CC BY
135
УДК 674.031.681.81:57.086.833.4
Р. В. Сергеев, А. И. Шургин
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ МИНЕРАЛЬНОГО И ГОРМОНАЛЬНОГО СОСТАВА СРЕДЫ НА РАЗМНОЖЕНИЕ
IN VITRO ГЕНОТИПОВ ИВЫ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Разработана технология микроклонального размножения высокопродуктивных по салицину генотипов ивы с целью создания промышленных плантаций. Содержание общего салицина в экстракте коры отобранных генотипов составляло 7,4 ± 0,2 %. В ходе исследования было изучено влияние сред DKW, GD, WPM, MS на морфогенез растений Salix в культуре in vitro. Экспериментально установлено, что кинетин является более эффективным при микроклональном размножении Salix acutifolia Willd. чем 2iP и BAP.
Ключевые слова: Salix, микроразмножение, in vitro, 6-бензиламинопурин (BAP), 2-изопентениладенин (2iP), кинетин (Kn), а-нафтилуксусная кислота (NAA).
Введение. В последние десятилетия интерес к лекарственным средствам растительного происхождения увеличивается, что объясняется ростом аллергических реакций на прием лекарственных препаратов с искусственно созданной структурой. В связи с увеличением спроса на лекарственные препараты биологического происхождения возникает необходимость создания промышленных плантаций высокопродуктивных растений. Большинство видов ивы (Salicaceae, Salix) содержат в листьях, коре или почках производные салицилового спирта, салицилаты. Лекарственные препараты, получаемые из растений Salix, содержат салицин (2-гидроксиметил-фенил^-0-глюкопиранозид) и его производные: фрагилин, саликортин, 2'-о-ацетилсаликортин, тремулацин, салирепозид и др. [1]. Салицилаты используются сотни лет в качестве обезболивающих, противовоспалительных и жаропонижающих средств. Интерес к натуральным препаратам из ивы как альтернативе аспирина, синтетического аналога, повышается, потому что салицилаты ивы не обладают побочным эффектом (раздражение и повреждение желудка), характерным для аспирина [2]. Но большинство из источников ивы, в настоящее время доступных для получения лекарственных препаратов, содержат менее 1 % активных компонентов. Поэтому представляют большой интерес исследования, селекция и культивирование видов ивы с повышенным содержанием сали-цилатов [3].
В связи с этим возникает необходимость разведения ивы с целью получения сали-цилатов путем создания промышленных плантаций интенсивного типа с короткой ротацией один год при использовании в качестве посадочного материала высокопродуктивных (по выходу салицилатов) сортов-клонов, обладающих устойчивостью к неблагоприятным факторам среды, болезням и вредителям.
В сравнении с работами по другим видам древесных растений, по микроклональ-ному размножению растений рода Salix опубликованных исследований немного. Л. Бергманом изучено влияние BAP на микроразмножение клонов Salix, а также разра-
© Сергеев Р. В., Шургин А. И., 2010.
ботана технология микроклонального размножения для некоторых видов альпийских ив (S. caprea L.), в том числе для гибридов S. caprea х S. viminalis L. (= S. х smithiana) [4]. Ряд авторов указывает на сложности, возникающие при микрочеренковании и укоренении растений Salix, что связано, по их мнению, с влиянием генотипа [5, 6]. Однако для некоторых видов и клонов ив разработаны высокоэффективные методы микроразмножения [7].
Целью данного исследования являлась разработка этапов микроклонального размножения S. acutifolia как источника ценных биологически активных веществ (БАВ). В задачи работы входила оценка влияния факторов минерального и гормонального состава питательных сред на стадиях пролиферации и укоренения побегов Salix.
Объекты, материалы и методы. В качестве объекта исследований использовали растительный материал ивы, отобранный с деревьев модельных популяций (Нижегородская, Кировская области, Республика Марий Эл). Эксперименты проводились с использованием апикальных и пазушных почек in vitro. В культуру in vitro вводился материал с однолетних побегов полевых растений. Последующий анализ накопления БАВ осуществлялся на полученных растениях-регенерантах. Растительный материал был собран в начале февраля с отобранной ранее по содержанию салицина модельной популяции ивы (Нижегородская, Кировская области, Республика Марий Эл). Содержание общего салицина в экстракте из коры отобранного генотипа составляло 7,4 ± 0,2 %. В качестве первичных эксплантов были выбраны почки с однолетних побегов модельных деревьев. Введение S. acutifolia в культуру in vitro проводили путем стерилизации молодых пазушных и апикальных почек. Нарезанные черенки длиной 15-20 см, у которых предварительно были удалены листья, помещали в пластиковые пакеты. Число почек на каждом черенке варьировало от 8 до 14. Пакеты тщательно запечатывали во избежание потери влажности. До проведения опыта пакеты хранились в темноте при температуре + 4 °С. Отобранные побеги предварительно промывали мыльным раствором с щёткой и споласкивали дистиллированной водой. Черенки нарезали скальпелем на небольшие сегменты (5-10 мм) с почками, затем очищали от наружных почечных чешуй. После этого черенки замачивали в водном растворе моющего средства Fairy и помещали на магнитную мешалку на 15-20 минут. На следующем этапе сегменты растения промывали под проточной водой в течение 30-40 минут.
