CC BY
61
Оригинальная статья / Original article УДК 57.013:57.014
DOI: https://doi.org/10.21285/2227-2925-2020-10-4-708-718
Биосинтез экзополисахаридов почвенными бактериями
Raenibacillus mucilaginosus на питательной среде с мелассой
© Т.З. Ха*, А.В. Канарский*, З.А. Канарская*, А.В. Щербаков**,
Е.Н. Щербакова**
*Казанский национальный исследовательский технологический университет,
г. Казань, Республика Татарстан, Россия **ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Санкт-Петербург, Россия
Резюме: Бактериальные экзополисахариды с влагоудерживающими и цементирующими свойствами играют очень важную роль в формировании и стабилизации почвенных агрегатов, регулировании питательных веществ и потока воды через корни растений, снижении солевого стресса в растениях. При внесении в почву бактерий, продуцирующих экзополисахариды, растения более устойчивы к водному стрессу благодаря улучшению структуры и значительному накоплению про-лина, сахаров и свободных аминокислот в условиях дефицита воды. Целью настоящей работы являлось определение эффективности биосинтеза экзополисахаридов почвенными бактериями Paenibacillus mucilaginosus при культивировании на питательной среде, приготовленной на основе мелассы. В экспериментах использованы продуценты экзополисахаридов - штаммы бактерий Р. mucilaginosus 560 и 574, предоставленные Ведомственной коллекцией непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ФГБНУ ВНИИСХМ, Санкт-Петербург). Для определения влияния условий культивирования на синтез экзополисахаридов бактериями P. mucilaginosus применен метод «один фактор за один раз» (one-factor-at-a-time - OFAT). По результатам исследований выбраны наиболее эффективный продуцент экзополисахаридов, возраст и дозы инокулята, оптимальные значения температуры культивирования и рН среды, источник азота и его концентрации, а также определены условия аэрации, влияющие на биосинтез экзополисахаридов и рост выбранного штамма бактерий P. mucilaginosus. Установлено, что наиболее эффективным продуцентом экзополисахаридов является штамм P. mucilaginosus 574. Показано, что для биосинтеза экзополисахаридов культивирование данного штамма целесообразно и экономично проводить на питательной среде c 2% мелассы без дополнительного внесения минеральных веществ и азота. Максимальное количество экзополисахаридов может достигать 9,55 г/л в питательной среде c 2% мелассы объемом 50 мл с добавлением 0,1% кукурузного экстракта как индуктора синтеза экзополисахаридов при температуре культивирования 30±1 °С, рН среды 6,0±0,2 с внесением 5% инокулята после 24 ч. инокуляции. Полученные результаты исследований рекомендуется использовать при создании технологии производства микробиологических удобрений.
Ключевые слова: меласса, Paenibacillus mucilaginosus, экзополисахариды, условия культивирования
Для цитирования: Ха Т.З., Канарский А.В., Канарская З.А., Щербаков А.В., Щербакова Е.Н. Биосинтез экзополисахаридов почвенными бактериями Paenibacillus mucilaginosus на питательной среде с мелассой. Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2020. Т. 10. N 4. С. 708-718. https://doi.org/10.21285/2227-2925-2020-10-4-708-718
Biosynthesis of exopolysaccharides by soil bacteria Paenibacillus mucilaginosus on a nutrient molasses medium
Dung T. Ha*, Albert V. Kanarsky*, Zosia A. Kanarskaya*, Andrei V. Shcherbakov**,
Elena N. Shcherbakova**
* Kazan National Research Technological University, Russian Federation ** All-Russian Research Institute of Agricultural Microbiology, St. Petersburg, Russian Federation
Abstract: Bacterial exopolysaccharides exhibiting water-retaining and cementing properties play an essential role in such processes as the formation and stabilization of soil aggregates, regulation of nutrients and
water flow through plant roots, as well as reduction of salt stress in plants. When bacteria producing exopolysaccharides are introduced into a soil, plants become more resistant to water stress due to improved structure and significant accumulation of proline, sugars and free amino acids under the conditions of water deficiency. In this work, we set out to determine the efficiency of exopolysaccharide biosynthesis by the soil bacteria Paenibacillus mucilaginosus when cultivated on a nutrient molasses medium. The bacterial strains P. mucilaginosus 560 and 574 provided by the Departmental collection of non-pathogenic microorganisms for agricultural purposes (All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, St. Petersburg) were used as exopolysaccharide producers. In order to determine the influence of cultivation conditions on the synthesis of exopolysaccharides by P. mucilaginosus, the one-factor-at-a-time (OFAT) method was used. On the basis of the obtained results, we determined the most effective producer of exopolysaccharides, the age and dose of the inoculum, the optimal values of the cultivation temperature and medium pH, the source of nitrogen and its concentration, as well as the aeration conditions affecting exopolysaccharide biosynthesis and the growth of the selected bacterial strain P. mucilaginosus. It was established that the P. mucilaginosus 574 strain is the most effective producer of exopolysaccharides. It was shown that the biosynthesis of exopolysaccharides is most effective and economical upon the cultivation of P. mucilaginosus 574 on a nutrient medium containing 2% molasses without addition of minerals and nitrogen. The maximum amount of exopolysaccharides can reach 9.55 g/L on a nutrient medium containing 2% molasses at a volume of 50 ml with the addition of 0.1% corn extract as an inducer of exopolysaccharide synthesis at a cultivation temperature of 30±1 °C, a medium pH of 6.0±0.2 with the introduction of 5% inoculum after 24 hours of inoculation. The obtained research results are recommended for use when creating new technologies for the production of microbiological fertilizers.
Keywords: molasses, Paenibacillus mucilaginosus, exopolysaccharides, cultivation conditions
For citation: Ha TD, Kanarsky AV, Kanarskaya ZA, Scherbakov AV, Shcherbakova EN. Biosynthesis of exopolysaccharides by soil bacteria Paenibacillus mucilaginosus on a nutrient molasses medium. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya = Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2020;10(4):708-718. (In Russian) https://doi.org/10.21285/2227-2925-2020-10-4-708-718
ВВЕДЕНИЕ
На глазах современных людей происходит изменение климата, что приводит к глобальному потеплению и сопровождается снижением количества выпадающих осадков, и, соответственно, увеличивается площадь орошаемых посевных угодий [1]. Как правило, почвы, богатые множеством питательных веществ, имеют не благоприятную для растений структуру, плохо удерживают воду и питательные вещества, быстро высыхают, при этом питательные вещества в этих почвах находятся в недоступной форме для растения. Применение известных агротехнических методов обработки подобной почвы, в том числе орошение и внесение минеральных удобрений, не дает положительных результатов, является экономически неэффективным и даже экологически опасным.
