CC BY
74
ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ О ВОЗМОЖНЫХ НОВЫХ МЕХАНИЗМАХ... 17
ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ
УДК 616-006:575.117.2:577.113.3
А М. Дейчман
О ВОЗМОЖНЫХ НОВЫХ МЕХАНИЗМАХ
ОБРАЗОВАНИЯ КОРОТКИХ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ,
УЧАСТВУЮЩИХ В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОМА
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация:
Дейчман Александр Маркусович, ведущий инженер лаборатории НИИ ЭДиТО Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499)612-89-25 E-mail: [email protected]
Статья поступила: 27.04.2011, принята к печати 25.10.2011
Резюме
Рассмотрен гипотетический вариабельный механизм образования коротких олигонуклеотидных последовательностей, направляемый белковым эпитопом как матрицей (псевдоматрицей). Предполагается, что эпитоп может ориентировать набор соответствующих аминоацилированных транспортных РНК (Аа-тРНК), сближенные антикодоновые участки которых копируются (или последовательно вырезаются/сшиваются) и служат основой для образования коротких нуклеиновых последовательностей (нуклеиновых эквивалентов эпитопов, НЭ), используемых клеткой для различных целей (защитных, регуляторных, эволюционных). Предложенный механизм представляется подобным, но не тождественным т.н. гипотетическому механизму «обратной трансляции» (М. Nashi-moto, 2001), при котором соответствие между аминокислотой и всеми тремя нуклеотидами исходно кодирующего её кодона жестко детерминированы. Рассматривается возможность участия НЭ в процессах геномной изменчивости, а также в функционировании генома, принимая во внимание существование механизмов (РНК-интер-ференция), оперирующих с короткими РНК, а также недавно обнаруженные способы защиты бактериальных геномов от чужеродной ДНК, основанные на образовании коротких олигорибонуклеотидов.
Ключевые слова: геном; экспрессия генов; эпитоп; нуклеиновый эквивалент эпитопа.
A.M. Deichman
ABOUT POSSIBLE NEW MECHANISMS OF FORMATION THE SHORT NUCLEOTIDE SEQUENCES, PARTICIPATING IN REGULATION GENOME EXPRESSION
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
The hypothetical variable mechanism of short olygonucleotide sequences formation on protein's epitope as a matrix (pseudomatrix) is considered. It is supposed, that epitope can focus a set corresponding aminoacylating transport RNAs (Аа-tRNAs), juxtapose together with anticodone sites which are copied (or consecutive cut out/sew) form a basis for formation of short nucleic sequences (nucleic equivalents epitope, NE). Cells use these sequences for the various purposes (protective, regulatory, evolutionary). The suggested mechanism is similar, but not identical to so-called hypothetical mechanism «reverse translation» (M. Nashimoto, 2001): according to this hypothesis, conformity between amino acid and all three nucleotides initially coding of codone is rigidly determined. It is considered an opportunity of participation NE in processes genome variability, and also in functioning genome, considering existence of mechanisms of the RNA-interference, operating with short RNAs, and also recently found out ways of protection bacterial genomes from alien DNA, based on formation short olygoribonucleotides.
Keywords: genome, expression genes, epiope, nucleic equivalent epiope.
Введение
Выявление в последние годы так называемых коротких РНК (21-30 нуклеотидов) продемонстрировало неожиданные и непредсказуемые возможности новых способов контроля экспрессии генов и стабильности генома эукариот. Выявлены три основных типа коротких РНК: микро-РНК [35; 45], эндогенные малые интерферирующие РНК, или siRNA [30; 33] и piRNA, связываемые так называемыми Р1т белками [31]. Все эти типы РНК участвуют в регуляции экспрессии генов, а siРНК и
р1РНК направлены также на подавление экспрессии транспозонов и обеспечение стабилизации геномов. Уже совсем недавно была обнаружена защитная роль коротких РНК ^RISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats RNAs, или crRNAs) у прокариот [21; 34].
Поэтому представляет интерес рассмотреть возможности существования других, сейчас, казалось бы, невероятных, способов возникновения в клетке коротких олигорибонуклеотидов, которые могут быть использованы для аналогичных регуляторных или защитных целей.
Учитывая революцию в понимании механизмов регуляции экспрессии генов, основанную на обнаружении функций коротких РНК, представляет интерес реанимировать рассмотрение вопроса
о так называемой «обратной трансляции» («reverse translation»), т.е. о возможности синтеза олигонук-леотидных последовательностей на коротких оли-гопептидных матрицах.
