CC BY
112
УДК 581.14
UDC 581.14
ВЛИЯНИЕ ГОРМОНАЛЬНОГО СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА ИНДУКЦИЮ ОРГАНОГЕНЕЗА ТРИПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ POPULUS TREMULA В КУЛЬТУРЕ IN VITRO1
Большакова Екатерина Евгеньевна магистрант
Шургин Алексей Иванович К.С.-ХН., доцент
Сергеев Роман Владимирович к.с.-хн., ст. преподаватель
Новиков Петр Сергеевич аспирант
Поволжский государственный технологический университет, Йошкар-Ола, Россия
Проведены исследования по оптимизации питательных сред, для культивирования уникальных генотипов Рори his tremula L. in vitro.Установлено, что для индукции пролиферации побегов Populus tremula в культуре in vitro необходимо использовать питательную среду MS дополненную 0,1 мл/л ИМК и 0,1 или 0,5 мл/л БАП. Для стимуляции ризогенеза, необходимо использовать питательную среду MS, дополненную 0,3 мл/л ИМК
Ключевые слова: ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА, ГОРМОНАЛЬНЫЙ СОСТАВ, АУКСИН, ЦИТОКИНИН, РИЗОГЕНЕЗ, ПОБЕГООБРАЗОВАНИЕ, POPULUS TREMULA
THE INFLUENCE OF HORMONAL CULTURE MEDIUM COMPOUND ON THE INDUCTION OF ORGANOGENESIS OF TRIPLOID POPUIUS TREMUIA PLANTS IN VITRO
Bolshakova Ekaterina Evgenevna graduate student
Shurgin Aleksey Ivanovich Cand.Agr.Sci., associate professor
Sergeev Roman Vladimirovich Cand.Agr.Sci., senior lecturer
Novikov Petr Sergeevich postgraduate student
Volga State University of Technology, Yoshkar-Ola, Russia
The researches have been conducted for the optimization of culture medium for unique genotipes of Populus tremula L. in vitro. It was found that for induction of proliferation of the arms of Populus tremula in vitro one should use MS culture medium with 0,1 ml /1IBA and 0,1 or 0,5 ml /1 BAP. For stimulation of rhizogenesis MS culture medium with 0,3 ml /1 IBA should be used
Keywords: NUTRIENT SOLUTION, HORMONAL COMPOSITION, AUXIN, CYTOKININ, ROOT FORMATION, TILLERING, POPUUS TREMULA
Введение. Выращивание ценных генотипов Рори1ш /гети/а Ь. - один из путей повышения продуктивности лесных насаждений. Во-первых, осина формирует высокопродуктивные древостой в 2 -2,5 раза быстрее деревьев хвойных пород. Во-вторых, качественная древесина Р. /гети/а имеет большой спрос в различных отраслях деревообрабатывающей и деревоперерабатывающей промышленности [1].
Однако древостой осины отличаются низкой устойчивостью к болезням и вредителям. По причине, частого поражения деревьев ложным осиновым трутовиком
1 Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на на 2007 - 2013 годы» при финансовой поддержке Минобрнауки России (Государственный контракт №14.518.11.7055 от 20.07.2012 г.) на базе Биотехнологического комплекса по воспроизводству высших растений в условиях «чистой комнаты».
http://ej.kubagro.ru/2013/06/pdf/53.pdf
- Phellinus tremulae (Bondartsev) Bondartsev & P.N. Borisov, древесину этого дерева рассматривают как малоценную. Следует отметить, что существуют формы триплоидной осины, устойчивые к болезням и вредителям. В Шарьинском районе создан генетический резерват триплоидной формы осины, обладающей устойчивостью к болезням. Кроме того, такие деревья характеризуются полнодревесностью стволов и высокой продуктивностью [2,3]. Триплоидная осина -полиплоид, в природе такие особи встречаются редко [4].
В связи с этим, выращивание триплоидной осины, является очень перспективным и необходимым направлением, особенно в свете все возрастающей потребности общества в качественной древесине [1].