В складывающейся ситуации использования сельскохозяйственных угодий в связи с необходимостью соблюдения экологической безопасности при воспроизводстве сельскохозяйственных культур для повышения плодородия и урожайности почвы все чаще вместо минеральных удобрений применяются бактериальные препараты, изготавливаемые на основе различных штаммов микроорганизмов или их метаболитов, известных как ризобактерии, способствующих росту растений (plant growth-promoting rhizobacteria - PGPR). Ризобактерии улучшают рост корней, тем самым повышают доступность микроэлементов к корням растений [2]. Кроме того, PGPR повышают
эффективность использования воды и увеличивают водопоглощающую способность корней в условиях дефицита воды [3].
Продукты метаболизма ризобактерий также влияют на физиологические процессы в растениях [4]. В частности, экзополисахаиы (ЭПС), выделяемые бактериями, оказывают существенное влияние на различные свойства почвы и урожайность растений. Продуцентами ЭПС являются ризобактерии видов Rhizobium, Pseudomonas, Xan-thomonas, Paenibacillus и др. [5-8]. ЭПС обладают уникальными влагоудерживающими и цементирующими свойствами, поэтому они играют жизненно важную роль в формировании и стабилизации почвенных агрегатов, регулировании питательных веществ и потока воды через корни растений [9, 10]. Более того, ЭПС обеспечивают усвоение питательных веществ растением и последующее увеличение роста растений. Отмечено, что ЭПС замедляют диффузию кислорода в клетку и, соответственно, защищают нитроге-назу в условиях кислородного стресса, а также участвуют во взаимодействии бактерий с растениями [11, 12]. Бактериальные ЭПС помогают снизить солевой стресс в растениях благодаря связыванию ионов Na+ в корнях, при этом накопление в растениях ионов Na+ уменьшается [13]. При внесении в почву бактерий, продуцирующих ЭПС, растения больше накапливают пролина, сахаров и свободных аминокислот в условиях дефицита воды [14]. Показано, что внесение в почву бактерий Azospirillum, синтезирующих
ЭПС, растения более устойчивы к водному стрессу благодаря улучшению структуры и благоприятному для растений агрегатному состоянию почвы [15].
Факторами, которые потенциально могут влиять на синтез ЭПС бактериями, являются состав питательной среды, особенно источники углерода и азота, а также такие параметры, как pH, температура и время инкубации.
Целью настоящей работы являлось определение эффективности биосинтеза ЭПС почвенными бактериями Р. mucilaginosus при культивировании на питательной среде, приготовленной из мелассы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали штаммы бактерий Paenibacillus mucilaginosus 560 и 574, предоставленные Ведомственной коллекцией непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Санкт-Петербург).
Для определения перспективного штамма из взятых культур проводили глубинное культивирование обоих штаммов бактерий Р. mucilaginosus на питательной среде Александрова следующего состава, %: меласса - 2; NaCl - 0,02; K2HPO4 - 0,2; MgSO4 7H2O - 0,05; СаСО3 - 0,01 [16]. Питательную среду стерилизовали в автоклаве при температуре 120±1 °С и избыточном давлении 1 атм в течение 20 мин. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера 250 мл объемом среды 100 мл при температуре 30±1 °C и непрерывном перемешивании со скоростью 200 об./мин на шей-кере инкубатора ES-20 в течение 3-х суток.
Для определения влияния условий культивирования (концентрации субстрата, рН среды, температуры, источника азота, его концентрации, возраста и дозы посевного материала, аэрации) на рост и продуктивность ЭПС, синтезируемых бактериями P. mucilaginosus, использовали метод «один фактор за один раз» (one-factor-at-a-time - OFAT). Метод основан на варьировании одного фактора в то время как другие переменные факторы фиксируются [17].
В качестве источника углерода использовали мелассу, содержание которой в питательной среде варьировалось от 1 до 4%. Для определения влияния рН среды проводили корректировку питательной среды, приготовленной из мелассы, гидроксидом калия от 6 до 9. При инкубировании варьировали температуру от 25 до 35 °С.
В качестве источника азота использовали неорганические вещества (NH4NO3, (NH4)2SO4), органические источники азота (дрожжевой экстракт, пептон, бетафин, кукурузный экстракт, карбамид), концентрация которых в питательной среде составляла 0,1%. Концентрация наилучшего источника азота в питательной среде варьировалась: 0,02; 0,1; 0,2; 0,3 и 0,4%. Контроль-
ный опыт проводили без внесения в среду азотсодержащих веществ.
Посевной материал готовили в колбах инкубированием в течение 12,24,36, 48 ч и задавали в дозах 2, 5, 7, 10%.
Для определения влияния аэрации в колбы вместимостью 250 мл задавали питательную среду начальным объемом 50, 100, 150 мл, что соответствует отношению объема воздуха к объему среды 4:1; 1,5:1; 0,67:1 соответственно.
Рост исследуемых бактерий оценивали по таким критериям, как удельная скорость роста, время генерации и выход биомассы и ЭПС, которые рассчитывали согласно методике, рекомендованной в работе [18]. Количество биомассы бактерий определяли гравиметрическим методом после высушивания на влагомере «МХ-50». Синтез ЭПС оценивали косвенно по значению вязкости культуральной жидкости, которая определялась на вискозиметре Vibro SV-10A. Количество ЭПС определяли гравиметрическим методом, для этого ЭПС выделяли и очищали осаждением трехкратным объемом изопропанола с дальнейшим центрифугированием и высушиванием.
В супернатанте после 72 ч глубинного культивирования бактерий P. mucilaginosus определяли активность ß-фруктофуранозидазы методом, изложенным в работе [19]. Остаточное содержание редуцирующих веществ (РВ) в супернатанте определяли с использованием 3,5-ди-нитросалициловой кислоты после гидролиза не усвоенных бактериями углеводов концентрированной серной кислотой с соотношением 1:1 , методика определения которого приведена в работе [20].