Такие попытки уже предпринимались японским исследователем М. Нашимото [37], предложившим гипотетический rT-механизм (от «reverse translation») обратной трансляции небольшого, т.н. «примитивного» белка за счет перенесения (переписывания) заключенной в белковом эпитопе (олигопептиде) информации на язык нуклеотидов [37]. М. Нашимото получил с помощью T7 полимеразы (in vitro) 83-нуклеотидную последовательность
РНК с характерной структурой «головки молотка» (hammerhead; [12; 50]), содержащую несколько элементов петля/стебель. Эта последовательность обладала рибозимной эндонуклеазной активностью и содержала аргининсвязывающий домен - встроенный аптамерный конструкт, полученный ранее G.J. Connell et al. [24] (рис. 1А; показан овалом с Arg внутри). Взаимодействуя с аргинином (за счет водородных и других связей) [16], Arg-
связывающий домен мог направлять рибозимопос-редуемое самонадрезание З’-концевого кодона данной аминокислоты. Такая структура была названа автором rtRNAArg (от «reverse translation RNA»). В присутствии T4 РНК-лигазы концевой кодон rtRNAArg присоединялся к другой РНК, которая комплементарно взаимодействовала с восемью нуклеотидами свободного 5’-конца rtRNAArg с образованием 91 -нуклеотидной последовательности (рис. 1Б); далее 3’-концевая 11-нуклеотидная последовательность rtRNAArg (при 50 °С, 10 mM MgCl2) выщеплялась из 91-нуклеотидной структуры с помощью эндонуклеазной рибозимной активности с образованием 80-нуклеотидной последовательности (рис. 1В). Отщепленная РНК была названа М. Нашимото пре-мРНК, т.к. она, согласно его предположениям, могла наращиваться в результате аналогичных актов присоединения концевых кодонов от нескольких rtRNAs, каждая из которых имела домен связывания с конкретной аминокислотой олигопептида (эпитопа) и 5'-концевую последовательность (из нескольких нуклеотидов), комплементарную пре-мРНК [37]. Заметим, что используемая в эксперименте пре-мРНК (рис. 1) отличалась от структуры, предложенной автором в приведенной им схеме (рис. 2), иллюстрирующей механизм обратной трансляции.
Гипотетический механизм процесса по М. Нашимото состоял из нескольких этапов: в поочередном ковалентном связывании каждой C-концевой аминокислоты (в данном случае - аргинина) «обратно транслируемого» олигопептида
(«примитивного белка» Met-Val-...-Phe-Ile-Arg) с якорным CCA-концом пре-мРНК (рис. 2А-Б); затем 5’-GGU конец rtRNA (здесь rtRNAArg) комплементарно связывался с CCA-концом пре-мРНК (три-нуклеотидные пары могли быть и другими, но выбор CCA-конца подчеркивает эволюционную связь rtRNAArg с тРНК); одновременно домен связывания с определенной аминокислотой в rtRNA (аптамер-ный конструкт внутри rtRNAArg) связывался только с концевой аминокислотой олигопептида (рис. 2В); на следующей стадии 3’-концевой кодон rtRNAArg лигировал со стоп кодонами UAG, UGA на 3’-конце будущей мРНК (рис. 2Г); далее рибозимная
самонадрезающая активность rtRNAArg отщепляла З’-концевой кодон аргинина от rtRNAArg, оставляя его связанным со стоп-кодонами пре-мРНК (внутри StopUGA-StopUAG-CCA структуры), а rtRNAArg захватывала концевой аргинин олигопептида своим ар-гининсвязывающим доменом и покидала активный сайт (рис. 2Д); такой цикл повторялся в отношении каждой из последующих концевых аминокислот (Ile и др.; рис. 2, Е; Ж), что вело к образованию последовательности кодонов аминокислот исходного обратно транслируемого олигопептида в составе олигонуклеотида (рис. 2З). Заметим, что изображенная на рис. 1 схема отражает результат, полученный М. Нашимото непосредственно в эксперименте [37], тогда как постадийный механизм процесса обратной трансляции - целиком гипотетичный (рис. 2), за исключением реакции рибозимного самонадрезания и лигирования 3’ -концевого кодона (часть рис. 2Д).
Согласно гипотезе М. Нашимото [37], когда-то могла существовать «двусторонняя симметрия» между процессами трансляции, т.е. стандартного образования олигопептида на РНК-матрице
(РНК^белок), и т.н. «обратной трансляцией» (бе-лок^-РНК, собственно «reverse translation»), когда для образования РНК была необходима олигопеп-тидная матрица. Такая симметрия по мнению М. Нашимото [37] с окончательным формированием трансляционного, транскрипционного и репликативного аппаратов клетки, исчезла вместе с аппаратом «обратной трансляции». Однако в сильно редуцированном виде механизм поддержания «РНК/белковой симметрии» мог сохраниться.
Гипотетический механизм
вариабельной поэпитопной
обратной трансляции
Предлагаемый вариант гипотетического механизма сходен, но не тождественен механизму описанной выше «обратной трансляции». Известно, что в митохондриях (органеллах) эукариотических клеток сохраняются достаточно древние механизмы, которые могут лежать в основе эволюции молекул РНК: например, здесь функционируют интроны группы II и реакции обратного сплайсинга (ретроинтроны), ответственные за включение интрона или его фрагмента в состав мРНК [32]. К настоящему времени ретроин-троны обнаружены в небольшом количестве и только для геномов некоторых эубактерий и органелл (в основном - митохондрий грибов и пластид растений; [17]). Обнаружение необычных химических реакций в митохондриях (органеллах), например различных видов редактирования РНК [43], позволяет рассматривать исследования функционирования их геномов как источник пополнения «археологической летописи» тех событий (начиная с т.н. эпохи RNA-world [36]), которые связаны с изменчивостью РНК. В составе внутренних мембран органелл (хлоропластов, митохондрий) обнаруживаются тРНК, неотделимые от мембран даже в жестких условиях лизиса (в присутствии тритона Х-100, др. детергентов; [10]). Роль сложноорганизованных двойных мембран органелл, содержащих изменчивые гликолипопротеидные компоненты, представляется неслучайной. Именно с их участием оказываются возможными синтез белка в мембраносвязанных фракциях рибосом и тонкие ансамблевые взаимодействия расположенных на них молекул. Можно допустить, что наборы транспортных РНК (Аа-тРНК) удерживаются внутренней мембраной органелл, возможно между ее двумя двойными мембранами.
