CC BY
108
УДК 591.1:612
ЭКЗОГЕННЫЕ ФАКТОРЫ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ И БИОСИНТЕЗА БЕЛКА
© 2009 А. Н. Барков1, Е. В. Трубникова2, Н. В. Стабровская3
1 аспирант каф. зоологии и теории эволюции 2 канд. биолог. наук, зав. лаб.
3аспирант каф. зоологии и теории эволюции e-mail: [email protected]
Научно-исследовательская лаборатория «Генетика»
Курский государственный университет
Представлены современные данные, характеризующие особенности изменчивости параметров функциональной активности рибосомных генов при воздействии ряда экзогенных факторов химической природы. Проанализированы структурно-функциональные характеристики
ксенобиотиков, способных оказывать модифицирующее влияние на биосинтез белка в про- и эукариотической клетках. Показаны изменения в транскрипции рибосомных генов, происходящие в живом организме на различных стадиях онтогенеза и при патологических состояниях.
Ключевые слова: рибосомные гены, биосинтез белка, транскрипция, рибосомальная ДНК (рДНК).
Наряду с эндогенными факторами регуляции транскрипции генов рРНК, исследованиями последних лет было доказано наличие ряда транскрипционно активных факторов, имеющих экзогенное происхождение. Среди последних достижений цитогенетики следует отметить также открытие ряда экзогенных факторов, способных оказывать модифицирующее влияние на общий уровень биосинтеза белка в живом организме.
Следует подчеркнуть, что выяснение вопроса экзогенной регуляции транскрипции рибосомных генов тесно связано с проблемой поиска механизмов синтеза нуклеиновых кислот и белков в клетках при использовании таких лекарственных препаратов, которые могли бы избирательно тормозить эти процессы у бактерий, не оказывая влияния на организм человека. Есть многочисленные факты, что некоторые препараты действительно обладают таким действием, однако многие из них оказываются токсичными и для человека. В настоящее время в медицинской практике применяются многие антибиотики, оказывающие действие на ключевые химические реакции синтеза белка и нуклеиновых кислот [De Pinho 2000].
Одним из мощных ингибиторов белкового синтеза является пуромицин. В результате структурного сходства с концевым остатком АМФ в аминоацил-тРНК' он легко взаимодействует с А-участком пептидил-тРНК с образованием пептидил-пуромицина. Поскольку пептидил-пуромицин не несет на себе триплета антикодона, он тем самым тормозит элонгацию пептидной цепи, вызывая обрыв реакции. При помощи пуромицина было доказано, например, что гормональный эффект в ряде случаев зависит от синтеза белка de novo. Следует указать также, что пуромицин тормозит синтез белка как у прокариот, так и у эукариот [Diebold 2001].
Белковый синтез тормозится актиномицином D, обладающим противоопухолевым эффектом, который вследствие высокой токсичности применяется редко. Он оказывает тормозящее влияние на синтез всех типов клеточной РНК, в особенности мРНК. Это свойство вызвано тормозящим влиянием актиномицина D на ДНК-зависимую РНК-полимеразу, поскольку он связывается с остатками дезоксигуанозина цепи ДНК, выключая матричную функцию последней. Можно считать, что актиномицин D ингибирует транскрипцию ДНК [Wolberger 1999].
Другим антибиотиком, также тормозящим синтез клеточной РНК, является используемый при лечении туберкулеза рифамицин. Этот препарат тормозит ДНК-зависимую РНК-полимеразу путем связывания с ферментом. Наиболее чувствительна к нему бактериальная РНК-полимераза. На организм животных этот антибиотик оказывает незначительное влияние. По механизму действия он резко отличается от актиномицина D. Следует указать на недавно открытое противовирусное действие рифамицина, в частности, он успешно используется при лечении трахомы, которая вызывается ДНК-содержащим вирусом [MacPhee 1995]. По-видимому, этот антибиотик найдет применение в лечении опухолей, вызываемых вирусами [Orphanides et al. 1996].
Выяснены механизмы действия ряда других антибиотиков, применяемых при лечении тифозных инфекций. Так, хлорамфеникол оказывает ингибирующее влияние на пептидилтрансферазную реакцию (на стадии элонгации) синтеза белка в 70S рибосоме бактерий. На этот процесс в 80S рибосоме он не действует. Противоположное тормозящее действие на синтез белка в 80S (без поражения процесса в 70S рибосоме) оказывает циклогексимид, являющийся ингибитором транслоказы [Walker 1996].
