или структурных компонентов, но, за исключением небольшого числа, детальная функция большинства из них не выяснена. РНК 238 и 58 содержат 3200 и 120 нуклеотидов соответственно, а 168 РНК - 1540 нуклеотидов. Субчастицы рибосом клеток эукариот построены более сложно. В их составе четыре разные рРНК и более 70 разных белков в обеих субчастицах, при этом большая субчастица (608) содержит три разного размера рРНК: 288 (4700
нуклеотидов), 5,88 (160 нуклеотидов) и 58 (120 нуклеотидов) - и около 49 белков. Малая
субчастица (408) содержит всего одну молекулу 188 рРНК и около 33 белков. Следует отметить, что биологические функции компонентов
эукариотических рибосом также связаны, вероятнее всего, с синтезом полипептидной цепи, но их конкретная роль раскрыта недостаточно.
Рибосомы представляют собой сложную молекулярную «машину» («фабрику») синтеза белка. Для выяснения тонких механизмов синтеза белка в рибосомах необходимы более точные сведения о структуре и функциях всех компонентов рибосом. В последнее время получены данные,
свидетельствующие о вероятной пространственной трехмерной структуре как целых рибосом, так и их субчастиц. В частности, выяснено, что форму и размеры 308 и 408 субчастиц рибосом предопределяют не белковые молекулы этих частиц, а третичная структура входящих в их состав 168 и 188 рРНК . Более того, последние данные свидетельствуют о том, что для сохранения пространственной морфологической модели всей 308 субчастицы достаточно наличие только двух белков (из 21), содержащихся в определенных топографических участках молекулы 168 рРНК [1].
Известно, что рРНК образуется из общего предшественника всех типов клеточных РНК, в свою очередь синтезирующегося на матрице ДНК в ядре. Рибосомные белки имеют цитоплазматическое происхождение, затем они транспортируются в ядрышки, где и происходит спонтанное образование рибосомных субчастиц путем объединения белков с соответствующими рРНК . объединенные субчастицы вместе или врозь транспортируются через поры ядерной мембраны обратно в цитоплазму, где группа рибосом вместе с мРНК образует полисомы или полирибосомы, принимающие непосредственное участие в синтезе белка.
Экспериментально доказано существование в любых клетках живых организмов специфических ферментов, катализирующих активирование аминокислот и связывание последних с определенными тРНК. Все эти ферменты выделены в чистом виде, секвенированы и для ряда их установлена трехмерная структура.
Все они оказались чувствительными к реагентам на 8Н-группы и требуют присутствия ионов Mg2+. Ферменты обладают абсолютной специфичностью действия, поскольку они узнают только одну какую-либо Ь-аминокислоту или одну тРНК. Для тех аминокислот, для которых открыты две и более тРНК, соответствующая аминоацил-тРНК-синтетаза катализирует аминоацилирование всех этих тРНК. Это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку в дальнейшем в белковом синтезе «узнавание» аминоацил-тРНК основано не на природе аминокислоты, а на химической природе антикодона тРНК. Считается, что в молекуле каждой аминоацил-тРНК-синтетазы имеется, по крайней мере три центра связывания: для
аминокислоты, тРНК и АТФ. Ферменты весьма чувствительны также к аналогам аминокислот, которые ингибируют активирование
соответствующих аминокислот. Некоторые ферменты состоят из одной полипептидной цепи, другие - из двух или четырех гомологичных или гетерогенных субъединиц.
Аминоацил-тРНК делят на два класса в соответствии с различиями в их первичной и третичной структурах, а также в зависимости от своеобразия механизма катализируемой реакции. Первый класс включает ферменты, катализирующие синтез аминоацил-тРНК следующих аминокислот: Арг, Вал, Глн, Глу, Иле, Лей, Мет, Тир, Трп, Цис; второй класс - аминокислот Ала, Асн, Асп, Гис, Гли, Лиз, Про, Сер, Тре, Фен. Ферменты первого класса обеспечивают перенос аминоацильной группы сначала ко второй группе терминального остатка адениловой кислоты, затем перемещение ее к третьей группе, в то время как ферменты второго класса катализируют перенос аминоацильной группы непосредственно к третьей группе концевого аденилового нуклеотида.