Разработка и применение технологии размножения ценных клонов осины методом in vitro позволяет преодолеть трудности, возникающие при традиционных способах размножения. Высокая результативность процесса клонального размножения напрямую зависит от эффективности каждого этапа. Одним из важнейших параметров, обеспечивающих успех всей работы, является - грамотно подобранный, гормональный состав питательной среды. Присутствие в питательной среде гормонов, оказывает значительное влияние на культивируемые растения. Фитогормоны влияют на деление и рост клеток, состояние покоя, созревание, старение, формирование пола, устойчивость к стрессу, тропизмы, транспирацию; обеспечивают функциональную целостность растительного организма, закономерную последовательность фаз индивидуального развития. В культуре ткани фитогормоны, добавленные в различных пропорциях, регулируют синтез эндогенных гормонов растений, что проявляется в разнообразных морфогенетических реакциях клеток и тканей [5,6].
Процесс микроклонального размножения включает в себя 2 этапа:
1 - собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов;
2 - in vitro укоренение размноженных побегов.
Оба этих этапа требуют индивидуального сочетания регуляторов роста в питательной среде. Кроме того, каждый вид растений индивидуально реагирует на ту или иную концентрацию фитогормонов в среде, потому невозможно подобрать одного универсального сочетания регуляторов роста [5].
Цель работы - определить оптимальный состав и необходимую концентрацию фитогормонов в питательных средах для культивирования уникальных генотипов растений Populus, обладающих высокой скоростью прироста биомассы.
Материалы, методы и объекты исследований.
Наиболее объективным подходом к оптимизации питательных сред по гормональному составу, является выявление закономерностей активации процессов побего- и корнеобразования на питательных средах, содержащих экзогенные регуляторы роста в широком диапазоне концентраций.
В качестве экспериментального растительного материала использовали микропобеги Populus tremula, культивируемые in vitro специально для экспериментальных целей.
Культивирование проводили при 21-22°С, освещенности 1800 люкс, фотопериоде 16/8.
С целью оптимизации гормонального состава среды для культивирования триплоидной осины, осуществлялся подбор оптимальных концентраций ауксинов и цитокининов. Изучалось влияние регуляторов роста на динамику развития регенерантов, коэффициент размножения и ризогенез. Экспланты P. tremula культивировали на питательной среде MS, различающейся по содержанию регуляторов роста.
В эксперименте было заложено 48 вариантов сред с различным содержанием фитогормонов. Концентрация регуляторов роста в средах соответствовала матрице планирования эксперимента (таблица 1).
Таблица 1 - Матрица планирования эксперимента по оптимизации состава питательной среды для _____________ индукции побего- и корнеобразования эксплантов Populus tremula._
Ауксины Б/Г ИМК ИУК
Цитокинины 0,03 од 0,3 0,03 од 0,3
Б/Г 0 7 14 21 28 35 42
БАП од 1 8 15 22 29 36 43
сГ 2 9 16 23 30 37 44
1,0 3 10 17 24 31 38 45
Кинетин од 4 11 18 25 32 39 46
0,5 5 12 19 26 33 40 47
1,0 6 13 20 27 34 41 48
Примечание: Значения 0,03; 0,1; 0,3 - концентрации гормонов в среде МБ. Цифры 1,2,3,.. .48 - порядковые номера вариантов сред.
На каждый вариант было заложено по 10 растений на повторность, повторность Зх-кратная. Всего было заложено 1440 растений (рисунок 1).
Рисунок - 1 Пятинедельные растения Рори1ш 1хети1а, культивируемые на питательной среде МБ, дополненной 0,1 мл/л ИМК + 0,5 мл/л БАП.
Через 5 недель культивирования была проведена оценка влияния индолилмасляной кислоты, индолилуксусной кислоты, 6-бензиламинопурина и кинетина на мультипликацию побегов и ризогенез в культуре ткани Рори1ш /гети/а Ь. Оценку проводили по пяти критериям: общая длина побегов, количество побегов, количество междоузлий, общая длина корней и количество корней.