Каждая из мембран имеет толщину до 75А и межмембранную щель до 100А [1]. Этого достаточно для функционирования в примембран-ном/межмембранном пространстве L-образных Аа-тРНК, оба стебля которых достигают 70А [3]. Необходимые полимеразная, экзо-/эндонуклеазные, лигазная и другие активности присутствуют в качестве компонент репликативного, транскрипционного, трансляционного аппаратов, ферментов редактирования РНК этих органелл, а также других белков и ферментов органелл и ядра/цитоплазмы [7].
Фрагмент белка, участвующий в обратной трансляции, может быть представлен эпитопом, включающим 5-10 аминокислот (минимальная длина, значимая в большинстве иммунологических, биохимических и молекулярно-биологических исследованиях), и локализованным на внутренней, труднопроницаемой даже для малых ионов, мембране митохондрии или хлоропласта. Предполагается, что аминокислоты мембран-локализованного эпитопа одна за другой выщепляются протеазами и аминоацилируют соответствующую тРНК (рис. 3, А). Аминоацилирование ССА-конца тРНК может происходить при участии кодируемой в ядре и поступающей из цитоплазмы специфической митохондриальной аминоацил-тРНК-синтетазы, например, лизил-тРНК-синтетазы человека [5]. Этот фермент (как и предшественник специфической митохондриальной метилазы растений) также способен быть одним из факторов переноса некоторых цитоплазматических тРНК через митохондриальную мембрану [5]. Кроме того, дополнительным фактором, облегчающим аминоацилирование, может быть то, что элонгация эукариотических тРНК (с участием тРНК-нуклеотидилтрансферазы) сопровождается у разных видов варьированием длины ССА-конца (на 3-6 нуклеотидов) и спектра дополнительно включаемых нуклеотидов (CMP > AMP > UMP > GMP) [39]. Это может способствовать преодолению возможных стерических затруднений, связанных с аминоацилированием тРНК на мембране митохондрий.
Во втором случае выщепляемые протеазами аминокислоты мембран-локализованного эпитопа, поочередно сближаясь с каждой из аминокислот Аа-тРНК, способствуют ориентации вблизи себя определенного набора Аа-тРНК - за счет парных взаимодействий аминокислот эпитопа и Аа-тРНК (рис. 3Б). Пары аминокислот, известно, часто формируют сочетания различных типов белок-белковых (водородных, гидрофобных, ионных, ван-дер-ваальсовых, др.) взаимодействий [15; 46].
На рис. 3А показан вариант «переписывания» отдельного белкового эпитопа на антикодоно-вых участках набора тРНК. Эти участки L-образных тРНК, прочно локализованных на внутренней мембране (указана замкнутой кривой пунктирной линией) митохондрий (хлоропластов), в определенный момент оказываются достаточно сближенными, чтобы использоваться полимеразой в качестве матрицы, на которой далее образуется НЭ эпитопа. На рис. 3Б показано то же самое с участием Аа-тРНК. Число близко расположенных в одну стопку L-образных тРНК (Аа-тРНК) на внутренней мембране органеллы соответствует числу аминокислот эпитопа. В составе тРНК нуклеотиды антикодона образуют спиральную структуру вне основной свернутой молекулы [3]. Поскольку орга-неллы «дышат», меняя конфигурацию своих мембран, наступает момент, когда антикодоновые участки разных L-образных тРНК (Аа-тРНК) оказыва-
ются сближенными, что и является сигналом для РНК-полимеразной (см. рис. 3А-Б) или последовательного действия эндонуклеазной и лигазной (без рисунка) активностей с последующим образованием НЭ эпитопа. Полимеразная активность может осуществляться со значительно большими, чем в случае стандартных матриц, паузами.
Заметим, что для варианта механизма, допускающего последовательные вырезание и сшивку антикодоновых участков (и при участии эндонуклеазной и лигазной активностей), ближайшим аналогом является механизм вставок/делеций уриди-нов при редактировании пре-мРНК кинетопластов (митохондрий) трипаносом с участием гидовых РНК (gRNAs; [47]).
Другой аналог - описанная реакция обратного сплайсинга (в частности для самосплайсирую-щих интронов группы II [17; 41; 54]), заключающаяся в инсерции олигонуклеотида внутрь другой молекулы РНК. В любом случае для эпитопа в 5-10 аминокислот (и стольких же триплетов) может сформироваться нуклеиновый эквивалент, включающий 15-30 нуклеотидов.
Образовавшийся НЭ может использоваться клеткой для осуществления защитной и регуляторной функций, а также как инструмент эволюционной изменчивости при перенесении его копий в разные участки генома.
Можно предположить, что функционирование известных коротких (20-30 нуклеотидов) РНК и их воздействие на мРНК-мишени [13] подвержены регулированию за счет комплементарных взаимодействий с олигонуклеотидами НЭ. Короткие 20-30-нуклеотидные РНК, как известно, контролируют экспрессию значительной части генов (белков, др.) [6; 27; 38]. Длина гипотетически ретранслируемых с белкового эпитопа нуклеотидных отрезков (~15-30 нуклеотидов) соответствует размеру зрелых коротких РНК, а также длине т. н. редактируемых кассет (14-29 нуклеотидов) внутри фрагментов мРНК/пре-мРНК митохондрий [52], ядра [14], хлоропластов [23] (при различных видах редактирования РНК in vitro), и информационного участка в составе направляющих редактирование «гидовых»-РНК (gRNAs), направляющих U-
делеции/вставки в пре-мРНК кинетопластов трипаносом. Предлагаемый механизм воспроизводства НЭ может связывать работу ядерного и митохондриального геномов, т.е. быть источником периодического пополнения такими отрезками ядерного и митохондриального геномов.