Эксперименты проводили в трех биологических и аналитических повторностях, полученные результаты статистически обрабатывались с использованием стандартного пакета программы Excel 2010 и программы Prism 7.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Экспериментально установлено, что самыми перспективными продуцентами с высоким выходом биомассы и ЭПС при культивировании на питательной среде, содержащей сахарозу, являлись штаммы бактерий P. mucilaginosus 560 и 574 [21, 22]. Для получения более дешевой и эффективной питательной среды вместо коммерческих сахаров был выбран отход сахарного производства - меласса, как один из наиболее доступных, эффективных углеродных субстратов. Преимуществами мелассы являются ее низкая стоимость, простота хранения. Помимо значительной доли сахара в ней содержатся различные соли, микроэлементы, аминокислоты и витамины, которые обеспечивают рост микроорганизмов [23].
В таблице показано, что с сопоставимыми
Ростовые параметры, количество биомассы и ЭПС двух штаммов бактерий Р. тис1!ад1позиз 560 и 574 при культивировании на питательной среде, содержащей 2% мелассы
Growth parameters, biomass and EPSs of two strains P. mucilaginosus 560 and P. mucilaginosus 574 when cultivated on nutrient medium containing 2% molasses
Показатель P. mucilaginosus 560 P. mucilaginosus 574
Удельная скорость роста, ч"1 0,13±0,03 0,12±0,03
Время генерации, ч 5,37±1,33 5,84±1,60
Количество биомассы, г/л 0,85±0,02 1,71 ±0,03
Количество ЭПС, г/л 4,20±0,13 5,02±0,15
Активность р-фруктофуранозидазы, ед./мл 0,33±0,01 0,84±0,01
значениями времени генерации и удельной скорости роста количества биомассы и ЭПС, синтезируемых штаммом Р. тисИад'тозиз 574, соответственно в 2 и 1,2 раза больше по сравнению с количеством биомассы и ЭПС, синтезируемых штаммом Р. тисИад'тозиз 560. Это может быть связано со способностью синтеза продуцентом фермента р-фруктофуранозидазы, гидролизую-щей сахарозу в мелассе, и усвоением субстрата индивидуальными штаммами. Это подтверждается и более высокой активностью р-фрукто-фуранозидазы штамма Р. тисИад'тозиз 574.
Следует отметить, что в первые 48 ч культивирования обоих рассматриваемых штаммов бактерий Р. тисИад'тозиз происходит изменение рН среды в сторону подкисления среды из-за накопления органических кислот в ней. К концу культивирования штамма Р. тисНад'тозиз 560 наблюдается незначительное повышение рН среды - от 5,7 до 6,0. При этом рН среды интенсивно поднимается - от 5,6 до 6,9 - при культивировании штамма Р.тисИад'тозиз 574. Увеличение рН среды может быть обусловлено изменением состава органических и неорганических веществ, присутствующих в мелассе, которые ассимилируются бактериями, а также продуктами метаболизма, синтезируемыми этими бактериями при культивировании [23] (рис. 1).
Полученные результаты исследований показали, что штамм Р. тисИад'тозиз 574 при культивировании на питательной среде из мелассы является более перспективным продуцентом ЭПС с высоким выходом биомассы.
Известно, что концентрация субстрата является одним из лимитирующих факторов роста микроорганизмов. В настоящем исследовании определялось влияние концентрации мелассы на рост и синтез ЭПС штаммом Р. тисИад'тозиз 574. На рис. 2, а показана зависимость удельной скорости роста штамма Р. тисИад'тозиз 574 от концентрации мелассы в среде. Отмечено, что максимальная удельная скорость роста исследуемого штамма достигает умак. = 0,12 ч-1 при концентрации мелассы 1% и в дальнейшим незначительно снижается в рассматриваемом диапазоне концентрации мелассы.
Кроме того, отмечено, что с повышением содержания мелассы в среде количество биомассы увеличивается. Максимальное количество био-
массы достигало 4 г/л при культивировании штамма P. mucilaginosus 574 на питательной среде с 4% мелассы. Однако максимальное количество ЭПС (5,0 г/л), соответственно максимальная вязкость культуральной жидкости, наблюдалось при культивировании на среде с 2% мелассы. Содержание мелассы выше 2% в среде ингибирует синтез ЭПС (рис. 2, b). Полученные результаты сопоставимы с данными, приведенными в работах [24, 25], где установлено, что содержание 2% мелассы в питательной среде является оптимальным для синтеза ЭПС бактериями Azotobacter с получением 7,5 г/л ЭПС, Bacillus subtilis - с получением 4,86 г/л ЭПС.
* Р.mucilaginosus 560 м Р,mucilaginosus 574
7,1
5,5
0 20 40 60 80
Продолжительность культивирования, ч
Рис. 1. Изменение рН среды при культивировании штаммов бактерий P. mucilaginosus 560 и 574 на питательной среде с 2% мелассы при температуре 30±1 °C и непрерывном перемешивании со скоростью 200 об./мин на шейкере инкубатора ES-20 в течение 3 суток
Fig. 1. Medium pH change during cultivation of two strains of bacteria P. mucilaginosus 560 and 574 on nutrient medium with 2% molasses at temperature 30±1 °C and continuous stirring
at speed of 200 rpm on incubator shaker ES-20 for 3 days
Определение влияния температуры на рост и синтез ЭПС штаммом P. Mucilaginosus 574 проводили на питательной среде с 2% мелассы. Температуру культивирования варьировали в диапазоне от 25 до 35 ° с интервалом 5 °.
Установлено, что оптимальной для синтеза ЭПС является температура 30 °С, на что указывает высокая вязкость культуральной жидкости.
Эта температура способствует и лучшему росту исследуемых бактерий. При повышении температуры культивирования до 35 °С происходит снижение синтеза биомассы в 2,3 раз, а ЭПС - в 8,6 раз по сравнению с оптимальной температурой культивирования 30 °С. Аналогично, при снижении температуры культивирования до 25 °С синтез биомассы уменьшается в 1,7 раз, ЭПС - в 1,9 раза по сравнению с оптимальной температурой культивирования (рис. 3, а).