Результаты и обсуждение. Полученные экспериментальным путем данные, показали наличие положительного эффекта при совместном использовании ауксинов и цитокининов.
Наибольшее количество побегов - 2,7 шт., образовалось на питательной среде
МБ, дополненной 0,1 мл/л ИМК + 0,5 мл/л БАЛ (вариант 16). Наименьшее количество побегов - 0,6 шт., образовалось на питательной среде МБ, дополненной 0,03 мл/л ИУК + 0,1 мл/л Кн (вариант 32) (таблица - 2)
Таблица 2 - Эффект влияния фитогормонов на количество побегов в культуре ткани Рори1и$ 1гети1а
Ауксины Б/Г ИМК ИУК
Цитокинины 0,03 од 0,3 0,03 од 0,3
Б/Г 1,4 1,5 1,6 1Д 1,1 1,2 1,3
БАП ОД 1,4 1,5 2,2 1,3 1,3 1,6 1,4
0,5 1,5 1,7 2,7 1,8 0,8 1,6 1,9
1,0 1,7 2,0 1,8 1,2 1,8 1,2 1,7
Кинетин од 2Д 1,7 1,6 1,3 0,6 1Д 1,3
0,5 2Д 2,0 1,7 1,9 0,7 1,3 1,5
1,0 1,6 2,0 1,5 1Д 2Д 1,0 1,7
Примечание: В окрашенных ячейках, представлено среднее количество побегов, шт.
Наибольшую длину побегов (7,7 см) получили у растений, культивируемых на питательной среде МБ, дополненной 0,1 мл/л ИМК + 0,5 мл/л БАЛ (вариант 16). Наименьшую длину побегов (1,6 см) получили у растений, культивируемых на питательной среде МБ, дополненной 0,03 мл/л ИУК + 0,5 мл/л БАЛ (вариант 30) (таблица - 3).
Таблица 3 - Эффект влияния фитогормонов на общую длину побегов в культуре ткани Рорп1и$
/гети1а.
Ауксины Б/Г ИМК ИУК
Цитокинины 0,03 од 0,3 0,03 од 0,3
Б/Г 4Д 6,9 6, 5,5 3,0 3,0 5,0
БАП ОД 4,4 5Д 7,3 4,0 3,4 4,3 5,3
0,5 3,2 2,9 7,7 3,8 1,6 5,4 2,8
1,0 3,0 2,6 3,7 2,2 3,7 1,8 2,8
Кинетин од 6,4 6,0 6,2 5,4 2,9 4,0 4Д
0,5 3,7 4,7 4,2 5,5 зд 3,8 3,0
1,0 3,3 5,4 4,4 2,7 4,8 2,6 2,8
Примечание: В окрашенных ячейках, представлены значения средней общей длины побегов, см.
Наибольшее количество междоузлий - 16,9 шт., образовалось на питательной среде МБ, дополненной 0,1 мл/л ИМК + 0,1 мл/л БАЛ (вариант 15). Наименьшее
количество междоузлий - 3,5 шт., образовалось на питательной среде МБ, дополненной 0,03 мл/л ИМК +1,0 мл/л Кн (вариант 27) (таблица 4)
Таблица 4 - Эффект влияния фитогормонов на количество междоузлий побегов в культуре ткани __________________________________ Рори1т 1гепт1а.__________________________________
Ауксины Б/Г ИМК ИУК
Цитокинины 0,03 од 0,3 0,03 од 0,3
Б/Г 8,8 12,7 13,9 п,з 3,5 5,0 8,3
БАП ОД 9,0 11,2 16,9 9,4 4,6 8Д 9,5
0,5 7,7 9,0 14,6 13Д 2,4 10,0 6,9
1,0 7,9 12,3 7,3 7,0 5,7 4,2 5,9
Кинетин од 12,8 13,0 ПД 9,0 3,4 7,3 7,2
0,5 7,2 юд 8,0 7Д 3,6 7Д 7,5
1,0 6,7 12,0 7,9 3,5 6,2 5,8 6,2
Примечание: В окрашенных ячейках, представлено среднее количество междоузлий, шт.
