CC BY
18
УДК 628.358
Пустынская А.С., Побережный Д.Ю., Калёнов С.В.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СОСТАВА СРЕДЫ И УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ СИНТЕЗА ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ
Пустынская Алеся Сергеевна, студентка 2 курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Побережный Даниил Юрьевич, аспирант факультета биотехнологии и промышленной экологии, d.poberezhniyi@gmail.com;
Калёнов Сергей Владимирович, д.т.н, доцент кафедры биотехнологии; 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20.
В настоящей работе представлено влияние температуры, рН и аэрации на синтез экзополисахаридов тремя метилотрофными бактериями. Наибольший выход ЭПС был достигнут при рН среды равном 5,5 и температуры культивирования 34°С. Интенсивная аэрация способствовала большему накоплению экзополисахаридов в случае штамма П-1. Культура 2м продуцировала большие количества ЭПС при более низкой аэрации. В результате постановки отсеивающего эксперимента было установлено, что наибольшее влияние на накопление ЭПС оказывают нитраты, соли аммония и кальция.
Ключевые слова: метилотрофные бактерии, экзополисахариды, синтез биополимеров, метанол, оптимизация культивирования
STUDY OF THE EFFECT OF THE COMPOSITION OF THE MEDIUM AND THE CONDITIONS OF CULTIVATION OF METHYLOTROPHIC BACTERIA FOR THE SYNTHESIS OF EXOPOLYSACCHARIDES
Pustynskaya A.S., Poberezhniy D.Y., Kalenov S.V.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
This paper presents the effect of temperature, pH, and aeration on the synthesis of exopolysaccharides by three methylotrophic bacteria. The highest yield of EPS was achieved at a medium pH of 5.5 and a cultivation temperature of 34°C. Intensive aeration contributed to a greater accumulation of exopolysaccharides in the case of strain P-1. Culture 2m produced large amounts of EPS at lower aeration. As a result of the screening experiment, it was found that nitrates, ammonium and calcium salts have the greatest effect on the accumulation of EPS.
Keywords: methylotrophic bacteria, exopolysaccharides, synthesis of biopolymers, methanol, the optimization of culture
Введение
Метилотрофные бактерии — это разнообразная группа организмов, способных расти на восстановленных углеродных субстратах без углерод-углеродных связей (^-соединениях) и использовать их как источник углерода и энергии. Примером таких одноуглеродных субстратов является метанол, кроме того, некоторые из них способны потреблять метан, метансульфонат, метилированные амины,
галогенированные углеводороды и некоторые другие -соединения [1].
Рост бактерий на метане и метаноле был впервые описан почти столетие назад. Тем не менее, эта область долго не исследовалась с точки зрения практического применения. Интерес к метилотрофам заметно вырос в последнее время в связи с активным исследованием путей метаболизма метанола. Но то, что данные микроорганизмы имеют большой потенциал для промышленного применения, известно уже давно [2]. Особый интерес представляют метилотрофы, способные синтезировать
экзополисахариды (ЭПС).
Бактериальные ЭПС являются важнейшими продуктами промышленной биотехнологии, востребованность которых определяется их уникальными физико-химическими свойствами, такими как высокая вязкость растворов, способность к
гелеобразованию, псевдопластичноть [3]. Их синтез способны осуществлять многие группы микроорганизмов, однако метилотрофные бактерии, утилизирующие непищевые доступные соединения в качестве источника углерода и энергии, имеют определенные технологические и экономические преимущества [4]. В связи с чем, поиск новых метилотрофов - продуцентов ЭПС является актуальной задачей.
Известно, что на синтез экзополисахаридов микроорганизмами оказывают влияние различные физические и химические факторы, например кислотность питательной среды, аэрация, природа источника углерода и азота, температура, культивирования, и т. д [5]. Таким образом, целью данной работы являлось изучения влияния условий культивирования и состава питательной среды на синтез экзополисахаридов метилотрофными бактериями.
Экспериментальная часть
В качестве материала для выделения продуцентов ЭПС были взяты образцы проб из пещеры около озера Рица, а также пробы почвы в окрестностях города Пицунда, Абхазия. Из накопительных культур, полученных из данных образцов, был отобран ряд изолятов метилотрофных бактерий, чьи колонии отличались высокой степенью ослизненности. Для
дальнейшей работы были выбраны 3 наиболее перспективные культуры: 2м, 3 м и П-1.