Кроме температуры на рост и синтез ЭПС штаммом P. mucilaginosus 574 также существенно влияет рН среды. Исследование проводилось при оптимальной температуре при корректировке рН среды с гидроксидом кальция от 6 до 9. В качестве контроля использовали питательную среду без корректировки рН среды со значением 6,0±0,2. Показано, что при рН = 9 рост рассмат-
риваемых штаммов не наблюдается. В диапазоне рН от 6 до 8 штамм P. mucilaginosus 574 эффективно растет при культивировании на питательной среде из мелассы при нейтральном значении рН = 7. Однако эффективный синтез ЭПС происходил под действием стрессовых факторов при изменении рН среды в более кислую или щелочную среду. В частности, максимальное количество ЭПС накапливалось в слабокислой питательной среде при рН = 6 (рис. 3, Ь).
При оптимальных условиях культивирования ^ = 30 °С, рН = 6,0±0,2) проводили определение влияния источника азота и его концентрации на рост и синтез ЭПС штаммом P. mucilaginosus 574 (рис. 4). В качестве источников азота были выбраны как минеральные соли, так и органические вещества.
¡Н
о о о.
£
о о
.
о
ы
о
s
X
л с.
О) 8
0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0
1 2 3
Концентрация мелассы, %
а
га о
с, га и
2 5 о о и
ш
Биомасса ЭПС
Вязкость
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
12 3 4
Концентрация мелассы, %
b
■5 4
Lb
га£ ° „
»О 3
2 Ü о о
Б
2
Рис. 2. Влияние концентрации мелассы в питательной среде на кинетику роста (а) и синтез продуктов метаболизма (b) штаммом 574 бактерий P. mucilaginosus
Fig. 2. Influence of molasses concentration in the nutrient medium on the growth kinetics (a) and the productivity of metabolic products (b) of strain P. mucilaginosus 574
20 18 16 14
(Ü 12 1 10 ¡£
8 6 4 2 0
25 °С 30 °С 35 °С Температура среды, °С
a
с о к з я В
■5 4
L.
" _ ¡¿О 3
2 5 о о
£ 2
Биомасса ЭПС
Вязкость
6.0.
7.0. рН среды
b
8.0.
Рис. 3. Влияние температуры культивирования (а) и рН среды (b) на рост и синтез ЭПС
штаммом P. mucilaginosus 574
Fig. 3. Influence of the cultivation temperature (a) and medium pH (b) on the growth and synthesis
of EPS by strain P. mucilaginosus 574
20
18
16
14 (Л *
ra
12 Q. £
10 ,ь т
с
8 о к
з
6 я В
4
2
0
4
3
2
1
0
0
4
6
6
5
5
1
1
0
0
о " ff га и
2 5 о о
S
ш
10 8 : 6 4
60
50
I Биомасса ЭПС
40 Я £
30
20 g
m
10
с; 8
L.
г е; то
и L- 6 то <-Т мП
о
Би
10
0
2
123456789 10 Источника азота
60
50
40 а!
30 ¡¡f <j
О 20 * к со
10
0
0,02 0,1 0,2 0,3 0,4 Содержание кукурузного экстракта, %
b
Рис. 4. Влияние источника азота (а) и его содержания (b) на синтез биомассы и ЭПС штамма P. mucilaginosus 574. На рис. 4, а: 1 - без источника азота; 2 - без источников минеральных солей и азота; 3 - NH4NO3; 4 - (NH4)2SO4; 5 - дрожжевой экстракт; 6 - одновременное присутствие (NH4)2SO4 и дрожжевого экстракта;
7 - пептон; 8 - бетафин; 9 - кукурузный экстракт; 10 - карбамид
Fig. 4. Influence of the nitrogen sources (a) and its' concentration (b) on the biomass and EPS synthesis
by strain 574 P. mucilaginosus. In fig. 4, a: 1 - without nitrogen sources; 2 - without mineral salts and nitrogen sources; 3 - NH4NO3; 4 - (NH4)2SO4; 5 - yeast extract;
6 - (NH4)2SO4 and yeast extract mixture; 7 - peptone; 8 - betafin; 9 - corn extract; 10 - carbamide
2
0
0
a
Наблюдается интенсивность синтеза ЭПС рассматриваемым штаммом при культивировании на питательной среде, приготовленной из мелассы без дополнительных источников минеральных солей и азота (среда 2, рис. 4, а), поскольку в стрессовых условиях (при избытке сахарозы и недостаточном количестве азота) синтез ЭПС стимулируется. Следовательно, содержание питательных веществ в мелассе является достаточным для нормальной жизнедеятельности и синтеза ЭПС исследуемого штамма бактерии. Дополнительное внесение источника азота в питательную среду существенно влияет на рост исследуемого штамма бактерии по сравнению с контролем (среда 1, рис. 4, а). Наилучшим источником азота для синтеза биомассы служил пептон, который способствовал увеличению количества биомассы в 2 раз по сравнению с контролем (среда 1).
Из результатов, представленных на рис. 4, видно, что внесение в среду бетафина и кукурузного экстракта способствует синтезу ЭПС штаммом 574 P. mucilaginosus. Это, возможно, связано с содержанием в бетафине и кукурузном экстракте углеводов, которые стимулируют синтез ЭПС. Максимальная концентрация синтезируемых ЭПС достигала 9,55 г/л при внесении в среду кукурузного экстракта в количестве 0,1%, что в 2 раза больше по сравнению с контролем (см. среда 1, рис. 4, а) и в 1,5 раза больше при культивировании исследуемого штамма на среде, содержащей 2% мелассы и без дополнительных источников минеральных солей и азота (среда 2, рис. 4, а). По-видимому, это связано с содержа-
нием в кукурузном экстракте индукторов синтеза ЭПС. При дальнейшем повышении содержания кукурузного экстракта в среде создаются благоприятные условия для роста продуцента, в результате которого количество биомассы увеличивается, а синтез ЭПС снижается (рис. 4, b). Ранее также было установлено, что кукурузный экстракт является наиболее благоприятным источником азота для биосинтеза ЭПС бактериями Bacillus megaterium [26], дрожжами Aureo-basidium pullulans RBF 4A3 [27] и грибами Agari-cus nevoi, Inonotus levis HAI 796 и Phellinus ro-bustus [28].