Весьма интересен молекулярный механизм действия дифтерийного токсина. Он оказался наделен способностью катализировать реакцию АДФ-рибозилирования фактора элонгации (трансляционный фактор-2, TF-2), выключая тем самым его из участия в синтезе белка. Резистентность многих животных к дифтерийному токсину обусловлена трудностью проникновения токсина через мембрану клеток [Walker 1996].
Противотуберкулезные и антибактериальные антибиотики, в частности стрептомицин и неомицин, действуют на белоксинтезирующий аппарат чувствительных к ним штаммов бактерий. Высказано предположение, что эти антибиотики вызывают ошибки в трансляции мРНК, приводящие к нарушению соответствия между кодонами и включаемыми аминокислотами; например, кодон УУУ вместо фенилаланина начинает кодировать лейцин, в результате образуется аномальный белок, что приводит к гибели бактерий [Read 1992].
Широко применяемые в клинике тетрациклины также оказались ингибиторами синтеза белка в 70S рибосоме (меньше тормозится синтез в 80S рибосоме). Они легко проникают через клеточную мембрану. Считается, что тетрациклины тормозят связывание аминоацил-тРНК с аминоацильным центром в 50S субчастице рибосомы. Возможно, что тетрациклины химически связываются с этим центром, выключая тем самым одну из ведущих стадий процесса трансляции [Read, 1992].
Пенициллины не являются истинными ингибиторами синтеза белка, однако их антибактериальный эффект связан с торможением синтеза гексапептидов, входящих в состав клеточной стенки. Механизм их синтеза отличается от рибосомального механизма синтеза белка. Эритромицин и олеандомицин тормозят активность транслоказы в процессе трансляции, подобно циклогексимиду, исключительно в 80S рибосомах, то есть тормозят синтез белка в клетках животных [Переводчикова 1996].
Следует отметить, что нарушение или выпадение любого звена, участвующего в синтезе белка, почти всегда приводит к развитию патологии, причем клинические проявления болезни будут определяться природой и функцией белка, синтез которого оказывается нарушенным (структурный или функциональный белок). Иногда
синтезируются так называемые аномальные белки как результат действия мутагенных факторов и, соответственно, изменения генетического кода (например, гемоглобин при серповидно-клеточной анемии). Последствия этих нарушений могут выражаться в развитии самых разнообразных синдромов или заканчиваться летально [Общая и медицинская... 2002]. Следует отметить, что организм располагает мощными
механизмами защиты: подобные изменения генетического аппарата быстро
распознаются специфическими ферментами - рестриктазами, измененные последовательности вырезаются и вновь замещаются соответствующими нуклеотидами при участии полимераз и лигаз [Reerce, Connors 1994].
Кроме вышеупомянутых выявленных факторов, существует множество других факторов химической природы, влияющих на уровень функциональной активности и структуру ядрышек. Так, в исследованиях Л.Е. Панина, В.Ф. Максимова и И.М. Коростылевской (1998) прослежены структурные основы кооперативного эффекта глюкокортикоидов и липопротеинов высокой плотности, приводящего к усилению биосинтеза белка в гепатоцитах. На переживающих срезах печени крыс показано, что при совместном действии оба соединения активируют экспрессию генов, о чем можно судить по усилению включения 3Н-уридина в суммарный пул РНК. Повышенное включение 14С-лейцина в белок в этих условиях свидетельствует об активации белкового синтеза [Активация... 1998].
Из факторов химической природы, влияющих на степень экспрессии рибосомных генов, следует отметить также 2,4-динитрофенол, нитрозоэтилмочевину, папаверин, которые оказывают ингибирующее действие. Противоположным эффектом обладают гормональные стимуляторы клеточного роста: такие гормоны как цитокинин и АБК оказывают активирующее воздействие на работу рибосомных генов [Гормональная. 2001].
Изменения транскрипционной активности рибосомных генов под воздействием внешних факторов происходит и в онтогенезе организма. Обнаруженные при исследовании ЯОР хромосом в эмбриональном и постэмбриональном периодах, положены в основу гипотезы о существовании наследуемой программы экспрессии РГ в индивидуальном развитии. Предполагают, что реализация этой программы может осуществляться за счет резервных «молчащих» рибосомных генов, которые, возможно, могут активироваться в связи с необходимостью интенсивного белкового синтеза. Число резервных РГ варьирует на разных акроцентрических хромосомах, и их активация может происходить неравномерно. Показано, что хромосома 21 человека по сравнению со всеми ЯО-хромосомами содержит наибольшее число «молчащих» копий рибосомных генов. А хромосома 15 проявляет как пониженную активность, так и является наиболее низкокопийной [Зайцева 1994].
