CC BY
21
УДК 579.64
Салтыкова С.С., Побережный Д.Ю., Калёнов С.В.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОТЕНЦИАЛА МЕТИЛОТРОФНЫХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ОБОГАЩЕННОЙ БЕЛКОМ БИОМАССЫ
Салтыкова Софья Сергеевна, студентка 4 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Побережный Даниил Юрьевич, аспирант кафедры биотехнологии, *e-mail: d.poberezhniyi@gmail.com; Калёнов Сергей Владимирович, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии
Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д.20.
В настоящем исследовании произведена характеристика чистой культуры метилотрофной бактерии M. extorquens и смешанной культуры на ее основе как продуцентов биомассы, обогащенной белком. Проведены работы по поиску оптимальных условий культивирования. Установлено, что исследуемое бактериальное сообщество демонстрирует более высокие биотехнологические показатели в сравнении с чистой культурой M. extorquens.
Ключевые слова: метилотрофы, бактериальное сообщество, смешанная культура, Methylobacterium extorquens, одноклеточный белок
INVESTIGATION OF THE POTENTIAL OF METHYLOTROPHIC MICROBIAL COMMUNITIES FOR PRODUCING PROTEIN-ENRICHED BIOMASS
Saltykova S.S., Poberezhniy D.Y.*, Kalenov S.V.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia *e-mail: d.poberezhniyi@gmail.com
In this article a pure culture of the methylotrophic bacterium M. extorquens and a mixed culture based on it as producers of protein-enriched biomass were characterized. Work to find the optimal cultivation conditions was carried out. It was found that the studied bacterial community demonstrates higher biotechnological parameters in comparison with the pure culture of M. extorquens.
Keywords: methylotrophs, bacterial consortia, mixed culture, Methylobacterium extorquens, single-cell protein
Введение
Высокоэффективное производство белковых продуктов, широко востребованных в пищевой промышленности и сельском хозяйстве, - одна из наиболее актуальных проблем современной биотехнологии. Различные белковые продукты, получаемые из обогащенной протеином биомассы различных микроорганизмов, являются одним из потенциальных решений данной проблемы. На сегодняшний день известно большое число продуцентов одноклеточного белка, принадлежащих к различным таксономическим группам (бактерии, дрожжи, низшие грибы, одноклеточные водоросли, простейшие), реализующим различные
метаболические стратегии (автотрофы, гетеротрофы, миксотрофы) [1-2].
Интригующей группой продуцентов
одноклеточного белка являются метилотрофы -гетеротрофные организмы, способные использовать различные ^-соединения (метан, метанол, различные метиламины и т. д.) в качестве источника углерода и энергии. Подавляющее большинство
биотехнологических процессов в качестве основного углеродного сырья использует сахара и другие полиуглеродные соединения, не отличающиеся дешевизной. Метанол и другие ^-соединения, благодаря низкой стоимости и простоте производства, уже относятся к важнейшим сырьевым ресурсам химической промышленности и получают
все большее распространение в современной биотехнологии [3].
Возможность использования Ci-соединений в качестве основного ростового субстрата для промышленного производства одноклеточного белка уже более полувека является предметом живого интереса биотехнологов [4]. На сегодняшний день известно большое количество метилотрофов-продуцентов одноклеточного белка. Однако низкие скорости роста и экономические коэффициенты процессов культивирования, потребность некоторых продуцентов в интенсивной аэрации, витаминах или иных ростовых факторах оставляют актуальной задачу поиска новых перспективных продуцентов [3]. Искусственные и природные сообщества метилотрофных микроорганизмов могут стать одним из решений данной задачи [5-6]. Экспериментальная часть
Объектом данного исследования являлся метилотрофный консорциум, сформированный искусственным путем в лабораторных условиях и включающий пять различных бактериальных культур. Доминантная культура сообщества, идентифицированная как Methylobacterium extorquens - розовый пигментированный факультативный метилотроф (PPFM, pink pigmented facultative methylotrophe), встречающийся повсеместно в почве, пыли, пресноводных средах и фило- и ризосфере растений, известный промышленный продуцент
одноклеточного белка и ряда других продуктов, была выделена как бактериальный контаминант прочих метилотрофных культур. Четыре минорные бактериальные культуры сообщества были изолированы из образцов воды и ила, отобранных в пойме реки Яуза на территории Национального парка
«Лосинный остров» (коорд. места отбора: 55.90574592104182, 37.7729452772112). Видовая принадлежность минорных компонентов сообщества не определялась. Подробное описание колоний и клеток культур, входящих в состав исследуемого сообщества, приведено в Табл. 1.
Таблица 1. Характеристика колоний и клеток бактериальных культур в составе консорциума
Культура Колонии Клетки
Форма Цвет Профиль Край колонии Структура Форма Окраска по Граму
М. ех1ощиеш (доминантная культура) круглая розовый плоский гладкий однородная палочки -
Минорная культура 1 круглая с фестончатым краем жёлтый плоский гладкий мелкозерн. палочки -
Минорная культура 2 круглая бежевый плоский гладкий однородная кокки -
Минорная культура 3 круглая бледно-жёлтый плоский гладкий однородная палочки -
Минорная культура 4 круглая с фестончатым краем жёлто-оранжевый плоский гладкий мелкозерн. палочки -
Для характеристики чистой культуры M. extorquens и консорциума на его основе как продуцентов биомассы, обогащённой белком, был поставлен ряд экспериментов по оценке динамики роста культур, определению оптимальных рН и температуры культивирования.