Аминоацил-тРНК-синтетазы в активном центре содержат гистидин, имидазольное кольцо которого участвует в связывании АТФ посредством
ионов Mg2+.. наибольшим сродством эти ферменты обладают к молекулам специфических тРНК, хотя конкретный механизм, посредством которого ферменты узнают подходящую РНК, пока неясен.
К настоящему времени открыто более 60 различных тРНк. Для каждой аминокислоты в клетке имеется по крайней мере одна специфическая тРНК. Для ряда аминокислот открыто более одной: в частности, для серина, лейцина и аргинина - 6 разных тРНК, для аланина, треонина и глицина - по 4 разных тРНК, хотя и в этом случае каждая тРНК связана со специфической аминоацил-тРНК-синтетазой. Молекулярная масса большинства тРНК колеблется от 24 000 до 29 000. они содержат от 75 до 85 нуклеотидов, в том числе 8 и более из них являются модифицированными основаниями. Почти все тРНК обладают не только удивительно сходными функциями, но и очень похожей трехмерной структурой [1].
Установлена первичная структура почти всех 60 открытых тРНК. Знание последовательности нуклеотидов и, следовательно, состава тРНК дало в руки исследователей много ценных сведений о биологической роли отдельных компонентов тРНК. Общей для тРНК оказалась также нативная трехмерная структура, установленная методом рентгенокристаллографического анализа и названная первоначально конформацией клеверного листа. На самом деле эта конформация имеет перевернутую Ь-образную форму. Определение тРНК этим методом позволило выявить ряд отличительных особенностей структуры. В молекуле тРНК открыты спирализованные участки, необычные водородные связи и гидрофобные взаимодействия во внеспирализованных участках. тРНК имеет псевдоуридиловую петлю, образованную из нуклеотидов, содержащих псевдоуридин и дигидроуридиловую петлю. Обе петли участвуют в образовании угла буквы Ь.
Роль отдельных участков тРНК раскрыта недостаточно. В частности, по-видимому, псевдоуридиловая петля обеспечивает связывание аминоацил-тРНК с рибосомой, а дигидроуридиловая петля, вероятнее всего, необходима как место для узнавания специфическим ферментом - аминоацил-тРНК-синтетазой. Кроме того, имеется добавочная петля, состав которой варьирует у разных типов молекул тРНК, ее назначение до сих пор неизвестно. С полностью раскрытой функцией участком является антикодоновая петля, несущая триплет, названный аникодоном, и расположенная на противоположной стороне от того конца, к которому присоединяется аминокислота. Антикодоновая петля состоит из семи нуклеотидов: три занимают центральное положение и формируют собственный высокоспецифичный антикодон, по два нуклеотида расположены по обе стороны от него, включая модифицированный пурин и варьирующее основание с одной стороны и два пиримидиновых основания - с другой стороны. Антикодон является специфичным и комплементарным к соответствующему кодону
мРНК, причем оба они антипараллельны в своей комплементарности.
Тщательный анализ нуклеотидной последовательности разных тРНК показал, что все они содержат одинаковый пяти-концевой нуклеотид- ГМФ - со свободной пяти-фосфатной группой. Адапторная функция молекул тРНК заключается в связывании каждой молекулы тРНК со своей специфической аминокислотой. Но, поскольку между нуклеиновой кислотой и специфической функциональной группой аминокислот нет соответствия и сродства, эту функцию узнавания, точнее, посредника между тРНК и аминокислотой, должна выполнять белковая молекула фермента. Взаимодействие между аминоацил-тРНК-синтетазой и тРНК принято обозначать как «вторичный генетический код», подчеркивая тем смым его ключевую роль в обеспечении точности синтеза белка, причем правила кодирования являются, вероятнее всего, более сложными, чем правила «первичного
генетического кода».