Исследовано влияние возраста и дозы ино-кулята на синтез биомассы и ЭПС рассматриваемого штамма (рис. 5). Установлено, что с увеличением возраста инокулята количество биомассы исследуемым штаммом повышается, при этом количество синтезируемых ЭПС снижается (рис. 5, а). Отмечено незаметное влияние дозы инокулята на синтез биомассы штаммом P. mucilaginosus 574. Максимальная концентрация ЭПС (9 г/л) и биомассы (0,4 г/л) наблюдалась при возрасте инокулята 24 ч (начальная лог-фаза, рис. 5, а) с внесением 5% инокулята (рис. 5, b).
При исследовании влияния аэрации на продуктивность штамма P. mucilaginosus 574 показано, что максимальное количество биомассы (2 г/л) и ЭПС (9,6 г/л), синтезируемых продуцентом P. mucilaginosus 574, наблюдается в условиях аэрации, при которых отношение объема воздуха к объему среды составляет 4:1 (рис. 6, а). Полученные результаты соответствуют результа-
Ха Т.З., Канарский А.В., Канарская З.А. и др. Биосинтез экзополисахаридов . Ha T.D., Kanarsky A.V., Kanarskaya Z.A. et al. Biosynthesis of ex-opolysaccharides .
там культивирования штаммом Paenibacillus sp. TKU023 [29]. Обнаружено, что в условиях интенсивной аэрации бактерии рода Paenibacillus быстро растут и синтезируют значительное количество метаболитов. При этом количество биомассы и ЭПС при соотношении объема воздуха к объему среды 4:1 соответственно в 2,6 и 6,6 раза больше по сравнению с соотношением объема воздуха к объему среды 1,5:1 и 0,67:1.
В связи с улучшением условий аэрации в среде рассматриваемый штамм может утилизи-
ровать до 96% углеводов мелассы. Ухудшение утилизации субстрата при снижении отношения объема воздуха к объему среды может быть связанно с недостатком растворенного в среде кислорода или недостаточной аэрацией для полной утилизации углеводов мелассы. Вследствие полной утилизации сахара при соотношении объема воздуха к объему среды 4:1 число клеток достигает 6^108 КОЕ/мл и синтез ЭПС увеличивается до 9,55 г/л (рис. 6, Ь).
10
га ¿= о
сС ма ПС
ом Э
и
Б
55
50
45
40
га о. £
£ Б
о
¡с п К
m
35
10
g-Ê 6 сас ,С
о m 4 и Б
Биомасса ЭПС
■ Вязкость
54 53 52 51 50 49
48
24 ч 36 ч 48 ч
Возраст инокулята, ч
30
0 -
А*
С?\в
Доза инокулята, %
b
47
Рис. 5. Влияние возраста инокулята (а) и его дозы (b): 1 - без инокулята (контроль); 2 - 2% инокулята; 3 - 5% инокулята; 4 - 7% инокулята; 5 - 10% инокулята на синтез биомассы и ЭПС штамма P. mucilaginosus 574
Fig. 5. Influence of inoculum age (a) and inoculum dosage (b): 1 - without inoculum; 2 - 2% inoculum; 3 - 5% inoculum; 4 - 7% inoculum; 5 - 10% inoculum on the biomass and EPS synthesis of strain P. mucilaginosus 574
8
8
6
4
2
2
0
a
12
10
ra£ о
с,
аС ам П оЭ и
Биомасса ЭПС
Вязкость
60 7
6
50
(Л 5
40 га о. 8
£ о 4
*
30 ,ьт ,л
с м 3
о к ш
20 з О
я В К 2
10 1
0 0
50 100 150
Объем питательной среды, мл
a
KOE
Потребление РВ
120
100
80
60
40
20
50 100 150
Объем питательной среды, мл
b
В
о.
е и н е л б
е р
рто
Рис. 6. Зависимость синтезируемых биомассы и ЭПС (а), числа колониеобразующих единиц и потребления субстрата РВ (b) штамма P. mucilaginosus 574 от отношения объема воздуха к объему среды
Fig. 6. Relationship between synthesized biomass and EPS (a), colony-forming units number and reducing sugars consumption (b) of strain P. mucilaginosus 574 and ratio of air volume with nutrient medium volume
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Установлено, что эффективным продуцентом экзополисахаридов при культивировании на
питательной среде из мелассы является штамм P. mucilaginosus 574.
2. Показано, что эффективный синтез ЭПС
8
6
4
2
0
0
штаммом Р. mucilaginosus 574 проходит на питательной среде из мелассы без дополнительного внесения минеральных веществ и азота. Это указывает на экономическую целесообразность использования мелассы без дополнительного внесения минеральных веществ и азота для культивирования Р. mucilaginosus 574.
3. Выявлено, что для биосинтеза ЭПС культивирование штаммом P. mucilaginosus 574 целесообразно проводить на питательной среде, содержащей 2% мелассы при температуре куль-
тивирования 30±1 °С и рН среды, равной 6,0±0,2, с добавлением 0,1% кукурузного экстракта в качестве индуктора. Максимальная концентрация ЭПС, которая была получена с внесением 5% инокулята после 24 ч инокуляции при отношении объема воздуха к объему среды 4:1, составила 9,55 г/л.