Все дальнейшие манипуляции с образцами проводили в ламинар-боксе. Далее эти сегменты помещали на 30-40 секунд в 70 % этанол, после чего переносили в стерилизующий раствор гипохлорита Na, в составе 10 % коммерческого отбеливателя Domestos, на 10 минут. После этого экспланты отмывали три раза в стерильной дистиллированной воде, удаляли концы, где клетки убиты, стерильным скальпелем и помещали на питательную среду MS (Murashige and Skoog's medium) [8]. Концентрация сахарозы в среде составляла 30 г/л, агар-агара 6 г/л.
В ходе исследования было изучено влияние 25 различных сочетаний концентраций бензиламинопурина (BAP 0,0;0,1;0,5;1,0;2,0 мг/л) и нафтилуксусной кислоты (NAA 0,0;0,01;0,05;0,1;0,2 мг/л) на рост и развитие эксплантов S. acutifolia (среда MS, сахароза 30 г/л, агар-агар 6 г/л). Культивирование проводили при 21 оС, освещенности 1800 Люкс, фотопериоде 16/8. Было заложено по 10 эксплантов на вариант, повторность трёхкратная. Исследование показало, что наиболее интенсивное формирование новых побегов у изучаемого генотипа ивы происходило на среде MS при добавлении 1,0 мг/л BAP в сочетании с NAA в концентрации 0,01 и 0,1 мг/л, а процесс образования корней на среде MS, дополненной 0,1 и 0,2 мг/л NAA в концентрации [9]. Стимулирующий эффект низких концентраций бензиладенина (5*10-7 М, 10-6 М) на удлинение побегов из пазушных почек был показан в работе L. Bergman [4], однако образования адвентивных
почек авторы не наблюдали. DC. Agrawal [7] при культивировании гибридной ивы (S. fragilis х S. lispoclados) на среде с добавлением 0,2 мг/л бензиладенина получили коэффициент размножения на уровне 5-8 после третьего субкультивирования.
Для изучения влияния минерального состава основных сред на морфогенез S. acutifolia в культуре in vitro были протестированы среды DKW [10], GD [11], MS [8], WPM [12]. В ходе проведённого исследования микрочеренки длиной 1,2-1,5 см по десять штук были высажены в культуральные сосуды с четырьмя исследуемыми средами. Каждая среда была дополнена 1,0 мг/л BAP, 0,1 мг/л NAA и содержала 3 % сахарозы, агар-агар в концентрации 6 г/л. Повторность трёхкратная. Культивирование проводили при 21 °С, освещенности 1800 Люкс, фотопериоде 16/8. Статистический анализ проводили методами дисперсионного анализа.
Для изучения влияния цитокининов на морфогенетическую способность эксплан-тов S. acutifolia было проведено сравнение гемогенеза на средах, дополненных Kn, BAP и 2iP. В качестве основной использовали MS-среду, содержащую 0,1 мг/л NAA, 3 % сахарозы и 0,6 % агар-агара. Сегменты побегов длиной 1,2-1,5 см помещали в культу-ральные сосуды по 21 экспланту на вариант, повторность трёхкратная.
Оценка влияния минерального состава среды на ризогенез эксплантов S. acutifolia in vitro проводилась на четырёх исследуемых средах DKW, GD, WPM, MS. В культу-ральные сосуды сажали по 10 эксплантов. Каждая среда содержала 3 % сахарозы, 0,6 % агар-агара и 0,2 мг/л NAA. В качестве контроля была выбрана среда MS, дополненная 0,2 мг/л NAA. Повторность трёхкратная. Культивирование проводили при 21 °С, освещенности 1800 Люкс, фотопериоде 16/8.
Результаты.