Синтез белка представляет собой
циклический многоступенчатый процесс, в котором свободные аминокислоты полимеризуются в генетически детерминированную
последовательность с образованием полипептидов. Система белкового синтеза, точнее система трансляции, включает участие множества
разнообразных молекул - низкомолекулярных
веществ и макромолекул, а также надмолекулярных структур.
Процесс трансляции (т.е. белковый синтез) условно можно разделить на пять стадий: три стадии - инициация, элонгация и терминация -считаются главными и основными, а две стадии -активация аминокислот и постсинтетический
процессинг - рассматриваются в качестве дополнительных и вспомогательных стадий синтеза. Более 100 макромолекул участвуют в активировании аминокислот и их переносе на рибосомы (все тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы), более 60 макромолекул входит в состав 708 и 808 рибосом, и около 10 макромолекул, называемых белковыми факторами, принимающих
непосредственное участие в системе трансляции.
Необходимым условием синтеза белка, который в конечном счете сводится к полимеризации аминокислот, является наличие в системе не свободных, а так называемых активированных аминокислот со своим внутренним запасом энергии. Активация свободных аминокислот осуществляется при помощи
специфических ферментов - аминоацил-тРНК-синтетаз - в присутствии АТФ. Этот процесс протекает в две стадии, которые катализируются одним и тем же ферментом. На первой стадии аминокислота вступает в реакцию с АТФ, при этом освобождается пирофосфат и образуется
промежуточный продукт, который на второй стадии реагирует с соответствующей тРНК, в результате
чего образуется аминоацил-тРНК и освобождается АМФ [2].
Собственно трансляция, т.е.
многоступенчатый синтез белка, как уже было сказано выше, протекает в три стадии: инициации, элонгации и терминации.
Стадия инициации, являющаяся «точкой отсчета» начала синтеза белка, требует соблюдения ряда условий, в частности, наличия в системе, помимо 708 (или 808) рибосом, инициаторной аминоацил-тРНК, инициирующих кодонов в составе мРНК и белковых факторов инициации. Доказано экспериментальным путем, что синтез белка инициирует единственная аминокислота - метионин. Имеется только один кодон для метионина, однако во всех живых организмах открыты две тРНК для метионина: одна используется при инициации
синтеза белка, другая - для включения метионина во внутреннюю структуру синтезируемого
полипептида в стадии элонгации.
Процесс элонгации начинается с образования первой пептидной связи и непосредственно связан с большой субчастицей (508) рибосомы, содержащей два центра для связывания тРНК: один из них называется
аминоацильным (А), другой - пептидильным (П). процесс элонгации сам в свою очередь делится на три стадии: узнавание кодона и связывание
аминоацил-тРНК, образование пептидной связи и транслокация. На первой стадии в свободный А-участок рибосомы доставляется аминоацил-тРНК при участии фактора элонгации Ти. Этот процесс требует затраты энергии и сопряжен с гидролизом ГТФ и образованием прочно связанного комплекса Ти - ГТФ. Образовавшийся комплекс подвергается диссоциации только в присутствии второго фактора элонгации Тб, при котором освободившийся фактор Ти может вновьпринять участие в доставке аа-тРНК в рибосому. Таким образом, в транслирующей 708 рибосоме в пептидильном центре располагается формилметионил-тРНК, а в А-центре - аминоацил-тРНК. С этого момента начинается вторая стадия элонгации - образование первой пептидной связи. Для этого в рибосоме осуществляется ферментативная реакция транспептидирования между формилметионил-тРНК в П-центре и новой аа-тРНК в А-центре. В процессе этой реакции остаток формилметионина переносится на аа-тРНК и замыкается первая пептидная связь в будущей полипептидной цепи. На третьей стадии процесса элонгации необходимо иметь свободный аминоацильный центр для присоединения следующей аа-тРНК. Для этого благодаря процессу транслокации образовавшийся фрагмент дипептидил-тРНК переносится от аминоацильного на пептидильный центр. достигается транслокация благодаря передвижению рибосомы относительно мРНк при участии фермента транслоказы за счет использования энергии распада еще одной молекулы ГТФ. Таким образом, на стадии элонгации происходит последовательное наращивание полипептидной цепи по одной
аминокислоте в строгом соответствии с последовательностью триплетов (кодонов) в молекуле мРНК.