Необходимо учесть, что каждая аминокислота эпитопа может соединиться не только с одноименной тРНК (см. рис. 3А [9]), и не с одним вариантом Аа-тРНК при парном взаимодействии аминокислот эпитопа и Аа-тРНК (см. рис. 3Б). Ошибки
(1) при аминоацилировании (связанные, в частности, с РНК-редактированием антикодона тРНК и/или фермента Аа-тРНК-синтетазы [42]; см. рис. 3А), и отсутствие жестко комплементарных взаимодействий (2) между отдельными аминокислотами (см. рис. 3Б), обычно характерных для уотсон-криковских пар нуклеотидов, может быть источником вариабельности образуемых НЭ.
В состав тРНК, включая участок антикодона, входят и нестандартные нуклеотиды, например псевдоуридин, который в первом положении антикодона некоторых митохондриальных тРНК позволяет декодировать несколько антикомплементарно взаимодействующих с ним кодонов одной аминокислоты [6].
20 ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ О ВОЗМОЖНЫХ НОВЫХ МЕХАНИЗМАХ...
Рис.1. Основные шаги обратной трансляции по М. Нашимомто [37].
А-В: Прямоугольники и стрелка показывают, соответственно, аргининовый кодон и сайт надреза в ham-merhead-рибозиме. Аргинин способен связываться с rtRNAArg (показан овалом с Arg внутри) (с любезного разрешения М. Нашимомто).
Рис. 2 Модель гипотетического rT-механизма по М.Нашимото [37]. Каждая аминокислота и каждый кодон обозначены (детали см. в тексте), соответственно, кружком или прямоугольником (с любезного разрешения М. Нашимомто).
22 ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ О ВОЗМОЖНЫХ НОВЫХ МЕХАНИЗМАХ...
ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ О ВОЗМОЖНЫХ НОВЫХ МЕХАНИЗМАХ... 23
Рис. 3. Два варианта «переписывания» отдельного белкового эпитопа в его НЭ; наборы тРНК (А) и Аа-тРНК (Б) локализованы на внутренней мембране митохондрий.
А: переписывание происходит на сближенных антикодоновых участках набора Ь-образных тРНК, ами-ноацилируемых аминокислотами, выщепляемыми из эпитопа.
Б: переписывание происходит на сближенных антикодоновых участках набора исходно аминоацилиро-ванных Ь-образных Аа-тРНК.
1, 2, 3 .. .7 - аминокислоты эпитопа; Ф (стрелка в виде змейки) - место действия пептидазной активности (возможно, и для рис. Б); 1’, 2’, 3’ .7’ - аминокислоты в составе Аа-тРНК.
Другой нестандартный нуклеотид, кьюозин ^), образующийся в результате действия локализованной на поверхности митохондрий тРНК-гуанинтрансгликозилазы, может включаться в состав антикодоновых петель [18] цитоплазматических тРНК (некоторых эукариот и эубактерий). Присутствие нестандартных нуклеотидов - второй источник вариабельности образуемых НЭ.
Набор митохондриальных тРНК резко снижен (у животных и грибов до 20-22, у высших растений до 27 тРНК) по сравнению с кодируемым в ядре цитоплазматическим набором тРНК (всего 37 генов тРНК, из них 32 - не амплифицированы; заметим, что в хлоропластах присутствует аналогичный цитоплазматическому набор генов тРНК; [7; 11]). Аминокислоты (за исключением метионина и триптофана) кодируются более чем одним кодоном (код вырожден); каждая аминокислота «обратно транслируемого» эпитопа может быть переписана в нуклеотиды другого своего кодона. Кроме того, как в случае лизил-тРНК-синтетазы человека [5], возможен перенос в митоходрии (или закрепление на мембране) цитоплазматических тРНК. Это третий источник вариабельности образуемых НЭ.
Таким образом, НЭ белкового эпитопа может быть переписан неоднозначно, что обеспечивает вариабильность НЭ.
Заметим, что при обратной транскрипции, обеспечиваемой одним ферментом, перечисленных источников вариабельности при воспроизведении ДНК из РНК нет (за исключением случая, когда в РНК включается нестандартный нуклеотид, не редактируемый обратной транскриптазой, и ошибок самого фермента).
Различают линейные и конформационные эпитопы белков. Первые нарезаются различными протеазами/протеиназами клетки (протеасом, лизо-сом, фаголизосом).
Конформационные эпитопы как менее устойчивые могут быть предварительно фиксированы за счет образования белок-белковых (и других) сшивок, производимых различными ферментами (трансглутаминазой, лизил-оксидазой, др.), свободными радикалами и химически активными соединениями. При этом стабильность линеаризированных конформационных эпитопов, которые, как и линейные эпитопы, используются иммунной системой (при ответе), увеличивается.
Синтез различных вариантов нуклеиновых эквивалентов (НЭ) происходит с каждого отдельного эпитопа, поэтому описываемый гипотетический процесс назовем вариабельной Поэпитопной Обратной Трансляцией (вПОТ). Регуляция последовательности реакций вПОТ-механизма может осуществляться в специальной мультиферментной частице - т.н. «ретранслосоме», включающей эпитоп, тРНК (Аа-тРНК) и необходимые ферментативные активности, обеспечиваемые белками (и, не исключено, рибозимами или ДНК-зимами).