Для культивирования метилотрофных бактерий использовали минеральную среду состава (г/л): (Лг^4)=504 -0,5, КХО- -0,5, Мд50Л -1, СаС1- -0,002, №С1 - 0,5, КС1 - 0,15, дрожжевой экстракт - 0,2, пируват натрия - 0,2 КН^-0,54, ЛагЯР0д-О,58, раствор микроэлементов для среды ЛМБ [6] - 2 мл/л. В качестве источника углерода в среду вносилось 2,5 мл/л метанола и 2,5 мл/л глицерина. Бактерии выращивали в колбах объемом 250 мл на термостатируемом шейкере при 180 об./мин и 30 С в течение 1-3 суток. Оптическую плотность культуральной жидкости измеряли на фотоэлектроколориметре при длине волны равной 540 нм. Концентрацию экзополисахаридов определяли фенол-сернокислотным методом, при длине волны 490 нм [7].
На первом этапе работы было изучено влияние условий культивирования на рост и синтез ЭПС культурами 2м и П-1.
При определении влияния начального значения рН ростовой среды на синтез экзополисахаридов было установлено, что наибольший выход ЭПС в исследуемом диапазоне достигается при начальном рН культуральной жидкости равной 5,5 (рис.1), что подтверждается экспериментальными данными [8].
1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 О
средней интенсивности, а для культуры П-1 при низком уровне аэрации (рис. 3).
■V 45
и
и
о Я и
О
гт; ¡4
CJ
и
I Ё о
/
5,5
—i—
6,5
-1—
7,5
рН
0,3 0,2 0,1 О
и
U.
О
С ■1
О 1
S _ . . 2
5
сс
& - • - 3
и э ........ 4
к
о
м
8,5
Рис. 1. Влияние рН на прирост биомассы и синтез ЭПС метилотрофными бактериями: 1 - прирост биомассы культуры 2м; 2 - прирост биомассы культуры П-1; 3 - синтез ЭПС культурой 2м; 4 - синтез ЭПС культурой П-1.
Для изучения влияния температуры на рост метилотрофных бактерий и накопление ЭПС производили культивирование при 30, 34 и 38 С. Установлено, что оптимальной для синтеза ЭПС для обоих штаммов является температура 34 °С, эта же температура способствует и лучшему росту исследуемых бактерий (рис. 2).
Помимо температуры и рН среды существенное вляние на рост метилотрофов и синтез ЭПС оказывает аэрация. Культивирование проводилось в колбах вместимостью 250 мл в которые вносили питательную среду в объеме 50, 100, 150 мл, что соответствует коэффициенту заполнения 0,2, 0,4 и 0,6 соответственно. Было обнаружено, что для культуры 2м наибольший выход ЭПС наблюдался при аэрации
30 35
Температура, "С Рис. 2. Влияние температуры на прирост биомассы и синтез ЭПС метилотрофными бактериями: 1 - прирост биомассы культуры 2м; 2 - прирост биомассы культуры П-1; 3 - синтез ЭПС культурой 2м; 4 - синтез ЭПС культурой П-1.
50 100 150
Объём питательной среды, мл
Рис. 3. Влияние аэрации на прирост биомассы и синтез ЭПС метилотрофными бактериями: 1 - прирост биомассы культуры 2м; 2 - прирост биомассы культуры П-1; 3 - синтез ЭПС культурой 2м; 4 - синтез ЭПС культурой П-1.
Вторым этапом работы было определение компонентов питательной среды, влияющих на биосинтез экзополисахаридов методом
математического планирования Плакетта-Бермана. В качестве варьируемых параметров были выбраны концентрации источников азота, углерода и фосфатов, а также солей кальция и магния. Интервалы варьирования параметров приведены в Табл. 1.
Таблица 1. Факторы и соответствующие им значения уровней варьирования
Фактор Значение Ед.
- + изм.
1 Метанол (.. _) 1 10 мл/л
2 KN03 (X,) 0,1 2,5 г/л
3 (NH,)ZSOA (Х3) 0,1 2,5 г/л
4 0,1 2 г/л
5 Cad- (Xs) 0,005 0,5 г/л
6 Фосфаты (.. _.) 0,1 0,01 М
7 Мнимый фактор ~ -
Так как количество оцениваемых факторов равно 6, то был выбран ортогональный план Плакетта-Бермана для k=7. Такой план позволяет оценить значимость коэффициентов линейного уравнения регрессии на основании 8 опытов. Поскольку оцениваемых факторов только 6, то свободные позиции использовались для ввода мнимого фактора Х7 для оценки дисперсии воспроизводимости.