На стадии терминации биосинтеза белка завершается синтез полипептидной цепи в 708 рибосоме при участии трех белковых факторов терминации. После того как терминирующий кодон мРНК занимает свое место в аминоацильном центре рибосомы, к нему присоединяется не тРНК, поскольку отсутствуют соответствующие антикодоны тРНК, узнающие этот терминальный сигнал, а один из белковых факторов терминации и блокируется дальнейшая элонгация цепи. Считается, что терминирующие кодоны и белковые факторы индуцируют изменение специфичности пептидной активности таким образом, что она катализирует перенос растущей пептидной цепи, и скорее к молекуле воды, чем к аминогруппе аминокислоты. В результате этого происходит отделение белковой молекулы от рибосомы и освобождение молекул тРНК и мРНК. Одновременно 708 рибосома диссоциирует на две субчастицы - 308 и 508, которые могут вновь использоваться для реассоциации новой рибосомы [4].
Помимо того, что белки используются для нужд самой клетки, многие так называемые экспортируемые белки, которые функционируют вне клетки, подвергаются переносу через клеточную мембрану при помощи особых низкомолекулярных пептидов (от 15 до 30 аминокислотных остатков). Такие белки называются лидирующими или сигнальными пептидами. Особенностью их состава является то, что они преимущественно содержат гидрофобные радикалы, что позволяет им легко проникать через бислойную липидную мембрану или встраиваться в мембрану. Эти сигнальные последовательности в рибосомах образуются первыми при синтезе белка по программе сигнальных кодонов, расположенных сразу после инициаторного кодона, и легко узнаются рецепторными участками мембраны.
На последней (пятой) стадии синтеза белка происходят формирование третичной структуры и процессинг молекулы полипептида.
Синтезированная на рибосоме в строгом соответствии с генетической программой линейная одномерная полипептидная молекула уже содержит определенную информацию. Такая молекула
(конформационная) претерпевает не хаотичные структурные изменения, а подвергается превращению (процессингу) в строго определенное трехмерное тело, которое само наделено
информацией, но уже функциональной.
Участок ДНК, несущий информацию о синтезе белка, называется геном, а участок, контролирующий синтез единственной
полипептидной цепи и ответственный за него -цистроном. Поэтому естественно предположить, что, если белок состоит из нескольких (более одного) полипептидов, то в синтезе такого белка должны участвовать несколько (более одного) цистронов. Однако это не всегда соответствует
действительности, особенно если полипептидные цепи идентичны. Например, если пептидные цепи какой-либо одной белковой молекулы являются неидентичными, то это не всегда означает, что они синтезируются как результат действия разных цистронов. Подобный белок может синтезироваться в виде единственной полипептидной цепи с последующими протеолитическими разрывами в одном или нескольких местах и отщеплением неактивных участков. Типичным примером подобной модификации является гормон инсулин, синтезирующийся в виде единого
полипептидапрепроинсулина, который после ферментативного гидролиза превращается сначала в неактивный предшественник проинсулин, а затем в активный гормон инсулин, содержащий две разные по размеру и последовательности полипептидные цепи [3].
Следует отметить, что значительно больший удельный вес имеет посттрансляционная химическая модификация белков, затрагивающая радикалы отдельных аминокислот. Одной из таких модификаций является ковалентное присоединение простетической группы к молекуле белка. Так, только после присоединения пиридоксальфосфата к е-аминогруппе остатка лизина белковой части -апоферменту - образуется биологически активная трехмерная конфигурация аминотрансфераз, катализирующих реакции трансаминирования аминокислот. Некоторые белки подвергаются гликозилированию, присоединяя олигосахаридные остатки и обеспечивают тем самым доставку белков к клеткам-мишеням. Широко известны химические модификации белков в результате реакции гидроксилирования остатков пролина, лизина (при формировании молекул коллагена), реакции метилирования (остатки лизина, глутамата).