Эта частица, предполагается, функционирует в связи с внутренней мембраной митохонд-рий/хлоропластов, с которой связана часть рибосом органелл. Сформированный НЭ может встроиться в РНК с помощью механизма, функционирующего при обратном сплайсинге [17; 54], и транспортироваться как внутри клетки, так и между клетками.
Также возможно связывание олигонуклеотида (НЭ) или более длинной нуклеиновой последовательности (с НЭ внутри) с белками с образованием транспортируемого нуклеопротеидного комплекса. Заметим, что аналоги внутри- и межклеточ-
ной передачи нуклеиновых последовательностей (РНК, ДНК) между ядром, цитоплазмой, митохондриями (внутри одного и между разными организмами) уже показаны: у бактерий, дрожжей (трансмембранный перенос плазмид) [1; 7]; трипаносом (транспорт цитоплазматических тРНК в митохондрии) [47]; насекомых (транспорт РНК через цитоплазматическую мембрану яйцеклетки) [6]; высших растений (транспорт плазмиды-ЦМС, цитоплазматической мужской стерильности, из митохондрии в ядро [11]); систем растения-^-насекомые-^-позво-ночные (двунаправленный перенос РНК-вирусов)
[2]. Для некоторых нуклеиновых кислот и вирусов показана высокая вероятность трансмембранного переноса через митохондриальные поры многоклеточных организмов в результате электроиндуциро-ванного импульсного пробоя [4; 55].
Показана разная степень интенсивности естественного и экспериментального переноса тРНК через мембрану митохондрий у различных видов (простейших, дрожжей, высших растений, животных; [5]).
Вероятность существования механизмов гипотетической вПОТ (в митохондриях) и передачи нуклеиновых последовательностей между ДНК-содержащими клеточными органеллами усиливается в связи со следующими фактами:
1. Отдельные РНК-, ДНК- и смешаные
РНК/ДНК-олигонуклеотиды способны
многократно усиливать репарацию (гомологичной рекомбинацией или соединением негомологичных концов) двуни-тевых разрывов в хромосомальной ДНК дрожжей_X свгвУ1&'1ае [49] (не прямо, а через кДНК-интермедиат этих олигонуклеотидов, опосредуемый активностью обратной транскриптазы цитоплазматических Ту-частиц);
2. Значительное число отдельных и не-
сколько рядом расположенных рибонук-леотидов обнаружены в предварительно образующих РНК/ДНК-гибридные дуплексы тяжелой/основной (Н) и, главным образом, в легкой/отстающей (Ь) нитях реплицируемой (и, в меньшей степени, в нереплицируемой) митохондриальной
ДНК млекопитающих (крысы, мыши, человека) [53];
3. Обычные ДНК-зависимые-ДНК-полиме-разы обладают ограниченной активностью обратной транскриптазы: у дрожжей это а- и, главным образом, 5-полимеразы [49], а у млекопитающих это Ро1-С и некоторые другие полимеразы [53]; РНК-синтез могут обеспечивать и РНК-зависимые-РНК-полимеразные (ЫОЫР) активности. Названные рибонуклеотиды и активности могут быть связаны с функционированием в митохондриях предлагаемого гипотетического механизма. Тогда природа рибонуклеотидов, включаемых в О/Ь-нити митохондрий, и праймерные затравки, необходимые для синтеза отстающей ДНК-нити (Ь), не исключено, скорее связаны с системно действующим специальным механизмом (таким, как вПОТ), чем с хаотично вос-прозводимыми суммарными продуктами протекающих в органелле процессов транскрипции, процессинга/деградации РНК, на которые ссылаются авторы [53].
Изменчивость генов иммуноглобулинов
и образование
нуклеиновых эквивалентов эпитопа
Известно, что при экспрессии перестроенных генов иммуноглобулинов обнаруживают, во-первых, редактирование РНК/ДНК, сопровождаемое класс-переключающими рекомбинациями и соматическими гипермутациями. Эти изменения осуществляются активационно-индуцируемой А1О-цитидиндезами-назой (С^-иМС^^и переходы в РНК и ДНК) и группой тесно связанных цитидиндезаминаз семейства АРОВЕС3 (прежде всего, АРОВЕСЗС/Р, действующих предпочтительно при ДНК-рекомбинацион-ных и ДНК-репаративных процессах). Эти ферменты, как и редактирующие РНК (А^Т) аденозиндеза-миназы семейства АОАКз, по-видимому, играют важную роль в эволюционно связанных адаптивном и врожденном иммунных ответах против ретровирусов и ретротранспозонов. Кроме того, АГО-ци-тидиндезаминаза способствует предотвращению онкогенной трансформации лимфоцитов, в частности вирусом лейкоза Абельсона (АЬ-МЬУ) у мышей [20; 25; 26].
Изменчивость генов иммуноглобулинов может также осуществляться за счет встройки коротких нуклеотидных последовательностей предшественника микро-РНК или зрелой микро-РНК. Внутри локуса тяжелой цепи перестроенных генов иммуноглобулинов обнаруживают вставки последовательностей недопроцессированных (88 п.н.) и зрелых (22 п.н.) микро-РНК (ш1Ы-125Ь-1) [48]. Можно предполагать, что гипотетический механизм вариабельной поэпитопной обратной трансляции (вПОТ) может функционировать в клетках иммунной системы. Размер микро-РНК (~22 нуклеотида) соответствует размеру гипотетических НЭ и демонстрирует потенциальную возможность НЭ участвовать в изменчивости нуклеотидной последовательности генома. Такая изменчивость не будет ограничиваться только изменением отдельных нуклеотидов.