2м Зм
0,6 0,3
0,4 0,2
-0,2 0,4
0,2 од о -0,1 ■0,2 -0,3
Выбирали время культивирования,
соответствующее стационарной фазе роста - 24 ч. В качестве откликов использовали: а) Yi- оценку концентрации биомассы по оптической плотности культуры при длине волны 540 нм; б) Y2 - оценку концентрации экзополисахаридов при длине волны 490 нм. Значения выходных переменных для штаммов 2м, Зм и П-1 представлены на рисунке 4.
П-1
■0,10 -0,20 -0,30 -0,40
СП
N03 NH4 Mg Ca
N03 NH4
Mg
Ca
N03 NH4 Mg Ca
Рисунок 4. Коэффициенты уравнений регрессии для штаммов 2м, 3м и П-1. Тёмно-серым обозначены значимые коэффициенты, светло-серым - незначимые.
В результате расчетов были получены следующие уравнение регрессии. Для штамма 3м:
у = 1,45 + 0,24*х- - 0,33 *х3 - 0,21*х5; Б = 2,98 < (2,7) = 4,74
для штамма П-1:
у = 0,83 + 0,09*х- - 0,34*хг + 0,12*х5; Б = 3,61 < (2,7) = 4,74
Анализ полученных данных позволяет сделать следующий вывод: наибольшее влияние на конечную концентрацию экзополисахаридов для штаммов 3м и П-1 оказывает нитрат калия, сульфат аммония и хлорид кальция. Для штамма 2м факторы, значимо влияющие на выработку ЭПС, в исследуемом диапазоне концентраций компонентов питательной среды не выявлены. Для установки таких факторов необходимо проведение дальнейших исследований. Заключение
В результате проделанной работы было показано значительное влияние температуры, аэрации и начального значения рН ростовой среды на синтез ЭПС метилотрофными бактериями. Установлено, что для культур 2м и П-1 оптимальной для синтеза ЭПС является температура 34 °С, эта же температура способствует и лучшему росту исследуемых бактерий. Наибольший выход ЭПС был достигнут при начальном значении рН равном 5,5. Аэрация средней интенсивности увеличивала выход экзополисахаридов в случае штамма П-1, но для штамма 2м выход метаболита оказался больше при более низкой аэрации. Методом математического моделирования Плакетта-Бермана были определены компоненты питательной среды, наиболее значимые для выработки ЭПС. Такими компонентами для двух из трех изучаемых штаммов оказались нитрат калия, сульфат аммония и хлорид кальция. Данные выводы
согласуются с результатами других исследований. Более глубокая оценка влияния состава питательной среды на синтез полисахаридов требует дальнейшего изучения.
Список литературы
1. Chistoserdova L. Methylotrophs in natural habitats: current insights through metagenomics // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2015. - V. 14, Р. 5763-5779.
2. Leak D. J. Methylotrophs, industrial applications // Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation. - 1999. - P. 2844.
3. Bacterial polysaccharides: Current innovations and future trends / Ed. by M. Ullrich; Jacobs University Bremen. - Germany, 2009. - 358 p.
4. Троценко, Ю. А. Аэробные метилотрофы -перспективные объекты современной биотехнологии / Ю. А. Троценко, М. Л. Торгонская // Журнал СФУ. Биология. - 3. - 2012. - С. 243-279.
5. Schmid J. Recent insights in microbial exopolysaccharide biosynthesis and engineering strategies / J. Schmid // Current Opinion in Biotechnology. - 53. -2018. - P. 130-136.
6. Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols: Isolation and Cultivation / J. Gilbert, I. Head, M. Joye, V. de Lorenzo, [et al] ; edit.or T. J. McGenity, K. N. Timmis.
- Berlin, Germany : Springer Protocols Handbooks, 2017.
- P.197-236. - ISBN 978-3-662-45178-6.
7. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A. Colorimetric method for the determination of sugars and related substances // Analyt. Chem. 1983. V. 28. P. 350-356.
8. Delavechia C., Hampp E., Fabra A., Castro S. Influence of pH and calcium on the growth, polysaccharide production and symbiotic association of Sinorhizobium meliloti SEMIA 116 with alfalfa roots // Biol. Fertil. Soils. 2003. V. 38. P. 110-114.