Фосфорилирование остатков серина и треонина, например в молекуле гистоновых и негистоновых белков, а также казеина молока, является одной из широко распространенных химических постсинтетических модификаций. Фосфорилирование-дефосфорилирование ОН-группы серина абсолютно необходимо для множества ферментов, например, для активности гликоген-фосфорилазы и гликоген-синтазы. Фосфорилирование некоторых остатков тирозина в молекуле белка рассматривается как один из возможных и специфических этапов формирования онкобелков при малигнизации нормальных клеток. Также хорошо известны реакции окисления двух остатков цистеина и образование внутри- и межцепочечных дисульфидных связей при формировании третичной структуры. Этим объясняется не только защита от внешних агентов, но и образование нативной конформации и проявление биологической активности.
Менее известны реакции фарнезилирования остатков цистеина ряда белков: белка в, группы белков ядерного матрикса, а также белков-онкогенов гаБ и протоонкогенов. Доказано, что блокирование реакции фарнезилирования,
вызванное специфическими препаратами
(ингибиторами), приводит к потере канцерогенной активности онкогена гаБ. Результаты этих
исследований могут служить основой для разработки эффективных средств борьбы с
опухолевыми заболеваниями человека,
основанными на ингибировании
посттрансляционной модификации белков вообще и онкобелков в частности.
Важно отметить, что, хотя биосинтез белка, представляющий собой сложный многоступенчатый процесс, описан во многих монографиях, наши знания о структурно-функциональных
взаимоотношениях многих его этапов все еще недостаточны. Так, выделены и охарактеризованы рибосомы, состоящие из множества
индивидуальных белков и трех типов молекул РНК; выяснена аминокислотная последовательность 55 белковых молекул, первичная и вторичная структура трех типов РНК; интенсивно изучается трехмерная структура отдельных белков рибосом прокариот. Но, тем не менее, многие существенные детали механизма белкового синтеза еще неясны.
Основным условием существования любых живых организмов является наличие тонкой, гибкой, согласованно действующей системы регуляции, в которой все элементы тесно связаны друг с другом. В белковом синтезе большое значение имеют количественный и качественный состав белков, а также время синтеза, так как от этого зависит приспособление микроорганизмов к условиям окружающей среды как биологической необходимости или приспособление сложного многоклеточного организма к физиологическим потребностям при изменении внутренних и внешних условий.
Сущность теории регуляции синтеза белка, разработанной французскими учеными Ф.Жакобом и Ж.Моно, сводится к «выключению» или «включению» генов как функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию на синтез белков. Эта теория была доказана в опытах на бактериях, хотя в эукариотических клетках механизмы регуляции синтеза белка, вероятнее всего, являются более сложными. Оытным путем у бактерий была доказана индукция ферментов при добавлении в питательную среду субстратов этих ферментов. Добавление конечных продуктов реакции, образование которых катализируется этими же ферментами, напротив, вызывает уменьшение количества синтезируемых ферментов. Такое явление называется репрессией синтеза ферментов. Оба явления - индукция и репрессия - взаимосвязаны.
Согласно теории Ф.Жакоба и Ж.Моно, в биосинтезе белка у бактерий участвуют три типа генов: структурные гены, ген-регулятор и ген-оператор. Первичную структуру синтезируемого белка определяют структурные гены. Именно эти гены в цепи ДНК являются основой для биосинтеза
мРНК, которая затем поступает в рибосому и служит матрицей для биосинтеза белка [1].
Существует определенный участок, называемый геном-оператором, который непосредственно контролирует синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке структурного гена или структурных генов, регулируемых им и служит пусковым механизмом для функционирования структурных генов. «Считывание» генетического кода, т. е. формирование мРНК, начинается с промотора - участка ДНК, который расположен рядом с геном-оператором и является точкой инициации для синтеза мРНК. синтезированную молекулу мРНК, кодирующую синтез нескольких разных белков, называют полигенным транскриптом. Координированный одним оператором одиночный ген или группа структурных генов образует оперон. Деятельность оперона находится под контролирующим влиянием другого участка цепи ДНК, который называется геном-регулятором. Структурные гены и ген-регулятор расположены в разных участках цепи ДНК, поэтому связь между ними осуществляется при помощи вещества-посредника, называющегося репрессором.