Не исключено, что антигенпрезентирующая клетка (АПК) может процессировать чужеродный антиген (АГ) не только для обеспечения презентации АГ, когда на поверхности АПК выставляется фрагмент АГ в паре с АГ гистосовместимости Г или ГГ классов, но и для воспроизводства нуклеинового эквивалента эпитопа.
Эпитоп АГ может ретранслироваться в один из вариантов олигонуклеотида (НЭ), который встроится в РНК ретротранспозона. В составе рет-ровирусподобных частиц, или в виде ДНК эквивалента, НЭ может быть перенесен в разные участки генома и в другие клетки. Межклеточный перенос, в процессе специфического иммунного ответа, возможен при тесном физическом контакте, возникающем, как известно, сначала между АПК и Т-клеткой, а затем между Т-клеткой и низкодифференцированной клеткой-предшественницей в костном мозге (и, возможно, тимусе).
Создавая изменчивость генома, образование НЭ может вести к появлению мутаций/гипермутаций в генах иммуноглобулинов, т. е. в антителах и рецепторах В- и Т-клеток зрелых лимфоцитов -дифференцированных потомках НДП-клеток.
Заключение
Мы предположили существование механизма вариабельной поэпитопной обратной трансляции, генерирующей короткие РНК. Теперь известно, что короткие РНК (21-27 нуклеотидов) участвуют в са-
мых разных биологических процессах, обеспечивающих с помощью вариантных механизмов РНК-интерференции важнейшие биологические процессы у эукариот: развитие организмов, иммунный ответ и апоптоз, контоль за раковым перерождением, поддержание стволовых клеток [8; 44; 48]. Еще несколько лет назад никто не представлял возможности существования таких способов регуляции. В этом контексте можно рассмотреть и вероятность существования предложенного гипотетического механизма образования коротких РНК, особенно, если учесть сенсационное недавнее открытие коротких РНК в геномах прокариот, обеспечивающих защитную функцию около 40 % бактерий и почти всех архебактерий от размножения чужеродной ДНК (плазмид и фагов). Этот механизм основан на функционировании локусов CRISPR (clustered regularly
interspaced short palindromic repeats), включающих почти идентичные регулярно расположенные повторы (21-47 н.п.), перемежающиеся спейсерами (20-72 н.п.), очень сильно различающимися по нуклеотидной последовательности [21; 22; 34]. Спейсеры содержат последовательности, комплементарно гомологичные разным чужеродным ДНК (фагам, плазмидам, транспозирующим элементам), и их разнообразие и частота свидетельствуют о множественности актов инфицирования данной бактерии разными фагами. Локусы CRISPR транскрибируются с образованием длинного предшественника РНК (пре-РНК), который процессируется с образованием коротких (около 40 нуклеотидов) РНК, содержащих спейсерные последовательности. К локусам CRISPR прилегают гены, кодирующие нуклеазы и РНК-связывающие белки [19; 21], участвующие в процессировании пре-РНК и деградации чужеродной ДНК. Предполагается, что в составе комплексов этих белков находятся процессированные спейсерные последовательности, узнающие комплементарные последовательности чужеродной ДНК [29], т.е., предположительно, имеют место комплементарные ДНК-РНК взаимодействия - в отличие от РНК-РНК взаимодействий при РНК-интерференции (эукариот). Остается загадкой, каким образом спейсерные последовательности включаются в состав локусов CRISPR и почему они не взаимодействуют с ДНК прокариота-хозяина [28; 51].
Таким образом, короткие РНК, обладающие удивительными регуляторными и защитными функциями, обнаружены у эукариот и прокариот (средняя длина 20-30 нуклеотидов). Механизмы регуляции экспрессии генома с помощью этих РНК
- различны: РНК-интерференция у первых, и подавление экспрессии чужеродной ДНК у вторых (соответственно РНК/РНК и РНК/ДНК типы интерференции и комплементарных взаимодействий). Различны и филогенетически не связаны белковые компоненты комплексов, процессирующих образование коротких РНК эукариот и прокариот [52].
Предполагается, что олигонуклеотиды (НЭ), воспроизводимые гипотетическим механизмом вПОТ, комплементарно взаимодействуют как с короткими РНК, так и с их мишенями, и поэтому могут участвовать как в регуляторной, так и в защитной функциях клетки. Последние несколько лет каждый год приносит новые результаты, расширяющие представления о сфере функций коротких РНК. Если несколько лет назад здесь доминировали микро-РНК, то на сегодняшний день выявляется массированная регуляторная роль р1РНК [40], механизм биогенеза которых, принципиально отличный от известного для микро-РНК, остается невыясненным.
Приведенный пример функционирования СИБРК локусов показывает существование удивительно динамичной адаптивной защитной системы прокариот, основанной на приобретении генов, кодирующих короткие РНК. Рассмотренные примеры функционирования коротких РНК, с нашей точки зрения, заставляют по-новому, без предубеждений, взглянуть на выше предложенные варианты механизмов «обратной трансляции» (РНК/белковой симметрии), результатом которой может быть образование коротких олигонуклеотидов.
Литература
1. Альбертс Б, Брэй Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки (пер. с англ.; ред. Дж. Уотсон). -М.: Мир, 1987. - Т.3. - С. 105.