Стерилизация эксплантов. Предварительные исследования показали, что при использовании в качестве стерилизующего агента 0,5 % раствора гипохлорита Na (Domestos) в течение 10 минут достигается максимальное число стерильных морфогенных эксплантов S. acutifolia 94,44 %.
Микроразмножение.
Основная среда. В ходе эксперимента по изучению влияния минеральных солей на морфогенез in vitro эксплантов S. acutifolia было отмечено, что исследуемые варианты питательных сред имеют существенное отличие по своей регенерационной активности на гемогенез (табл. 1, рис. 1).
Т а б л и ц а 1
Влияние минеральных солей на количественное формирование побегов
X квадратов SS N степеней свободы df Средний квадрат mS F фактический F табличный при уровне значимости
0,05 0,01 0,001
SS0= 2,198 11
SS1= 1,41 3 0,47 4,76 3,8 7 14,4
SS2= 0,79 8 0,098
^ DKW f 1 4% у > л--? GD MS WPM U^ ^ ********* < i*
Рис. 1. Морфогенез S. acutifolia на средах разного минерального состава
Наибольшее число образовавшихся побегов и почек на эксплант (2,9 и 2,8) наблюдалось на средах MS и DKW соответственно, в то же время на среде WPM этот показатель составил лишь два побега на эксплант. Таким образом, формирование новых почек происходило на среде MS на 43 % более эффективно, чем на WPM, а на средах DKW и GD на 39 и 19 % соответственно.
Проведённый эксперимент показал, что исследуемые среды существенно отличаются друг от друга по влиянию на рост побегов S. acutifolia в культуре in vitro (табл. 2). При оценке параметров роста эксплантов лучшие результаты наблюдали на среде MS, длина побегов на этом варианте была больше, чем на среде GD на 46 %. Среды DKW и WPM по данному показателю практически не отличались (меньше чем на WPM на 26,8 и 24,7 % соответственно). На среде GD происходило формирование укороченных побегов.
Т а б л и ц а 2
Влияние минеральных солей на рост побегов S. Acutifolia
X квадратов SS N степеней свободы df Средний квадрат mS F фактический F табличный при уровне значимости
0,05 0,01 0,001
SS0= 185,98 11,00
SS1= 139,48 3,00 46,49 8,00 3,80 7,00 14,40
SS2= 46,49 8,00 5,81
Цитокинины. На 14-16 сутки культивирования на ба-зальной части эксплантов образовывались утолщения в виде разросшихся тканей, на которых впоследствии формировались адвентивные почки (рис. 2).
В ходе исследования было выявлено существенное различие исследуемых вариантов питательных сред, дополненных цитокининами Kn, BAP, 2iP, по интенсивности ге-могенеза S. acutifolia в культуре in vitro (табл. 3).
Наибольшее число вновь образованных почек (в среднем 4,2 шт./эксплант) было зафиксировано на среде с Kn, что в свою очередь на 50 % эффективнее контроля. Одновременно с этим вновь образованные побеги были более сформированными, чем на двух других исследуемых сре-очек образовывалось на 10 % меньше, чем в контроле (1,9
Т а б л и ц а 3
Дисперсионный анализ интенсивности гемогенеза на средах с исследуемыми цитокининами
Сумма квадратов SS Число степеней свободы df Средний квадрат mS F фактический F табличный при уровне значимости
0,05 0,01 0,001
SS0 4280,2 8,0
SS1 4203,6 2,0 210 1,8 164,5 5, 1 10,9 27,0
SS2 76,7 6,0 12,8
Рис. 2. Образование адвентивных почек эксплан-тами S. acutifolia
дах. На среде с 2iP новых шт./эксплант) (рис. 3).
В то же время Sant S. Bhojwani в своей статье [13] отмечает, что в культуре in vitro гибридной Salix BAP индуцирует три морфологических процесса, а именно каллусиро-вание базальной части, супрессирование корнеобразования и пролиферацию побегов. Kn вызывает каллусирование экспланта (в диапазоне концентраций 0,1 - 1,0 мг/л), но только высокие концентрации гормона ингибируют ризогенез и индуцируют гемогенез.
Рис. 3. Морфогенез растений Salix на средах с цитокининами Kn, BAP, 2iP
Ризогенез. После восьми недель культивирования на средах DKW, GD, WPM, MS интенсивность ризогенеза оценивали по следующим критериям: среднее число укоренившихся побегов (табл. 4), среднее число корней на один эксплант (табл. 5), средняя длина одного корня (табл. 6).
Т а б л и ц а 4 Т а б л и ц а 5
Среднее значение укоренившихся расте- Среднее число корней
ний Salix acutifolia на один эксплант (в шт.)