В большинстве случаев, образование генных продуктов у эукариот соответствует величине дозы гена. При анализе синтетической способности РГ установлена прямая дозовая зависимость между уровнем синтеза гетерогенных РНК и количеством ДНК для эмбрионов шпорцовой лягушки Xenopus laevis [Bazett-Jones et al.
1994]. Авторадиографическими исследованиями показано, что количество синтезируемой рРНК у гаплоидных (1n) зародышей вьюна на ранних этапах развития вдвое меньше в расчете на клетку, чем у диплоидных (2n) зародышей. В то же время, известны случаи, когда количество образующегося продукта не зависело от дозы гена. Так, например, жизнеспособные гетерозиготы Xenopus laevis, несущие в одном хромосомном наборе полную делицию ядрышкового организатора (+/0 nu), синтезировали в период эмбриогенеза столько же рРНК, сколько и гомозиготы (+/+ nu). Обнаружено, что продукция дефинитивных (27S и 18S) рРНК в эмбриогенезе вьюна не зависит от степени плоидности, то есть количество новообразованных «зрелых» рРНК
на единицу ДНК у гаплоидных зародышей вдвое выше, чем у диплоидных [Read, 1992]. При этом скорости распада и процессинга рРНК были практически одинаковы в обоих генетических типах, а компенсация в образовании рДНК у гаплоидных зародышей происходила за счет высокого темпа транскрипции совокупности РГ (синтеза пре-рРНК) [Read 1992]. Подобное явление в образовании рРНК отмечено и для раннего развития зародышей форели.
В физиологических условиях количественные и функциональные характеристики генов рРНК связывают с адаптационными возможностями организма. Данных по этому вопросу еще недостаточно, и можно говорить скорее о постановке задач и перспективах подобных исследований. Тем не менее, уже показано, что в клетках морозостойких сортов озимой и яровой пшеницы в ответ на неблагоприятные температурные условия увеличивается синтез рРНК и повышается содержание рДНК. Считается, что повышение урожайности озимых сортов пшеницы связано с увеличением числа генов рРНК. Сходные данные получены и на двудольных растениях [Field 1984].
В организме человека активность рибосомных генов снижается при голодании, охлаждении и действии на клетки ингибиторов ферментов и повышается при антигенной стимуляции, использовании колониестимулирующих ростовых факторов и в ряде других жизненно важных ситуациях [Мамаев 1992].
В условиях патологии активность белоксинтезирующего аппарата клеток может изменяться по-разному [Там же]. Она повышается в тирратоцитах больных с гиперфункцией щитовидной железы, в мегакариоцитах больных иммунными тромбоцитопениями, в кардиомиоцитах при гипертрофии миокарда различного генеза, в популяциях лимфоцитов периферической крови больных с миомой матки [Болгова 1998]. С другой стороны, снижение показателя ФАРГ было отмечено в кроветворных клетках больных хроническим миелолейкозом и гемопоэтическими дисплазиями, в кардиомиоцитах больных с повышенной сердечной недостаточностью, в лимфоцитах больных с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки [Аминева 2000].
Отдельно следует рассматривать изменение активности РГ при онкологической патологии. В связи с повышением пролиферативного потенциала маглинизированных клеток, показатели ФАГР закономерно увеличиваются. У человека этот факт подтвержден на примере клеток различных опухолей: опухолей пищевода, желудка, толстой кишки, щитовидной железы, легкого, молочной железы, шейки матки, вульвы и простаты, а также на клетках пораженных лимфатических узлов при злокачественных лимфомах [Волкова 2001].
Итак, число Ag-позитивных РГ в клетках различных видов эукариот генотипически обусловлено, а у данного объекта может зависеть от типа изучаемой ткани, от уровня дифференцировки и пролиферативной активности клетки, от действия на клетку ряда биологически активных веществ - стимуляторов или ингибиторов белкового синтеза. При определенных условиях внешней среды возможно включение определенных компенсаторных механизмов, активирующих или подавляющих интенсивность транскрипции РГ.