2. Бишоп Д., Эмерсон СУ. Рабдовирусы и буньявирусы. Вирусология (пер. с англ.; ред. Филдс Б.Н., Кнайп Д.М.). - М.: Мир, 1989. - Т.2. - С. 366-445.
3. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот (пер. с англ.; ред. Вайнштейн Б.К.).
- М.: Мир, 1987. - 584 с.
4. Зоров Д.Б. Митохондриальный транспорт нуклеиновых кислот. Участие бензодиазепинового рецептора // Биохимия. - 1996. - Т. 61, №7. - С. 1320-32.
5. Колесникова О А, Энтелис Н.С., Крашенинников И А, Мартен Р.П., Тарасов И А. Импорт тРНК в митохондрии // Успехи биологической химии. - 2004. - Т.44. - С. 53-78.
6. Корочкин Л.И. Биология индивидуального развития. - М.: изд. МГУ, 2002. - 263 с.
7. Кузьмин Е.В., Зайцева Г.Н. Организация и экспрессия митохондриального генома. - М.: ВИНИТИ. Итоги Науки и Техники, 1987. - Т. 6. - С. 15-55.
8. Рязанский С.С., Гвоздев В А. Короткие РНК и канцерогенез//Биохимия. - 2008. - Т. 73, № 5. - С. 640-55.
9. Спирин А.С. Молекулярная биология. - М.: «Высшая школа», 1986. - 303 с.
10. Филиппович И.И, Ноздрина В.Н., Светелукин В.В, Опарин А.П. Изучение локализации транскрипционной и трансляционной систем в тонких структурах хлоропластов при гранообразовании. Молекулярная генетика митохондрий (ред. Нейфах С.А., Трошин А.С.). - Л.: Наука, 1977. - С. 11-20.
11. Юрина Н.П., Одинцова М.С. Сравнительная характеристика структурной организации геномов хлоропластов и митохондрий растений // Генетика. - 1998. - Т. 34, № 1. - С. 5-22.
12. Ausländer S., Ketzer P, Hartig J.S. A ligand-dependent hammerhead ribozyme switch for controlling mammalian gene expression // Mol. Biosyst. - 2010. - 6(5). - P. 807-14.
13. Babiarz J.E., Blelloch R. Small RNAs - their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells // Internet StemBook. The Stem Cell Research Community (Eds. Kevin E., Daley G.). - 2009. -doi/10.3824/stembook. 1.47.1.
14. Baskus J.W., Smith H.C. Specific 3' sequences flanking a minimal apolipoprotein B (apoB) mRNA editing 'cassette' are critical for efficient editing in vitro // BBA. - 1994. - 1217(2). - P. 65-73.
15. Biro J.C. A novel intra-molecular protein-protein interaction code based on partial complementary coding of co-locating amino acids // Med Hypotheses. - 2006. - 66(1). - P. 137-42.
16. Blachnio K., Przykorska A. Specific arginine mediated RNA recognition// Postepy Biochem. - 2005. - 51(3). -P. 339-44.
17. Boeke J.D. The unusual phylogenetic distribution of retrotransposons: a hypothesis // Genome Res. - 2003. -13(9). - P. 1975-83.
18. Boland C., Hayes P, Santa-Maria I. et al. Queuosine formation in eukaryotic tRNA occurs via a mitochondria-localized heteromeric transglycosylase // J. Biol. Chem. - 2009. - 284(27). - P. 18218-27.
19. Bolotin A., Quinquis B, Sorokin A., Ehrlich S. D. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin //Microbiology. - 2005. - 151. - P. 2551-61.
20. Brad R., Rosenberg F., Papavasiliou N. Beyond SHM and CSR: AID and related cytidine deaminases in the host response to viral infection // Advances in Immunology. - 2007. - 94. - P. 215-44.
21. Brouns S.J.J., Jore M.M., M., Lundgren E.R. et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes // Science. - 2008. - 321(5891). - P. 960-4.
22. Chakraborty S., Snijders A.P., Chakravorty R. et al. Comparative network clustering of direct repeats (DRs) and cas genes confirms the possibility of the horizontal transfer of CRISPR locus among bacteria // Mol. Phy-logenet. Evol. - 2010. - 56(3). - P. 878-87.
23. Chaudhuri S., Maliga P. Sequences directing C to U editing of the plastid psbL mRNA are located within a 22 nucleotide segment spanning the editing site // EMBO J. - 1996. - 15(21). - P. 5958-64.
24. Connell G.J., Illangesekare M., Yarus M. Three small ribooligonucleotides with specific arginine sites // Biochemistry. - 1993. - 32. - P. 5497-502.
25. Eto T., Kinoshita K., Yoshikawa K. et al. RNA-editing cytidine deaminase Apobec-1 is unable to induce somatic hypermutation in mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2003. - 100(22). - P. 12895-8.
26. Hamilton C.E., Papavasiliou FN, Rosenberg BR. Diverse functions for DNA and RNA editing in the immune system // RNA Biol. - 2010. - 7(2). - P. 220-8.
27. Ionov Y, Peinado M.A., Malkhosyan S. et al. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis // Nature. - 1993. - 363(6429). - P. 558-61.
28. KarginovF.V., Hannon G.J. The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea // Mol. Cell. - 2010. - 37(1). - P. 7.