Время, недель Среда
DKW GD MS WPM
2 34,8 32,8 26,5 57,4
3 45,2 45 41 54,1
5 67,2 49,7 55 75,6
8 65,3 76,7 96,7 92,6
Время, недель Среда
DKW GD MS WPM
2 0,7 0,7 0,3 1,1
3 0,9 1,1 0,5 1,1
5 1,4 1,3 1,9 2,4
8 1,3 1,6 2,3 2,9
На величину среднего значения укоренившихся растений влияние среды начинает сказываться с восьмой недели культивирования. Так, на 2, 3 и 5 неделях культивирования фактическое значение критерия Фишера, рассчитанное методом дисперсионного анализа, варьирует от 0,37 до 2,3 при табличном значении 4,2, что свидетельствует об отсутствии влияния среды на укоренение при 5 % уровне значимости. На восьмой неделе эксперимента влияние среды на процент укоренившихся растений достоверно на 1 % уровне значимости (Г факт. = 8,5 при F табл.0,ш = 7,85).
Лучший результат укоренения эксплантов acutifolia был получен на среде MS -96,7 %, несколько меньше укоренившихся растений на среде WPM - 92,6 %, в то время как на средах DKW и GD укорененных побегов было получено на 20 % меньше (табл.4).
При оценке среднего количества корней, образовавшихся на одном экспланте, также было отмечено, что влияние среды начинает сказываться с восьмой недели культивирования. На 2, 3 и 5 неделях культивирования фактическое значение критерия Фишера, рассчитанное методом дисперсионного анализа, варьирует от 0,92 до 2,9 при табличном значении 4,2, что свидетельствует об отсутствии влияния фактора среды на значение среднего числа корней на эксплант при 5% уровне значимости. Однако на восьмой неделе эксперимента влияние среды достоверно на 1 % уровне значимости
Т а б л и ц а 6 Средняя длина одного корня (в мм)
Время, недель Средняя длина одного корня
DKW GD MS WPM
2 4,7 5,3 7,3 5,3
3 8,2 7,1 10,1 12,1
5 11,5 10,5 15,8 18,2
8 12,4 12,1 17,4 18,7
акт. 6,>1 Fтабл. 0,01 - 7,85). Экспланты на среде DKW образовывали корней на 43,5 % меньше, чем на среде MS (2,3 шт./эксплант - контроль), в то же время на среде GD среднее число корней на один эксплант составило 1,6, что также меньше, чем в контроле, на 30,4 % (табл. 5). Лучшие результаты были получены на среде WPM -2,9 шт./эксплант, что больше, чем на среде MS, на 26 %.
После трёх недель культивирования средняя длина корней на исследуемых средах не имела достоверного отличия. Через восемь недель культивирования минимальная средняя длина корней наблюдалась на среде GD (12,1 шт./эксплант), что меньше, чем в контроле, на 30,5 %. Также неудовлетворительные результаты были получены на среде DKW (12,4 шт./эксплант), средняя длина корней была на 28,7 % меньше, чем на MS. Максимальная средняя длина корней в эксперименте составила 18,7 мм на среде WPM, превысив контроль на 7,5 % (см. табл. 6).
В результате исследования было установлено достоверное отличие сред DKW, GD, MS и WPM по средней длине корня (рис. 4).
После того как растения S. acutifolia образовали корни, в условиях in vitro их вынимали из культуральных сосудов и адаптировали в почвенный субстрат. В качестве субстрата использовали торфяные таблетки «Jiffy-7» диаметром 37 мм. Неделю спустя из субстрата начали появляться корни, а еще через две недели полученные растения были высажены в горшки с почвосмесью. Дальнейшее доращивание проводили в условиях открытого грунта.
Выводы. Исследования показали, что изучаемые среды существенно отличаются друг от друга по изучаемым характеристикам. При оценке параметров роста и развития побегов лучшие результаты были достигнуты на среде MS.
В ходе исследования было выявлено существенное различие исследуемых вариантов питательных сред, дополненных цитокининами Kn, ВАР, 2iP, по интенсивности гемоге-неза S. acutifolia в культуре in vitro. Исследование показало, что использование Кп для мультипликации побегов S. acutifolia более эффективно, чем ВАР или 2iP.