Отдельно следует отметить наличие прямой зависимости активности транскрипции рибосомных генов от степени метилирования рДНК. Метилирование изначально вовлечено в такие фундаментальные процессы жизнедеятельности клетки, как регуляция экспрессии генов и поддержание стабильности генома. В первом случае -это стабильная репрессия транскрипции определенных генов (к примеру, гены инактивированной Х-хромосомы у самок, импринтированные гены, часть тканеспецифичных генов), во втором - регуляция процессов рекомбинации и защита генома от инвазии и распространения чужеродной информации [Ченцов 2002].
Метилирование - это природный механизм, который подавляет экспрессию на уровне транскрипции. Существует, по крайней мере, два механизма, с помощью которых метилирование может препятствовать этому процессу. Один из них заключается в прямом ингибировании связывания специфических транскрипционных факторов (c-Myc/Myn, AP-2, E2F и ATF/CREB-подобные белки), чьи сайты узнавания содержат одиночные метилированные CpG динуклеотиды. Второй механизм репрессии опосредуется через метил-CpG связывающие белки, такие как MeCP1 и MeCP2, известные также как MBD-семейство. Они не проявляют специфичности к последовательности немодифицированных нуклеотидов, но обладают высокой степенью родства к метилированной ДНК [Felli et al. 1991].
Донором метильных групп в живом организме является S-аденозилметионин; в образовании аминокислоты метионина принимают участие витамин В12, фолиевая кислота, пангамовая кислота. Из неорганических веществ метилирующими свойствами обладают йодистый метил, диметилсульфат, метилсерная кислота, метиловые эфиры органических сульфокислот, а также метанол и диметиловый эфир [Miller 1991; Moss
1995].
Имеющиеся на сегодняшний день данные о факторах экзогенной природы, оказывающих влияние на изменение экспрессии рибосомных генов в клетках эукариот, без сомнения дают основания считать, что интерес ученых к процессам регуляции активности рибосомных генов весьма высок. Такое интенсивное изучение активности рибосомных генов отнюдь не случайно - оно является архиважным для понимания механизмов синтеза белка в клетке, - одного из главнейших процессов, происходящих во всех живых организмах. Однако, несмотря на результаты исследований ученых, молекулярные механизмы, регулирующие изменения в транскрипции рибосомных генов в митозе, до сих пор остаются невыясненными.
На основе классических представлений об этапах и механизмах биологического синтеза в клетке можно выделить пять уровней экзогенной регуляции транскрипции РГ [Мушкамбаров 2GG3]:
1) геномные перестройки;
2) - 4) инициация, элонгация и терминация транскрипции;
5) посттранскрипционные превращения пре-РНК (процессинг).
Анализ имеющейся доступной литературы показал, что большинство авторов, по сути дела, рассматривает два подхода к модификации экспрессии РГ - качественный и количественный [Larson 1991]. Первый подразумевает изменение собственно функциональной активности РГ и может быть реализован за счет воздействия как на структуру РНК-полимеразы I (переход ее неактивной формы в активную), так и на пространственную организацию самой нити ДНК [Galion 1996]. Здесь речь идет об эпигенетическом контроле за степенью метилирования остатков цитозина в последовательностях 5,CрG, о возможности боковой нейтрализации фосфатных групп с помощью гистонов, индуцирующих свертывание ДНК в нуклеосомы и о возможном модифицирующем воздействии молекул вышеупомянутых противоопухолевых препаратов и других веществ на различные участки хромосом. Второй заключается в численном изменении количества транскрибируемых РГ за счет незапрограммированной амплификации, за счет изменения плоидности ядра и/или за счет исключения из генома нуклеотидных последовательностей. Оба эффекта могут быть достигнуты применением ингибиторов репликации ДНК, митогенами и канцерогенами [Mahajan 199G; Paule 1994].
Библиографический список
Активация ядрышковой ДНК и биосинтеза рибосом в гепатоцитах под влиянием глюкокортикоидов и липопротеинов высокой плотности / Л. Е. Панин, В. Ф. Максимов, И. М. Коростылевская // Цитоголия. 1998. № 5. С. 461-463.
Аминева Д.Д. Оценка качества полихимиотерапии у больных злокачественными лимфомами: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Уфа, 2000. - 22 с.
Болгова Л.С. Ядрышковые организаторы и процессе малигнизации бронхиального эпителия / Л.С. Болгова, В.И. Лобода, Т.Н. Туганова // Цитология и генетика. 1998. Т. 32. № 1. С. 79-82.
Волкова М.А. Клиническая онкогематология: рук-во для врачей. М.: Медицина, 2001. - С. 92-114.
Гормональная, световая и органоспецифичная регуляция экспрессии гена рибосомального белка S14 / Черепнева Г.Н. и др. // Вестник Башкирского университета. 2001. № 2. С. 173-175.