Результаты проведенных исследований рекомендуется использовать при создании технологии производства микробиологических удобрений.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИИ СПИСОК
1. Khan N., Bano A., Rahman M.A., Rathinasa-bapathi B., Babar M.A. UPLC-HRMS-based untar-geted metabolic profiling reveals changes in chickpea (Cicer arietinum) metabolome following long-term drought stress // Plant, Cell & Environment. 2019. Vol. 42. Issue 1. P. 115-132. https://doi.org/ 10.1111/pce.13195
2. Vejan P., Abdullah R., Khadiran T., Ismail S., Boyce A.N. Role of plant growth promoting rhizo-bacteria in agricultural sustainability - a review // Molecules. 2016. Vol. 21. Issue 5. P. 573. https:// doi.org/10.3390/molecules21050573
3. Sade N., Gebretsadik M., Seligmann R., Schwartz A., Wallach R., Moshelion M. The role of tobacco Aquaporin1 in improving water use efficiency, hydraulic conductivity, and yield production under salt stress // Plant Physiology. 2010. Vol. 152. Issue 1. P. 245-254. https://doi.org/10.1104/pp.109.145854
4. Kloeppe J.W., Rodriguez-Kabana R., Zehnder A.W., Murphy J.F., Sikora E., Fernandez C. Plant root-bacterial interactions in biological control of soilborne diseases and potential extension to systemic and foliar diseases // Australasian Plant Pathology. 1999. Vol. 28. Issue 1. P. 21-26. https:// doi.org/10.1071/AP99003
5. Hilliou L., Freitas F., Oliveira R., Reis M.A.M., Lespineux D., Grandfils C., et al. Solution properties of an exopolysaccharide from a Pseudomonas strain obtained using glycerol as single carbon source // Carbohydrate Polymers. 2009. Vol. 78. Issue 3. P. 526-532. https://doi.org/10.1016Zj.carb-pol.2009.05.011
6. Rottava I., Batesini G., Silva F.M., Lerin L., de Oliveira D., Padilha F.F., et al. Xanthan gum production and rheological behavior using different strains of Xanthomonas sp. // Carbohydrate Polymers. 2009. Vol. 77. Issue 1. P. 65-71. https://doi.org/10. 1016/j.carbpol.2008.12.001
7. Freitas F., Alves V.D., Pais J., Carvalheira M., Costa N., Oliveira R., et al. Production of a new ex-opolysaccharide (EPS) by Pseudomonas oleo-vorans NRRL B-14682 grown on glycerol // Process Biochemistry. 2010. Vol. 45. Issue 3. P. 297-305. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2009.09.020
8. Liang T.-W., Wang S.-L. Recent advances in exopolysaccharides from Paenibacillus spp.: production, isolation, structure, and bioactivities // Ma-
rine Drugs. 2015. Vol. 13. Issue 4. P. 1847-1863. https://doi.org/10.3390/md13041847
9. Roberson E.B., Firestone M.K. Relationship between Desiccation and Exopolysaccharide Production in a Soil Pseudomonas sp. // Applied and Environmental Microbiology. 1992. Vol. 58. Issue 4. P. 1284-1291. https://doi.org/10.1128/AEM.58.4.12 84-1291.1992
10. Tisdall J.M., Oades J.M. Organic matter and water stable aggregates in soils // European Journal of Soil Science. 1982. Vol. 33. Issue 2. P. 141-163. https://doi.org/10.1111 /j.1365-2389.1982.tb01755.x
11. Sabra W., Zeng A.P., Lünsdorf H., Deckwer W.D. Effect of oxygen on formation and structure of Azotobacter vinelandii alginate and its role in protecting nitrogenase // Applied and environmental microbiology. 2000. Vol. 66. Issue 9. P. 4037-4044. https://doi.org/10.1128/aem.66.9.4037-4044.2000
12. Leigh J.A., Coplin D.L. Exopolysaccharides in plant-bacterial interactions // Annual Review of Microbiology. 1992. Vol. 46. P. 307-346. https://doi. org/10.1146/annurev.mi.46.100192.001515
13. Ashraf M. Photosynthetic capacity and ion accumulation in a medicinal plant henbane (Hyos-cyamus niger L.) under salt stress // Journal of Applied Botany and Food Quality. 2004. Vol. 78. Issue 2. P. 91-96.
14. Naseem H., Ahsan M., Shahid M.A., Khan N. Exopolysaccharides producing rhizobacteria and their role in plant growth and drought tolerance // Journal of Basic Microbiology. 2018. Vol. 58. Issue 12. P. 100922. https://doi.org/10.1002/jobm.201800309
15. Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. Azospirillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003) // Canadian Journal of Microbiology. 2004. Vol. 50. Issue 8. P. 521-577. https://doi.org/ 10.1139/W04-035
16. Li X., Yang S.H., Yu X.C., Jin Z.X., Li W.D., Li L., et al. Construction of transgenic Bacillus muci-laginosus strain with improved phytase secretion // Journal of Applied Microbiology. 2005. Vol. 99. Issue 4. P. 878-884. https://doi.org/10.1111Zj.1365-2672.2005.02683.x
17. Czitrom V. One-factor-at-a-time versus designed experiments // The American Statistician. 1999. Vol. 53. Issue 2. P. 126-131. https://doi.org/
10.1080/00031305.1999.10474445
18. Maier R.M. Bacterial Growth. In: Maier R.M., Pepper I.I., Gerba C.P. Environmental Microbiology. San Diego, CA: Academic Press; 2000. Chapter 3. p. 43-60.
19. Barley M.J., Biely P., Poutanen K. Interla-boratory testing of methods for assay of xylanase activity // Journal of Biotechnology. 1992. Vol. 23. Issue 3. P. 257-270.
20. Морозова Ю.А., Скворцов Е.В., Алимова Ф.К., Канарский А.В. Биосинтез ксиланаз и целлю-лаз грибами рода Trichoderma на послеспиртовой барде // Вестник Казанского технологического университета. 2012. Т. 15. N 19. С. 120-122.
21. Ха З.Т., Канарский А.В., Канарская З.А., Щербаков А.В., Щербакова Е.Н. Эффективность культивирования бактерий рода Paenibacillus mucilaginosus на питательной среде на основе сахарозы // Научный журнал НИУ ИТМО. Серия: Процессы и аппараты пищевых производств. 2019. N 3. С. 62-72. https://doi.org/10.17586/2310-1164-2019-12-3-62-72
22. Ха Т.З., Канарская З.А., Канарский А.В., Щербаков А.В., Щербакова Е.Н. Влияние источника углерода на синтез биомассы и экзополиса-харидов бактериями Paenibacillus mucilaginosus // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2019. Т. 9. N 3. С. 509-518. https://doi.org/ 10.21285/2227-2925-2019-9-3-509-518
23. Яровенко В.Л., Маринченко В.А., Смирнов В.А., УстинниковБ.А., Цыганков П.С., Швец В.Н. [и др.]. Технология спирта. М.: Колос-Пресс, 2002. 464 с.