На основании полученных результатов совокупности исследуемых параметров укоренения in vitro эксплантов S. acutifolia было установлено достоверное отличие влияния минеральных солей среды культивирования на процессы ри-зогенеза, начиная с восьмой недели культивирования. Экспериментально установлено, что результаты, полученные на
Рис. 4. Ризогенез S. acutifolia в культуре in vitro
Рис. 5. Растение S. acutifolia через 10
недель после высадки в субстрат
среде WPM, как правило, на 10-20 % лучше результатов, достигнутых на других исследованных средах.
Список литературы
1. Wagner, H. Plant drug analysis / H. Wagner, S. Bladt. - New York: Springer, 2001. - 384 p.
2. Chrubasik, S. Treatment of low back pain exacerbations with willow bark extract: a randomized douple-blind study / S. Chrubasik, E. Eisenberg, E. Balan // American Journal of Medicine.- 2000. -V. 109. - P. 9-14.
3. Julkunen-Tiitto, R. Variation in growth and secondary phenolics among field cultivated clones of Salix myrsinifolia / R. Julkunen-Tiitto, B. Meier // Planta Medica. - 1992. - V. 258. - P. 77-80.
4. Bergman, L. Effects of N6-benzyladenine on shoots of five willow clones (Salix ssp.) cultured in vitro / L. Bergman, S. von Arnold, T. Eriksson // Plant Cell Tissue and Organ Culture. - 1985. -V. 4. - P. 135-144.
5. Liesebach, M. Approaches on vegetative propagation of difficult-to-root Salix caprea / M. Liesebach, G. Naujoks // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 2004. - N 79. - P. 239-247.
6. Neuner, H. In vitro propagation of Salix caprea L. by single node explants / H. Neuner, R. Beiderbeck // Silvae Genet. - 1993. - V. 42. - P. 308-310.
7. Agrawal, DC. Rapid micropropagation of hybrid willow (Salix) established by ovary culture / DC. Agrawal, K. Gebhardt // Plant Physiology. -1994. -V. 143. - P. 763-765.
8. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures / T. Mu-rashige, F. Skoog // Physiologia Plantarum. - 1962. - N. 15. -P. 473-497.
9. Сергеев, Р. В. Размножение in vitro генотипов ивы с повышенным содержанием биологически активных веществ для плантационного выращивания на салицин / Р. В. Сергеев, А. И. Шургин // Лесной журнал. - 2009. - № 6. - С. 40-45.
10. Driver, J. A. In vitro propagation of paradox walnut rootstock / J. A. Driver, A. H. Kuniyuki // Hortscience. -1984. - V. 19. - P. 507-509.
11. Gresshoff, P. M. Development and differentiation of haploid Lycopercicon esculentum (tomato) / P. M. Gresshoff, C. H. Doy // Planta. - 1972. - V. 107. - P. 161-170.
12. Lloyd, G. Commercially feasible micropropagtion of mountain laurel, Kalmia latifolia by use of shoot tip culture / G. Lloyd, B. H. McCown // Proceeding of the International Plant Propagators Society. - 1980. -V. 30. - P. 421-427.
13. Bhojwani Sant, S. Micropropagation method for a hybrid willow (Salix matsudana x alba NZ-1002) / Sant S. Bhojwani // New Zealand Journal of Botany. -1980. - Vol. 18. - P. 209-214.
Статья поступила в редакцию 10.06.10.
R. V. Sergeyev, A. I. Shurgin
STUDY OF MINERAL AND HORMONAL MEDIUM COMPOSITION INFLUENCE TO PROPAGATION IN VITRO WILLOW GENOTYPES WITH HIGH CONCENTRATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES
Technology of microcronal propagation of highly productive in salicin willow genotypes with a view to create industrial plantations is developed. A total amount of salicin contained in the bark extract of selected genotypes was 7,4 ± 0,2 %. As a part of study DKW, GD, WPM, MS mediums influence on morphogenesis of the plants Salix in the culture in vitro was tested. It was experimentally found out that kinetin is more effective when a microclonal propagation Salix acuti-folia Willd, than 2iP and BAP.
Key words: Salix, micropropagation, in vitro, 6-benzylaminopurine, isopenteliladenin 2iP, kinetin (Kn), a-naphthylacetic acid.
СЕРГЕЕВ Роман Владимирович - аспирант кафедры лесных культур и механизации лесохозяйственных работ МарГТУ. Область научных интересов: биотехнология, культура растительной ткани, физиология растений. Автор 17 публикаций.
E-mail: rsergeyev@yahoo.com
ШУРГИН Алексей Иванович - кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры лесной селекции, недревесных ресурсов и биотехнологии МарГТУ. Область научных интересов - биологические ресурсы. Автор 45 публикаций.
E-mail: ashurgin@pochta.ru