Наибольшее количество корней (3,2 шт) образовалось на питательной среде МБ, дополненной 0,3 мл/л ИМК (вариант 21). На средах, дополненных 0,3 мл/л ИУК + 0,1 мл/л БАЛ (вариант 45), 0,03 мл/л ИУК + 0,1 мл/л БАЛ (вариант 31) - образования корней не наблюдалось (таблица - 5).
Таблица 5 - Эффект влияния фитогормонов на количество корней в культуре ткани РориИ/э 1гепт1а.
Ауксины Б/Г ИМК ИУК
Цитокинины 0,03 од 0,3 0,03 од 0,3
Б/Г 1,3 од 1,6 3,2 0,8 0,5 2,4
БАП ОД 1,4 2Д 1Д 1Д 0,6 1,0 2,5
0,5 0,5 1Д 1Д 0,3 од 0,2 од
1,0 0,3 0,5 0,4 од 0,0 од 0,0
Кинетин од 0,9 0,2 1,3 1,2 0,7 1,6 2,4
0,5 од 1,9 0,5 0,8 0,5 0,8 0,6
1,0 1,4 0,8 0,5 0,2 0,4 0,4 0,2
Примечание: В окрашенных ячейках, представлено среднее количество корней, шт.
Корни наибольшей длины образовались на питательной среде МБ, дополненной 0,3 мл/л ИМК (вариант 21) - средняя длина корней - 7,6 см (таблица 6).
Таблица 6 - Эффект влияния фитогормонов на длину корней в культуре ткани Рорп1и$ Iгеппйа.
Ауксины Б/Г ИМК ИУК
Цитокинины 0,03 од 0,3 0,03 од 0,3
Б/Г 3,4 4,2 3,7 7,6 1,9 2,0 4,8
БАП ОД 3,8 2,9 зд ЗД 0,5 2,2 4,3
0,5 1,3 0,6 3,0 0,9 од 0,4 0,4
1,0 0,6 0,6 1,2 0,4 од од 0,0
Кинетин од 2,5 5Д 4,6 3,6 1,8 3,6 5,0
0,5 0,2 2Д 1,8 2,2 1,6 1,7 1,4
1,0 0,4 2,4 1,3 0,5 0,9 1,0 0,2
Примечание: В окрашенных ячейках, представлено общая длина корней, см.
В вариантах сред - №№ 21, 39, 42, 43, 46, где концентрация ауксинов значительно превосходит концентрацию цитокининов, или цитокинины отсутствуют
- наблюдается активное развитие корней. Интересно отметить, что в среде № 11, где концентрация ауксина ИМК - 0,03 мл/л, меньше концентрации кинетина - 0,1 мл/л, также наблюдается активный ризогенез.
В вариантах питательных сред под номерами - 4, 14, 15, 16, наблюдается активное побегообразование. В средах №№ 14, 15, 16 - одинаковая концентрация ауксина ИМК - 0,1 мл/л. Различаются эти среды по содержанию БАП: среда № 15 содержит 0,1 мл/л БАП, среда № 16 - 0,5 мл/л БАП. А среда № 14 вообще не содержит цитокининов. В среду №4 был добавлен кинетин, в количестве 0,1 мл/л.
Обобщив полученные данные, можно сказать, что для интенсивной пролиферации побегов Populus tremula в культуре in vitro необходимо использовать питательную среду MS дополненную 0,1 мл/л ИМК и 0,1 или 0,5 мл/л БАП. Для интенсивного ризогенеза Populus tremula в культуре in vitro необходимо использовать питательную среду MS, дополненную 0,3 мл/л ИМК.
