Изучение влияния различных факторов на лизис клеток и получение протопластов у микобактерий Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

БИОЛОГИЯ

УДК 576.8:576.852.2

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ЛИЗИС КЛЕТОК И ПОЛУЧЕНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ У МИКОБАКТЕРИЙ

© 2003 г. Г.Я. Дараселия

It is established, that at various kinds mycobacteria (M.fortuitum, M.chubense, M.obuense, M.aichiense) under influence glycine, D - threonine, D - methionine and lysozyme arises lysis forms of cells and only insignificant part (behind exception M.aichiense) from them represent itself protoplasts.

Данная работа является продолжением ранее проведенного исследования [1] и посвящена изучению лизиса клеток и получению протопластов у пяти видов микобактерий под влиянием различных факторов [глицина, D-треонина, D-метионина, лизоцима], ингибирующих процессы синтеза клеточных оболочек у изучаемых объектов.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили следующие микобактерии: Mycobacterium fortuitum, M.chubense, M.obuense, M.aurum, M.aichiense.

(Коллекция культур института эпидемиологии, г.Прага, Чешская республика)

Выращивание культур проводили в жидкой питательной среде (пептон- Difco, 8 г/л) до экспоненциальной фазы роста в течение 48 ч при температуре 28 °С, инкубацию с добавлением ингибиторов синтеза клеточной оболочки - в течение 18 ч. Действие глицина (Lachema, Чешская республика) изучали в концентрации 3 %, D-треонина (Serva, Германия) в концентрации 20 мМ.

Лизис клеток проводили по методике [2] с некоторыми модификациями. Во все жидкие среды и буферные растворы добавляли «Твин-80» в концентрации 0,05 %, лизоцим (Calbia chem - Berling Corp.Lajolla) в конечной концентрации 500 мкг/мл. Концентрацию клеток в суспензии измеряли на ФЭКе (Чешская республика) при 450 нм в начале инкубации с лизоцимом в трис-HCl буфере с ЭДТА и после 24 ч. Одновременно брали образцы и проводили лизис с помощью SDS в концентрации 3 % в трис-HCl буфере (50 мМ, рН-8,0) и измеряли на ФЭКе. По степени мутности суспензии под влиянием SDS и без него, выявляли фракции осмотически фрагильных и интактных клеток. С целью изучения возникновения протопластов в жидкую среду добавляли 20 % сахарозы в качестве стабилизатора. Образцы брали после 24-часовой инкубации культур с лизоцимом и изучали в фазово-контрастном микроскопе.

Результаты исследования и их обсуждение

У пяти видов микобактерий (M.fortuitum, M.chubense, M.obuense, M.aurum, M.aichiense) изучали

и сравнивали возникновение протопластов и лизис клеток вследствие воздействия ингибиторов синтеза клеточной оболочки (глицина, О-треонина, О-метионина и лизоцима).

В табл. 1 представлены результаты исследования лизиса клеток различных видов микобактерий при инкубации в среде с ингибиторами и последующем 24-часовом воздействии лизоцима в определенных экспериментальных условиях.

Таблица 1

Лизис клеток микобактерий, % при культивировании , ■}

на комплексной питательной среде в присутствии ингибиторов синтеза клеточных оболочек (0 ч) - числитель; под влиянием лизоцима (500 мкг/мл) в буфере с БДТА

(24 ч) - знаменатель ,•»>

Микобактерии Глицин D-треонин D-метионин

M.fortuitum 85/90 71/93 71/92

M.chubense 88/88 72/72 84/90

M.obuense 75/80 80/91 84/87

M.aurum 38/43 63/60 43/60

M.aichiense 84/92 93/100 100/100

Проведена оценка возникновения протопластов, результаты представлены в табл. 2. Микроскопическим методом исследования установлено, что у всех изученных видов микобактерий под влиянием вышеуказанных факторов возникают лизирующие формы и лишь незначительная часть из них представляет собой протопласты.

Таблица 2

Получение протопластов, % у микобактерий под влиянием ингибиторов синтеза клеточных оболочек в присутствии лизоцима (500 мкг/мл) в течение 24 ч

Микобактерии Глицин D-треонин D-метионин

M.fortuitum - — 20

M.chubense Единичные Единичные Единичные

M.obuense 20 50 50-60

M.aurum - 40 40

M.aichiense 80-90 80-90 70

Несмотря на то, что некоторые виды микобактерий лизируются с высоким процентом, протопласты у них возникают лишь в единичных случаях.