29. Koonin E.V., Wolf Yu. I. Is evolution Darwinian or/and Lamarckian? // Biol. Direct. - 2009. - 4. - P. 42.
Автор выражает признательность и благодарность академику РАН В А. Гвоздеву за тщательные смысловую и стилевую правки статьи, профессору АЮ. Барышникову - за постоянное содействие автору в выполнении работы данного направления, а также М. Нашимото - за предоставление возможности публикации рисунков 1 и 2.
Работы автора по тематике можно найти на сайте (http://amdeich-var-reverse-translation.ruA.
30. Laitala-Ltinonen T. Update on the development of microRNA and siRNA molecules as regulators of cell physiology // Recent Pat DNA Gene Seq. - 2010. - 4(2). - P. 113-21.
31. Lakshmi S.S., Agrawal S. piRNABank: a web resource on classified and clustered Piwi-interacting RNAs // Nucleic Acids Res. - 2008. - 36. - (Database issue): D173-177.
32. Lambowitz A.M., Zimmerly ^S. Mobile group II introns// Annu. Rev. Genet. - 2004. - 38. - P. 1-35.
33. Liu Q., Paroo Z. Biochemical principles of small RNA pathways // Annu. Rev. Biochem. - 2010. - 79. - P.
295-319.
34. Marraffini L.A., Sontheimer E.J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA // Science. - 2008. - 322(5909). - P. 1843-5.
35. Megraw M., Sethupathy P., CordaB., Hatzigeorgiou A.G. miRGen: a database for the study of animal microRNA genomic organization and function // Nucleic Acids Res. - 2007. - 35 (Database issue): D149-D155.
36. Meli M., Albert-Fournier B., MaurelM.C. Recent findings in the modern RNA world // Int. Microbiol. - 2001.
- 4(1). - P. 5-11.
37. Nashimoto M. The RNA/protein symmetry hypothesis: experimental support for reverse translation of primitive proteins // J. Theor. Biol. - 2001. - 209. - P. 181-7.
38. Perucho M. Tumors with microsatellite instability: many mutations, targets and paradoxes // Oncogene. -2003. - 22(15). - P. 2223-5.
39. ReichertA.S., MorlM. Repair of tRNAs in metazoan mitochondria // Nucleic Acids Res. - 2000. - 28(10). - P. 2043-8.
40. Rigoutsos I. Short RNAs: how big is this iceberg? // Current Biology. - 2010. - 20(3). - R110-R113. (doi:10.1016/j.cub.2009.12.036).
41. Roitzsch M., Pyle A.M. The linear form of a group II intron catalyzes efficient autocatalytic reverse splicing,
establishing a potential for mobility // RNA. - 2009. - 15(3). - P. 473-82.
42. Rubio M.A., Pastar I., Gaston K.W. et al. An adenosine-to-inosine tRNA-editing enzyme that can perform C-to-U deamination of DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2007. - 104(19). - P. 7821-6.
43. Shields D.C., Wolfe K.H. Accelerated evolution of sites undergoing mRNA editing in plant mitochondria and chloroplasts // Mol. Biol. Evol. - 1997. - 14(3). - P. 344-9.
44. Shimabe M., Goyama S., Watanabe-Okochi N. et al. Pbx1 is a downstream target of Evi-1 in hematopoietic stem/progenitors and leukemic cells // Oncogene. - 2009. - 28(49). - P. 4364-74.
45. Shivdasani R.A. MicroRNAs: regulators of gene expression and cell differentiation // Blood. - 2006. -108(12). - P. 3646-53.
46. Siemion I.Z., Cebrat M., Kluczyk A. The problem of amino acid complementarity and antisense peptides //
Curr. Protein Pept. Sci. - 2004. - 5(6). - P. 507-27.
47. Simpson L., Maslov D.A., Blum B. RNA editing in Liechmania mitochondria. RNA editing. The alteration of protein coding sequences of RNA (Ed. Benne R.). - London: Ellis Horwood Ltd, 1993. - P. 53-85.
48. Sonoki T., Iwanaga E., Mitsuya H., Asou N. Insertion of microRNA-125b-1, a human homologue of lin-4, into a rearranged immunoglobulin heavy chain gene locus in a patient with precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia // Leukemia. - 2005. - 19. - P. 2009-10.
49. Storici F., Bebenek K., Kunkel Th.A. et al. RNA-templated DNA repair // Nature. - 2007. - 447(7142). - P. 338-41.
50. Symons R.H. Small catalytic RNAs // Annu. Rev. Biochem. - 1992. - 61. - P. 641-71.
51. Van der Oost J., Jore M.M., Westra E.R. et al. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes // Trends Biochem. Sci. - 2009. - 34(8). - P. 401-7.
52. Visomirski-Robic L.M., Gott J.M. Insertional editing of nascent mitochondrial RNAs in Physarum // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - 94(9). - P. 4324-9.
53. Yang M.Y., Bowmaker M., Reyes A. et al. Biased Incorporation of Ribonucleotides on the Mitochondrial L-Strand Accounts for Apparent Strand-Asymmetric DNA Replication // Cell. - 2002. - 111. - P. 495-505.
54. Zhuang F., Mastroianni M., White T.B., Lambowitz A.M. Linear group II intron RNAs can retrohome in eukaryotes and may use nonhomologous end-joining for cDNA ligation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2009. -106(43). - P. 18189-94.
55. Zorova L.D., Krasnikov B.F., Kuzminova A.E. et al. Virus-induced permeability transition in mitochondria // FEBS Letters. - 2000. - 466. - P. 305-9.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. H.H. БЛОХИНА РАМН