Образование репрессора происходит в рибосомах ядра на матрице специфической мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Образование такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, следовательно, синтеза белка, т.е функция гена-регулятора состоит в том, чтобы через белок-репрессор прекращать деятельность структурных генов, синтезирующих мРНК. Кроме того, репрессор обладает способностью специфически связываться с определенными низкомолекулярными веществами, которые называются индукторами, или эффекторами. Если такой индуктор соединяется с репрессором, то последний теряет способность связываться с геном-оператором, который выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК. Это пример отрицательной формы контроля, когда индуктор, соединяясь с белком-репрессором, вызывает изменения его третичной структуры настолько, что репрессор теряет способность связываться с геном-оператором. Этот процесс аналогичен взаимоотношениям
аллостерического центра фермента с эффектором, под влиянием которого изменяется третичная структура фермента и он становится неспособным связываться со своим субстратом.
Механизм описанной регуляции синтеза белка и взаимоотношения репрессора со структурными генами были доказаны в опытах с Е.соИ на примере синтеза В-галактозидазы (лактазы)
- фермента, расщепляющего молочный сахар на глюкозу и галактозу. Дикий штамм Е.соИ растет на глюкозе. Если вместо глюкозы в питательную среду добавить лактозу (новый источник энергии и углерода), то штамм не будет расти, пока не будут синтезированы соответствующие ферменты
(адаптивный синтез). При поступлении в клетку лактозы (индуктор) молекулы ее связываются с белком-репрессором и блокируют связь между репрессором и геном-оператором. При этом ген-оператор и структурные гены начинают снова функционировать и синтезировать необходимую мРНК, которая «дает команду» рибосомам синтезировать В-галактозидазу. Одновременно ген-регулятор продолжает вырабатывать репрессор, но последний блокируется новыми молекулами лактозы, поэтому синтез фермента продолжается. Как только молекулы лактозы полностью расщепляются, репрессор освобождается и, поступив в ДНК, связывает ген-оператор и блокирует синтез мРНК, а значит, синтез В-галактозидазы в рибосомах [3].
Биосинтез мРНК, контролирующий синтез белка в рибосомах, зависит, таким образом, от функционального состояния репрессора, который представляет собой тетрамерный белок с общей молекулярной массой около 150 000. Если он находится в активном состоянии, т. е не связан с индуктором, то блокирует ген-оператор и синтеза мРНК не происходит. При поступлении метаболита
- индуктора в клетку его молекулы связывают репрессор, превращают его в неактивную форму. Структурные гены выходят из-под запрещающего контроля и начинают синтезировать нужную мРНК.
Концентрация ряда ферментов в клетках резко снижается при повышении содержания отдаленных конечных продуктов, которые образуются в цепи последовательных ферментативных реакций. Такой эффект, названный репрессией ферментов, часто наблюдается при реакциях биосинтеза. В этих случаях молекулы репрессора, образующиеся в рибосомах ядра по «команде» гена-регулятора, являются неактивными и сами по себе не обладают способностью подавлять деятельность гена-оператора и, следовательно, всего оперона, но приобретают такую способность после образования комплекса с конечным или одним из конечных продуктов биосинтетического процесса.
Таким образом, концепция о механизме проявления (экспрессии) активности генов признана одним из блестящих достижений молекулярной биологии. Она явилась логическим развитием многочисленных исследований, проведенных генетиками и биохимиками в предшествующие десятилетия.