Зайцева Г. Н. Транскрипция генов рибосомной РНК эукариот / Г. Н. Зайцева, Е.В. Клещенко // Молекуляр. биология. 1994. № 5. С. 965.
Мамаев Н.Н. Структура и функция ядрышкообразующих районов хромосом: молекулярные, цитологические и клинические аспекты / Н.Н. Мамаев, С.Е. Мамаева // Цитология. 1992. Т. 34. № 10. С. 3-25.
Мушкамбаров Н.Н. Молекулярная биология: учеб. пособие для студентов мед. вузов / Н.Н. Мушкамбаров, С.Л. Кузнецов. М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2003. 544 с.: ил.
Общая и медицинская генетика: лекции и задачи / Г.Р. Заяц, В.Э. Бутвиловский, И.В. Рачковская, В.В. Давыдов. Ростов н/Д.: Феникс, 2002. 320 с.
Переводчикова, Н. И. Онкология. М., 1996.
Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию. М., 2002.
Bazett-Jones D. P., Leblanc B., Herfort M., Moss T. Short-range DNA looping by the Xenopus HMG-box transcription factor, xUBF // Science. 1994. № 264. Р. 1134-1137.
De Pinho R. A. The age of cancer // Nature. 2000. Vol. 408. P. 248-254.
Diebold J. World Health organization Classification of Malignant Limphomas / J. Diebold // Experimental Oncology. 2001. Vol. 23. P. 101-103.
Field D. Nucleolar silver staining patterns related to cell cycle phase and cell generation of PHA-stimulated lymphocytes // Cytobios. 1984. Vol. 41. P. 23-33.
Galion S. Oligonucleotide clonospecific probes directed against the functional sequence t(14;18): a new tool for the assessment of minimal residual disease in follicular lymphoma / S. Galion, T. Al Saati, D. Schlaifer // Br. J. Haematol. 1996. Vol. 94. N 4. P. 676684.
High Resolution Studies of the Xenopus laevis Ribosomal Gene Promotor in Vivo and in Vitro / C. Read, A. M. Larose, B. Leblank at al. // J. Biochem. 1992. Vol. 267. P. 1096110967.
High Resolution Studies of the Xenopus laevis Ribosomal Gene Promotor in Vivo and in Vitro / C. Read, A. M. Larose, B. Leblank at al. // J. Biochem. 1992. Vol. 267. P. 1096110967.
Ingeritance of ribosomal genes activity and level of DNA methylation of individual gene clusters in a three generation family / A. De Capoa, C. Aleixandre, M. P. Felli et al. // Hum. Genet. 1991. Vol. 88. N2. P. 146-152.
Larson D.E. Control points in eukaryotic ribosome biogenesis / D.E. Larson, P. Zahradka, B.H. Sells // Biochem. Cell. Biol. 1991. Vol. 69. P. 5-22.
MacPhee D. G. Mismatch repair, somatic mutations, and the origins of cancer // Cancer Res. 1995. Vol. 55. N 23. P. 5482-5492.
Mahajan P.B. Hormonal Regulation of Transcription of rRNA. Purification and characterization of the Hormone-Regulated Transcription Factor IC. / P.B. Mahajan, E.A. Thompson // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 16225-16233.
Miller O. L. The nucleolus, chromosomes, and visualization of genetic activity // J.Cell Biol., 1991, 15s-27s
Moss T.A. Promotion and regulation of ribosomal transcription in Eukaryotes by RNA polymerase 1 / T.A. Moss, V.Y. Stefanovsky // Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 1995. Vol. 50. P. 25-66.
Orphanides, G., Lagrange T., Reinberg D. The general transcription factors of RNA polymerase II // Genes Develop. 1996. Vol. 10. P. 2657-2683.
Paule M.R. In vitro evidence that eukaryotic ribosomal RNA transcription is regulated by modification of RNA polymerase I. / M.R. Paule, C.T. Iida, P.J. Peina // Nucl. Acids Res. 1994. Vol. 12. P. 8161-8181.
Reerce D. E., Connors J. M., Spinelli J. J. // Blood. 1994. Vol. 83. P. 1161.
Walker A. M. Reporting results of epidemiologic studies // Am. J. Public. Health. 1996. Vol. 76. P. 556-558.
Wolberger C. Combinatorial transcription factors // Curr. Opinion Genet. Develop. 1999. Vol. 8. P. 552-559.