Разработанный метод дает возможность получить от 40 до 90 % лизированных клеток у разных видов микобактерий. Для большинства видов примененные ингибиторы синтеза клеточной оболочки эффективны, но при этом наиболее важной является степень чувствительности их к воздействию факторов внешней среды в целом. Например, у менее чувствительного штамма М.аигит во всех использованных экспериментальных условиях лизис клеток наблюдался лишь в 43 - 63 %, а у более чувствительного штамма М.акЫепве - в 92 - 100 %.

Процент возникновения протопластов не находится в прямой взаимосвязи со степенью лизиса клеток микобактерий. Под влиянием ингибиторов синтеза клеточной оболочки появляются формы с легкоразрушимой клеточной оболочкой. Среди этих форм не возникают протопласты, хотя они и лизируются.

Пропорциональное соотношение возникновения протопластов и лизирующих форм является различным для изучаемых видов микобактерий (табл. 2). Например, под действием глицина в данных экспериментальных условиях у М.йийаШт протопласты не обнаруживались, хотя культура претерпевала высокий

Астраханский государственный технический университет

процент лизиса (от 90 до 93 %). Клетки чувствительного штамма M.aichiense под влиянием D-метионина лизировались на все 100 %. Максимальное количество образовавшихся протопластов в этой культуре составил 70 %. У штамма M.aurum процесс максимального лизиса наблюдается в 40 - 60 %, образование протопластов в 40 % под влиянием D-треонина и D-метионина. При воздействии глицином протопласты у этого штамма не были обнаружены. Это означает, что пропорциональное содержание протопластов к другим лизирующим формам более высокое, чем у устойчивых штаммов к влиянию примененных ингибиторов синтеза клеточной оболочки.

Таким образом, можно заключить, что глицин для исследованных видов микобактерий является менее эффективным, чем D-треонин и D-метионин.

Литература

1 .Коничкова-Радохова М. и др. II Изв. АН ГССР. Сер. биол. 1987. Т.13. №2. С. 103-107.

2..Rastogi N., DavidH.L. //J.Gen.Microbiol. 1981. Vol. 124.

P. 71.

___________________________________________8 июля 2002 г.

УДК 575.24:633.85

СОВМЕЩЕНИЕ МУТАНТНЫХ ПЛАСТИД С МУТАНТНЫМИ ХЛОРОФИЛЛЬНЫМИ ЯДЕРНЫМИ ГЕНАМИ У ПОДСОЛНЕЧНИКА HELIANTHUS ANNUUS L.

© 2003 г. А.В. Усатое, Е.К. Разорителева, Г.М. Федоренко

In case of crossing plastome mutants enxhlorina (?) to the mutants with a nuclear recessive chlorophyll mutation nxhlonna (c?) in the F2 there appeared viable yellow seedlings of the xantha type. Thus, the combined effect of a mutant nucleus and mutant plastids in the same plant enhances the color defect.

Введение

Для нормального биогенеза и функционирования хлоропластов необходима генетическая информация как ядра, так и органелл, их гармоничное взаимодействие. Многолетние исследования, проводимые в нашей лаборатории, всегда были направлены на решение большой и сложной проблемы ядерно-пластидных взаимоотношений [1]. Несмотря на очевидную значимость, многие ее стороны до сих пор остаются малоизученными [2]. Одним из наиболее перспективных подходов исследований в этой области является получение форм, совмещающих в себе одновременно мутантные пластиды и мутантные хло-рофилльные ядерные гены, как моделей для их последующего физиолого-биохимического исследования. Коллекция пластидных и ядерных хлорофилльных мутантов, имеющаяся в нашем распоряжении, является удобным исходным материалом для создания таких совмещенных форм [3].

В настоящем сообщении приводятся результаты работы по совмещению в одном растительном организме мутантных хлорофилльных ядерных и пластидных генов подсолнечника.

Материалы и методы

Объектом исследований служили растения ин-бредной линии 3629 подсолнечника НеНапЙшз апшив Ь., хлорофилльные ядерные монорецессивные (п:сЫоппа-3, п:сЫоппа-5) и пластомные мутанты (еп:сЫоппа-6, еп:сЬ1оппа-7), полученные на ее генетической основе. Совмещение мутантных пластид с мутантными ядерными генами проводили по следующей схеме:

Родители - рНН х РЫ1 ^-рНЬ

Б2 - 1рНН : 2рНЬ : 1рЫч, где Р — нормальный пластом; р — мутантный пластом; Н и Ь - ядерные хлорофилльные гены дикого и мутантного типов.