В многоклеточных организмах среднее число регуляторных сайтов для одного гена минимум равно пяти, положительные регуляторные белки связываются со своими специфическими последовательностями в структуре ДНК. Подсчитано, что в геноме человека содержится около 100 000 генов, соответственно каждая клетка при отрицательном механизме регуляции могла бы синтезировать 100 000 разных репрессоров, причем в достаточных количествах. При положительном механизме регуляции большинство генов неактивно, соответственно молекула РНК не связывается с промотором и клетка синтезирует ограниченный и
избирательный круг активаторных белков,
необходимых для инициации транскрипции.
Прекращение матричных биосинтезов ведет к гибели клетки. На этом основано применение ингибиторов матричных биосинтезов для лечения инфекционных болезней и злокачественных
опухолей. К таким ингибиторам, в частности, относятся многие антибиотики - вещества, выделяемые из микроорганизмов, главным образом из микроскопических грибов. антибиотики, взаимодействующие с ДНК, нарушают ее матричную функцию и подавляют репликацию или транскрипцию, или оба эти процесса. Их применяют для лечения злокачественных новообразований. Противоопухолевые антибиотики практически одинаково взаимодействуют с ДНК, выделенной из любых клеток, как нормальных, так и опухолевых, т. е. они не отличаются избирательностью.
Избирательность в их действии на клетки определяется не ДНК, а другими факторами, например различной проницаемостью клеточных мембран или особенностями метаболизма. Но эта избирательность не абсолютна, при лечении могут повреждаться и здоровые клетки, что требует осторожности при клиническом использовании противоопухолевых антибиотиков [4].
Одним из путей выяснения тонких молекулярных механизмов синтеза нуклеиновых кислот и белков в клетках является использование таких лекарственных препаратов, которые могли бы избирательно тормозить эти процессы у бактерий, не влияя на клетки организма человека. Действительно, некоторые препараты оказывают такое избирательное действие, взаимодействуя с белками рибосом прокариот и выключая бактериальный синтез белка. Однако многие из них являются токсичными и для человека. В настоящее время в медицинской практике применяются многие антибиотики.
Одним из мощных ингибиторов белкового синтеза является пуромицин. Он представляет собой аналог концевого участка аминоацил-тРНК адениловой кислоты и поэтому легко взаимодействует с А-центром пептидил-тРНК с образованием пептидил-пуромицина. пептидил-пуромицин не несет на себе триплета антикодона и поэтому тормозит элонгацию пептидной цепи, вызывая обрыв реакции, т.е. преждевременную терминацию синтеза белка. При помощи пуромицина было доказано, что гормональный эффект в ряде случаев зависит от синтеза белка de novo.
Белковый синтез тормозится
актиномицином D, обладающим
противоопухолевым эффектом. Однако из-за высокой токсичности препарат применяется редко. Он тормозит синтез всех типов клеточной РНК, особенно мРНК. Данное свойство объясняется тормозящим влиянием актиномицина D на ДНК-зависимую РНК-полимеразу, поскольку он связывается с остатками дезоксигуанозина цепи ДНК, выключая матричную функцию последней;
это дает основание считать, что актиномицин Б ингибирует транскрипцию ДНК.
Другим антибиотиком, тоже тормозящим синтез клеточной РНК, является используемый при лечении туберкулеза рифамицин. Этот препарат тормозит ДНК-зависимую РНК-полимеразу, связываясь с ферментом. Бактериальная РНК-полимераза оказалась наиболее к нему чувствительной. На организм животных этот антибиотик оказывает незначительное влияние. По механизму действия он резко отличается от актиномицина Б. Кроме того, рифамицин оказывает противовирусное действие, поэтому он успешно используется при лечении трахомы, которая вызывается ДНК-содержащим вирусом. Это дает основание говорить о применении в дальнейшем данного антибиотика в клинической онкологии при лечении опухолей, вызываемых вирусами.
Одним из мощных ингибиторов синтеза вирусной РНК является азидотимидин. Было показано, что вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) содержит РНК-й геном, в составе которого имеются как стандартные гены ретровирусов, так и необычные небольшие гены со множеством функций. Последние подвержены мутациям с высокой скоростью вследствие низкой точности репликации, вызванной свойствами обратной транскриптазы. Эта вирусная обратная транскриптаза иммунодефицита человека оказалась наделенной значительно большим сродством к азидотимидину, чем к природному
дезокситимидинтрифосфату (^ГТФ). Азидотимидин тормозит связывание ^ГТФ, вызывая тем самым терминацию (окончание) синтеза вирусной РНК.