24. Emtiazia G., Ethemadifara Z., Habibib M.H. Production of extra-cellular polymer in Azotobacter and biosorption of metal by exopolymer // African Journal of Biotechnology. 2004. Vol. 3. Issue 6. P. 330-333. https://doi.org/10.5897/AJB2004.000-2060
25. Razack S.A., Velayutham V., Thangavelu V. Medium optimization for the production of exopoly-saccharide by Bacillus subtilis using synthetic sources and agro wastes // Turkish Journal of Biology. 2013. Vol. 3. Issue 37. P. 280-288. https://doi. org/10.3906/biy-1206-50
26. Chaijamrus S., Udpuay N. Production and Characterisation of Polyhydroxybutyrate from Molasses and Corn Steep Liquor produced by Bacillus megaterium ATCC 6748. Agricultural Engineering International: the CIGR Ejournal. X p. 1-12, 2008.
27. Sharma N., Prasad G.S., Choudhury A.R. Utilization of corn steep liquor for biosynthesis of pullulan, an important exopolysaccharide // Carbohydrate Polymers. 2013. Vol. 93. Issue 1. P. 95101. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2012.06.059
28. Elisashvili V.I., Kachlishvili E.T., Wasser S.P. Carbon and nitrogen source effects on basidiomycetes exopolysaccharide production // Applied Biochemistry and Microbiology. 2009. Vol. 45. Issue 5. P. 531-535. https://doi.org/10.1134/S0003683809050135
29. Wang C.-L., Huang T.-H., Liang T.-W., Fang C.-Y., Wang S.-L. Production and characterization of exopolysaccharides and antioxidant from Paeni-bacillus sp. TKU023 // New Biotechnology. 2011. Vol. 28. Issue 6. P. 559-565. https://doi.org/10.101 6/j.nbt.2011.03.003
REFERENCES
1. Khan N, Bano A, Rahman MA, Rathinasabapa-thi B, Babar MA. UPLC-HRMS-based untargeted metabolic profiling reveals changes in chickpea (Cicer ari-etinum) metabolome following long-term drought stress. Plant, Cell & Environment. 2019;42(1):115— 132. https://doi.org/10.1111/pce.13195
2. Vejan P, Abdullah R, Khadiran T, Ismail S, Boyce AN. Role of plant growth promoting rhizobac-teria in agricultural sustainability - a review. Molecules. 2016;21(5):573. https://doi.org/10.3390/mole-cules21050573
3. Sade N, Gebretsadik M, Seligmann R, Schwartz A, Wallach R, Moshelion M. The role of tobacco Aquaporin1 in improving water use efficiency, hydraulic conductivity, and yield production under salt stress. Plant Physiology. 2010;152(1):245-254. https://doi.org/10.1104/pp.109.145854
4. Kloeppe JW, Rodriguez-Kabana R, Zehnder AW, Murphy JF, Sikora E, Fernandez C. Plant root-bacterial interactions in biological control of soil-borne diseases and potential extension to systemic and foliar diseases. Australasian Plant Pathology. 1999;28(1):21-26. https://doi.org/10.1071/AP99003
5. Hilliou L, Freitas F, Oliveira R, Reis MAM, Lespineux D, Grandfils C, et al. Solution properties
of an exopolysaccharide from a Pseudomonas strain obtained using glycerol as single carbon source. Carbohydrate Polymers. 2009;78(3):526-532. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2009.05.011
6. Rottava I, Batesini G, Silva FM, Lerin L, de Oliveira D, Padilha FF, et al. Xanthan gum production and rheological behavior using different strains of Xanthomonas sp. Carbohydrate Polymers. 2009;77(1):65-71. https://doi.org/10.1016Zj.carbpol. 2008.12.001
7. Freitas F, Alves VD, Pais J, Carvalheira M, Costa N, Oliveira R, et al. Production of a new ex-opolysaccharide (EPS) by Pseudomonas oleo-vorans NRRL B-14682 grown on glycerol. Process Biochemistry. 2010;45(3):297-305. https://doi.org/1 0.1016/j.procbio.2009.09.020
8. Liang T-W, Wang S-L. Recent advances in exopolysaccharides from Paenibacillus spp.: production, isolation, structure, and bioactivities. Marine Drugs. 2015;13(4):1847-1863. https://doi.org/10.33 90/md13041847
9. Roberson EB, Firestone MK. Relationship between Desiccation and Exopolysaccharide Production in a Soil Pseudomonas sp. Applied and Environmental Microbiology. 1992;58(4):1284-1291.
https://d0i.0rg/l 0.1128/AEM.58.4.1284-1291.1992
10. Tisdall JM, Oades JM. Organic matter and water stable aggregates in soils. European Journal of Soil Science. 1982;33(2):141-163. https://doi.org/ 10.1111/j.1365-2389.1982.tb01755.x
11. Sabra W, Zeng AP, Lünsdorf H, Deckwer WD. Effect of oxygen on formation and structure of Azotobacter vinelandii alginate and its role in protecting nitrogenase. Applied and environmental microbiology. 2000;66(9):4037-4044. https://doi.org/1 0.1128/aem.66.9.4037-4044.2000
12. Leigh JA, Coplin DL. Exopolysaccharides in plant-bacterial interactions. Annual Review of Microbiology. 1992;46:307-346. https://doi.org/10.114 6/annurev.mi.46.100192.001515
13. Ashraf M. Photosynthetic capacity and ion accumulation in a medicinal plant henbane (Hyos-cyamus niger L.) under salt stress. Journal of Applied Botany and Food Quality. 2004;78(2):91-96.
14. Naseem H, Ahsan M, Shahid MA, Khan N. Exopolysaccharides producing rhizobacteria and their role in plant growth and drought tolerance. Journal of Basic Microbiology. 2018;58(12):1009-22. https://doi.org/10.1002/jobm.201800309
15. Bashan Y, Holguin G, de-Bashan LE. Azospi-rillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003). Canadian Journal of Microbiology. 2004;50(8):521-577. https://doi.org/10.1139/W04-035
16. Li X, Yang SH, Yu XC, Jin ZX, Li WD, Li L, et al. Construction of transgenic Bacillus mucilaginosus strain with improved phytase secretion // Journal of Applied Microbiology. 2005. Vol. 99. Issue 4. P. 878-884. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2005.02683.x
17. Czitrom V. One-factor-at-a-time versus designed experiments. The American Statistician. 1999;53(2):126-131. https://doi.org/10.1080/000313 05.1999.10474445
18. Maier RM. Bacterial Growth. In: Maier RM, Pepper II, Gerba CP. Environmental Microbiology. San Diego, CA: Academic Press; 2000. Chapter 3. p. 43-60.