Выводы
Соотношение фитогормонов в питательной среде, является ключевым фактором, определяющим активность ростовых процессов растительных клеток культивируемых in vitro. Ауксины и цитокинины - играют важнейшую роль в индукции побегообразования и ризогенеза. Так в питательных средах, где
концентрация ауксинов превосходила концентрацию цитокининов или цитокинины отсутствуют, наблюдали активное развитие корней. Анализ полученных данных позволяет заключить, что оптимальным для индукции корнеобразования является двадцать первый вариант среды, в котором концентрация ИМК равна 0,3 мл/л, а цитокинины отсутствуют. Таким образом, 21 вариант среды может быть рекомендован для инициации ризогенеза в эксплантах ткани Populus tremula. Для интенсивной пролиферации побегов Populus tremula в культуре in vitro рекомендуем использовать 15 и 16 варианты питательных сред. Соотношение гормонов в которых -0,1 мл/л ИМК и 0,1 или 0,5 мл/л БАИ соответственно.
Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на на 2007 - 2013 годы» при финансовой поддержке Минобрнауки России (Государственный контракт №14.518.11.7055 от 20.07.2012 г.) на базе Биотехнологического комплекса по воспроизводству высших растений в условиях «чистой комнаты».
Список литературы:
1. Газизуллин А.Х., Чернов В.И., Гарипов Н.Р., Исмагилов Р.И. Формы осины в лесах республики Татарстан // Аграрная Россия - М., 2009 - спец. выпуск - С. 19-20.
2. Петрова Г.А. Использование методов биотехнологии для получения здорового посадочного материала осины (populus tremula 1.) в условиях республики Татарстан: Автореф. дис. ... канд. с.-х. наук. - М., 2011. - 25 с.
3. Зонтиков Д.Н., Коренев И.А. Морфологический и анатомический анализ некоторых морфотипов Populus tremula I. в Костромской области // Материалы международной научно-практической конференции 22-23 марта 2011 г., Санкт-Петербург, ФГУ «СПбНИИЛХ» - С. 41-43.
4. Darlington, C.D., and Wylie, А.Р. 1956. Chromosome atlas of flowering plants. MacMillan Co., New York.
5. Сергеев P.В. Селекция и технология микроклонального размножения ивы остролистной (Salix acutifolia Willd.): Дис. канд.с.-х. наук. - Йошкар - Ола, 2011. - 105 с.
6. Аубакирова JI.C, Калашникова Е.А. Интенсификация выращивания лесопосадочного
материала // Биотехнология. Теория и практика - Астана, 2011 - Вып. №2 - С. 19-24.
References
1. Gazizullin А.Н., Chernov V.I., Garipov N.R., Ismagilov R.I. Formy osiny v lesah respubliki Tatarstan // Agramaja Rossija - М., 2009 - spec, vypusk - S. 19-20.
2. Petrova G.A. Ispol'zovanie metodov biotehnologii dlja poluchenija zdorovogo posadochnogo materiala osiny (populus tremula 1.) v uslovijah respubliki Tatarstan: Avtoref. dis. ... kand. s.-h. nauk. - М., 2011.-25 s.
3. Zontikov D.N., Korenev I.A. Morfologicheskij i anatomicheskij analiz nekotoryh morfotipov Populus tremula 1. v Kostromskoj oblasti // Materialy mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii 22-23 marta 2011 g., Sankt-Peterburg, FGU «SPbNIILH» - S. 41-43.
4. Darlington, C.D., and Wylie, A.P. 1956. Chromosome atlas of flowering plants. MacMillan Co., New York.
5. Sergeev R.V. Selekcija i tehnologija mikroklonal'nogo razmnozhenija ivy ostrolistnoj (Salix acutifolia Willd.): Dis. kand.s.-h. nauk. - Joshkar- Ola, 2011. - 105 s.
6. Aubakirova L.S, Kalashnikova E.A. Intensifikacija vyrashhivanija lesoposadochnogo materiala // Biotehnologija. Teorija i praktika - Astana, 2011 - Vyp. №2 - S. 19-24.