Известны детали механизма действия ряда других антибиотиков, используемых при лечении тифозных инфекций. Так например, хлорамфеникол оказывает ингибирующее влияние на пептидилтрансферазную реакцию (на стадии элонгации) синтеза белка в 708 рибосоме бактерий; на этот процесс в 808 рибосоме он не действует. Тормозит синтез белка в 808 рибосоме
циклогексимид - специфический ингибитор
транслоказы.
Интересным оказался механизм действия дифтерийного токсина. Он наделен способностью катализировать реакцию АДФ-рибозилирования фактора элонгации эукариот, выключая тем самым его из участия в синтезе белка. Резистентность многих животных к дифтерийному токсину,
вероятнее всего, обусловлена трудностью или полным отсутствием проникновения токсина через мембрану клеток.
Противотуберкулезные и
антибактериальные антибиотики (в частности, стрептомицин и неомицин) действуют на белоксинтезирующий аппарат чувствительных к ним штаммов бактерий. Эти антибиотики обусловливают ошибки,а трансляции мРНК, приводящие к нарушению соответствия между кодонами и включаемыми аминокислотами: например, кодон УУУ вместо фенилаланина
начинает кодировать лейцин, в результате чего образуется аномальный белок, что приводит к гибели бактерий.
Тетрациклины, широко применяемые в клинике, также являются ингибиторами синтеза белка в 708 рибосоме. Они легко проникают через клеточную мембрану. Тетрациклины тормозят связывание аминоацил-тРНК с аминоацильным центром в 508 рибосоме.
Пенициллины не являются истинными ингибиторами синтеза белка, но их
антибактериальный эффект связан с торможением синтеза гексапептидов, входящих в состав клеточной стенки. Механизм их синтеза отличается от рибосомного механизма синтеза белка. Эритромицин и олеандомицин тормозят активность транслоказы в процессе трансляции, подобно циклогексимиду, исключительно в 808 рибосомах, т.е. тормозят синтез белка в клетках животных.
Следует отметить, что нарушение или выпадение любого звена, участвующего в синтезе белка, почти всегда приводит к развитию патологии, причем клинические проявления заболевания будут определяться природой и функцией белка, синтез которого нарушен (структурный или функциональный белок). Иногда синтезируются так называемые аномальные белки как результат действия мутагенных факторов и соответственно
изменения генетического кода. Последствия этих нарушений могут выражаться в развитии самых разнообразных синдромов или заканчиваться летально. Однако организм располагает мощными механизмами защиты. Подобные изменения генетического аппарата быстро распознаются специфическими ферментами - рестриктазами, в результате чего измененные последовательности вырезаются и вновь замещаются соответствующими нуклеотидами.
Литература
1. Березов, Т.Т., Коровкин, Б.Ф. Биологическая химия: Учебник - 3-е изд., перераб. и доп. / Т.Т.Березин, Б.Ф.Коровкин. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.
2. Каюмов, А.Р., Богачев, М.И., Михайлова, Е.О. Сравнительный анализ структуры белковых токсинов водных патогенных микроорганизмов / А.Р.Каюмов, М.И.Богачев, Е.О.Михайлова. - Вестник Казанского технологического университета № 7, 2001.
- С. 175-181.
3. Ленский, А.С. Введение в бионеорганическую и биофизическую химию: Учеб. пособие для студентов медицинских вузов / А.С.Ленский. - М.: Высш. шк., 2009. -256 с.
4. Николаев, А.Я. Биологическая химия: Учебник. - 3-е изд., перераб. и доп. / А.Я.Николаев. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. - 568 с.
© З. Н. Хисматуллина - канд. социол. наук, доц. каф. социальной работы, педагогики и психологии КНИТУ, [email protected].