19. Barley MJ, Biely P, Poutanen K. Interlabora-tory testing of methods for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology. 1992;23(3):257-270.
20. Morozova YuA, Skvortsov EV, Alimova FK, Kanarsky AV. The biosynthesis of xylanases and cellulases by Trichoderma fungi on the post-alcohol bard. Vestnik Kazanskogo tekhnologicheskogo uni-versiteta = Bulletin of the Technological University. 2012;15(19):120-122. (In Russian)
21. Ha DT, Kanarsky AV, Kanarskaya ZA,
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Ха Тхи Зунг,
аспирант кафедры пищевой биотехнологии, Казанский национальный исследовательский технологический университет,
Shcherbakov AV, Shcherbakova EN. The efficiency of Paenibacillus mucilaginosus bacteria cultivation on nutrient medium based on sucrose. Nauchnyi zhurnal NIU ITMO. Seriya: Protsessy i apparaty pishchevykh proizvodstv = Scientific Journal NRUITMO. Processes and Food Production Equipment. 2019;3:62-72. (In Russian) https://doi.org/10.17586/2310-1164-2019-12-3-62-72
22. Ha DT, Kanarskaya ZA, Kanarsky AV, Shcherbakov AV, Shcherbakova EN. The effect of carbon source on the biomass and exopolysaccharide synthesis by Paenibacillus mucilaginosus bacteria. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya khimiya i bio-tekhnologiya = Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2019;9(3):509-518. (In Russian) https://doi.org/10.21285/2227-2925-2019-9-3-509-518
23. Yarovenko VL, Marinchenko VA, Smirnov VA, Ustinnikov BA, Tsygankov PS, Shvets VN, et al. Technology of alcohol. Moscow: Kolos-Press; 2002. 464 p. (In Russian)
24. Emtiazia G, Ethemadifara Z, Habibib MH. Production of extra-cellular polymer in Azotobacter and biosorption of metal by exopolymer. African Journal of Biotechnology. 2004;3(6):330-333. https://doi.org/10.5897/AJB2004.000-2060
25. Razack SA, Velayutham V, Thangavelu V. Medium optimization for the production of exopoly-saccharide by Bacillus subtilis using synthetic sources and agro wastes. Turkish Journal of Biology. 2013;3(37):280-288. https://doi.org/10.3906/biy-1206-50
26. Chaijamrus S, Udpuay N. Production and Characterisation of Polyhydroxybutyrate from Molasses and Corn Steep Liquor produced by Bacillus megaterium ATCC 6748. Agricultural Engineering International: the CIGR Ejournal. X p. 1-12, 2008.
27. Sharma N, Prasad GS, Choudhury AR. Utilization of corn steep liquor for biosynthesis of pullulan, an important exopolysaccharide. Carbohydrate Polymers. 2013;93(1):95-101. https://doi.org/10.10 16/j.carbpol.2012.06.059
28. Elisashvili VI, Kachlishvili ET, Wasser SP. Carbon and nitrogen source effects on basidiomy-cetes exopolysaccharide production. Applied Biochemistry and Microbiology. 2009;45(5):531-535. https://doi.org/10.1134/S0003683809050135
29. Wang C-L, Huang T-H, Liang T-W, Fang C-Y, Wang S-L. Production and characterization of exopolysaccharides and antioxidant from Paeni-bacillus sp. TKU023. New Biotechnology. 2011 ;28(6):559-565. https://doi.org/10.1016/j.nbt.20 11.03.003
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Dung T. Ha,
Postgraduate Student,
Department of Food Biotechnology,
Kazan National Research Technological Univer-
420015, г. Казань, ул. Толстова, 8, Российская Федерация, e-mail: [email protected]
Канарский Альберт Владимирович,
д.т.н., профессор кафедры пищевой биотехнологии,
Казанский национальный исследовательский технологический университет, 420015, г. Казань, ул. Толстова, 8, Российская Федерация, И e-mail: [email protected]
Канарская Зося Альбертовна,
к.т.н., доцент кафедры пищевой биотехнологии,
Казанский национальный исследовательский технологический университет, 420015, г. Казань, ул. Толстова, 8, e-mail: [email protected]
Щербаков Андрей Владимирович,
к.б.н., научный сотрудник лаборатории технологии микробных препаратов, Всероссийский НИИ сельскохозяйственной метеорологии,
196608, С.-Петербург, шоссе Подбельского, 3, Российская Федерация, e-mail: [email protected]
Щербакова Елена Николаевна,
к.с-х.н., младший научный сотрудник лаборатории технологии микробных препаратов,
Всероссийский НИИ сельскохозяйственной метеорологии,
196608, С.-Петербург, шоссе Подбельского, 3, Российская Федерация, e-mail: [email protected]
Заявленный вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.
Статья поступила в редакцию 13.10.2020; одобрена после рецензирования 18.11.2020; принята к публикации 30.11.2020.
sity,
8, Tolstov St., Kazan, 420015, Russian Federation, e-mail: [email protected]
Albert V. Kanarsky,
Dr. Sci. (Engineering), Professor, Department of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University,
8, Tolstov St., Kazan, 420015, Russian Federation, S e-mail: [email protected]
Zosia A. Kanarskaya,
Cand. Sci. (Engineering), Associate Professor, Department of Food Biotechnology, Kazan National Research Technological University,
8, Tolstov St., Kazan, 420015,
Russian Federation,
e-mail: [email protected]
Andrei V. Shcherbakov,
Cand. Sci. (Biology), Researcher, laboratory of Microbial Technology, All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology,
3, Podbelsky Highway, St. Petersburg, 196608,
Russian Federation,
e-mail: [email protected]
Elena N. Shcherbakova,
Cand. Sci. (Agriculture), Researcher, laboratory of Microbial Technology, All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology,
3, Podbelsky Highway, St. Petersburg, 196608,
Russian Federation,
e-mail: [email protected]
Contribution of the authors
The authors contributed equally to this article.
Conflict of interests
The authors declare no conflict of interests.
All authors have read and approved the final manuscript.
The article was submitted 13.10.2020; approved after reviewing 18.11.2020; accepted for publication 30.11.2020.