Выращивание культур производилось на среде следующего состава (г/л): (NH4)2SÜ4 - 3; KNO3 - 0,5; MgSÜ4x7H2Ü - 0,7; NaCl - 0,5; CaCh - 0,22; KCl -0,15; Na2HPÜ4 - 0,92; KH2PO4 - 0,7; дрожжевой экстракт - 0,2; раствор микроэлементов - 10 мл/л; метанол - 6 мл/л. Раствор микроэлементов (г/л) [7]: нитрилуксусная к-та - 1,5; MgSÜ4x7H2Ü - 3; MnSÜ4x2H2Ü - 0,5; NaCl - 1; FeSÜ4x7H2Ü - 0,1; C0CI2 - 0,1; CaCl2 - 0,1; ZnSÜ4 - 0,1; CuSÜ4x7H2Ü - 0,01; AlK(SÜ4)2 - 0,01; H3BÜ3 - 0,01; Na2MoÜ4x2H2Ü -0,01.
-■•--сыепмннм кудыура М. exturquens
у' ....."
/ / JL
t
1 i .Л'' Г ,.■■* / V я 1
Время, ч
Рис. 1. Кривые роста бактериального консорциума и чистой культуры Ы. еxtorquens
Оценка динамики накопления биомассы культурами в режиме периодического культивирования производилась путем построения кривых роста (Рис. 1). В рамках данного эксперимента выращивание культур проводилось в конических колбах объемом 250 мл (объем ростовой среды составил 100 мл) на термостатируемом шейкере при перемешивании 150 об/мин и температуре 28°С, начальной рН среды - 6,7. Исходя из полученных данных, можно заключить, что исследуемая смешанная бактериальная культура характеризуется более высокими удельной скоростью роста (0,083 ч-1) и конечной концентрацией биомассы в ростовой среде (1,05 г/л АСБ), а также более короткой лаг-фазой (15 ч). Удельная скорость роста и конечная концентрация биомассы чистой культуры М. ех1ощиет составили 0,065 ч-1 и 0,81 г/л АСБ соответственно, лаг-фаза длилась 20 ч.
Для определение оптимальной температуры культивирования чистая и смешанная культуры выращивались при 25, 31 и 37°С на протяжении 72 ч. Полученные зависимости конечной концентрации АБС от температуры культивирования приведены на Рис. 2. Температура, оптимальная для роста смешанной культуры, лежит в диапазоне от 29 до 31°С. Максимальное накопление биомассы чистой культуры М. ех1ощиет наблюдалось при 25°С.
m
I
M
г* .-'*
у
0.' - - - .
I ' - Ч
lû Û,h
S
0,5 (M
DJ 0,2 U, I
24 26 2Й 30 32 34 36 38.
T;°C
Рис. 2. Зависимости накопления биомассы исследуемых культур от температуры культивирования.
В результате оценки влияния начального рН среды на накопления биомассы было установлено, что для обеих культур оптимальным является рН, близкий к нейтральному (6,8 - 7,4), однако на всем исследуемом диапазоне значений рН конечные концентрации биомасс смешанной культуры превышают таковые для чистой культуры M. extorquens (Рис. 3).
4, \
0.1
5 5.5 6 6,5 > 7,5 К 3,5 9
рН
Рис. 3. Зависимости накопления биомассы исследуемых культур от начального рН среды.
Анализ содержания сырого протеина в биомассе чистой и смешанной культур, выращенных в оптимальных условиях, производился по методу Къельдаля [8]. Содержание сырого протеина в биомассе чистой культуры составило 38-42% для
разных биологических повторностей, в то время как содержание сырого протеина в биомассе бактериального консорциума достигало 55-62%. Заключение
Была произведена сравнительная характеристика чистой культуры факультативной метилотрофной бактерии M. extorquens и бактериального консорциума на основе данной культуры как потенциальных продуцентов обогащенной белком биомассы. Исследуемый бактериальный консорциум демонстрировал лучшие биотехнологические показатели (продолжительность лаг-фазы, удельная скорость роста, максимальное накопление биомассы, содержание сырого протеина в биомассе) в сравнении с чистой культурой M. extorquens.
Список литературы
[1] Ritala A. et al. Single cell protein—state-of-the-art, industrial landscape and patents 2001-2016 //Frontiers in microbiology. - 2017. - Т. 8. - С. 2009.
[2] Jones S. W. et al. Recent advances in single cell protein use as a feed ingredient in aquaculture //Current opinion in biotechnology. - 2020. - Т. 61. - С. 189-197.
[3] Schrader J. et al. Methanol-based industrial biotechnology: current status and future perspectives of methylotrophic bacteria //Trends in biotechnology. -2009. - Т. 27. - №. 2. - С. 107-115.
[4] Wagner F., Sahm H. Process for producing single-cell protein from methanol using methylomonas sp. DSM 580 : пат. 4048013 США. - 1977.
[5] Abu-Ruwaida A. S., Banat I. M., Hamdan I. Y. Large-scale production of bacterial biomass from methanol for use as milk-replacer //Biotechnology letters. - 1990. - Т. 12. - №. 2. - С. 139-144.
[6] Nunes J. J. et al. Enhanced production of single cell protein from M. capsulatus (Bath) growing in mixed culture //Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. - 2021. - Т. 2021. - С. 894-899.
[7] Balch W. E. et al. Methanogens: reevaluation of a unique biological group //Microbiological reviews. -1979. - Т. 43. - №. 2. - С. 260.
[8] ГОСТ 32044.1-2012 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение массовой доли азота и вычисление массовой доли сырого протеина. Часть 1. Метод Къельдаля».
- ■ -M. lixiorqucns ----аншпы ., , Y||.:
\
\
\ ~ \
0,45 0.4 ■■ 0,35
3 03
0,25 0,2 0,15
- • - M. cxlorqucns
----смешанная
кулктурд
