CC BY
266
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 581.085
О.К. Таварткиладзе, Н.А. Вечернина Размножение ежевики в культуре in vitro
Методы биотехнологии позволяют осуществить ускоренное размножение новых форм, сортов и даже единичных экземпляров растений. Основываясь на моделях органогенеза, выделяют три основные модели микроразмножения растений:
- получение каллуса с последующей индукцией органогенеза или соматического эмбриоидогенеза;
- индукция развития побегов или соматических эмбриоидов непосредственно из ткани экспланта;
- пролиферация пазушных побегов.
Каждая из этих моделей характеризуется различной степенью надежности в отношении сохранения генетической стабильности размножаемых форм, универсальности для определенного круга растений, коэффициента размножения, воспроизводимости результатов.
При клональном микроразмножении предпочтение отдается методам, базирующимся на культивировании верхушек побегов. К культуре верхушек побегов относят экспланты, которые называют либо стеблевыми апексами, либо стеблевыми апикальными меристемами, либо верхушками побегов. Для подавляющего большинства растений эти типы эксплантов более всего отвечают требованию, с одной стороны, получения генетически однородного посадочного материала, а с другой стороны, наличия достаточно высокого коэффициента размножения. Объясняется это тем, что в почках локализуются недифференцированные, генетически однородные меристематические клетки, которые легче вступают на путь органогенеза, чем зрелые дифференцированные клетки других органов. Кроме того, почки представляют собой сформированный рудиментарный побег, хорошо защищены чешуей и легко могут быть подвергнуты процедурам поверхностной стерилизации [1, с. 93; 2, с. 27; 3, с. 137].
В нормальных условиях рост пазушных почек не проявляется, так как их развитие заторможено апикальным доминированием. Торможение роста пазушных почек обусловлено влиянием лидирующего побега. В основе метода размножения путем активации пазушных меристем лежит процесс снятия апикального доминирования. Для достижения интенсивного роста побегов необходимо удалить апекс стебля или добавить в питательную среду цитоки-нин. Взаимодействие эндогенного ауксина, который участвует в явлении апикального доминирования, с другими фитогормонами, в частности с цитокини-ном, приостанавливает рост верхушечной почки и стимулирует развитие пазушных почек.
Поскольку каждый вид и даже сорт растений предъявляет свои специфические требования к условиям
культивирования, целью работы явилось изучение влияния регуляторов роста на регенерацию и микроразмножение in vitro бесшипой ежевики садовой.
Объекты и методы исследования. Объектом исследования явилась перспективная форма бесшипой садовой ежевики. Латеральные почки поверхностно стерилизовали в 0,1% растворе сулемы в течение 15 мин, а затем четырежды промывали в стерильной дистиллированной воде. В качестве первичных экс-плантов были использованы меристемы (0,5-1,0 мм), выделенные из них в стерильных условиях ламинар-бокса с использованием стереомикроскопа МБС-9. Меристемы помещали на основную питательную среду Гамборга В5, дополненную, в зависимости от цели эксперимента, одним из следующих регуляторов роста: цитокинином 6-бензмиламинопурином (БАП), ауксинами - а-нафтилуксусной кислотой (НУК) или Р-индолилмасляной кислотой (ИМК).
Культивирование проводили при 24±1 0С, в условиях фотопериода 16/8 часов свет/темнота. Период субкультивирования составлял 25-30 суток. В конце пассажа учитывали высоту побегов, мм, количество регенерировавших почек, шт., наличие каллуса на базальной части побегов, + / -, общее количество корней, шт., и их длину, см, количество укоренившихся растений, шт.
Результаты исследований и их обсуждение. На этапе введения в асептическую культуру эксплан-тов указанный режим поверхностной стерилизации оказался приемлемым, что позволило ввести в культуру in vitro 85% растительного материала: из 20 шт. почек 17 шт. оказались неинфицированными и жизнеспособными. В последующем, на этапе собственно размножения бесшипой формы ежевики, изучено влияние различных концентраций БАП. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Во многих экспериментах продемонстрирована высокая эффективность БАП в отношении снятия апикального доминирования. Примером могут служить растения винограда [4, с. 11], ряд клоновых подвоев яблонь [5, с. 346], черной и красной смородины [6, с. 22], сливы [7, с. 74]. Как видно из представленных в таблице данных, при культивировании пазушных почек ежевики на среде В5, содержащей невысокие концентрации БАП (0,5 мкМ), регенерировали 1-2 побега, тогда как увеличение концентрации ци-токинина приводило к регенерации большого числа почек, но они, как правило, не развивались в побеги по причине явления апикального доминирования. Вероятно, для ежевики концентрации цитокинина (5-10 мкМ) являются высокими. Поэтому на вто-
Размножение ежевики в культуре in vitro
Таблица 1
Влияние концентрации БАП на рост и развитие побегов бесшипой ежевики в культуре пазушных почек in vitro, n = 10
Показатели БАП, мкM
0.5 1.0 2.0 5.0 10.0
Число почек, штУэкспл. 1.2±02 5 ±0.8 8.2±0.5 11.2±1.2 15.4±1.5
Высота побегов, мм 2.2±0.1 1.5±0.5 0.7± 0.5 0.3 0.2
Kаллус, +I- - - - + +
Таблица 2
Влияние ауксинов на укоренение побегов бесшипой ежевики in vitro, n=10
Регуляторы роста Kонцентрация, мкM Укоренение, % Число корней, штУэкспл. Длина корней, см Kаллус, +I-
HyK 0.5 90 2.2±0.5 1.2 ±0.5 +
2.0 90 2.1±0.6 3.1±0.8 +
MMK 5.0 60 1.4±0.5 1.5±0.5 +
0.5 80 2.5±1.2 2.1±1.2 -
2.0 100 4.2±1.1 5.6±1.4 -
5.0 70 2.2±0.8 3.0±1.1 +
ром этапе микроразмножения применили прием чередования питательных сред с высокой и низкой концентрацией БАП. Использовать БАП выше 5 мкМ оказалось нецелесообразно, так как, несмотря на то, что коэффициент размножения на этой среде самый высокий (15), почки были гипергидратиро-ваны, и даже при переносе на среду с пониженной концентрацией цитокинина большинство из них не развивались в нормальные побеги. Кроме того, при относительно высокой концентрации цитоки-нина происходило формирование каллусной массы на базальной части.
Побеги, развившиеся на среде с 0,5 мкМ БАП, использовали на третьем этапе микроразмножения
- этапе укоренения. Для этого их пересаживали на среду с редуцированным вдвое минеральным составом и различными концентрациями одного из ауксинов: ИМК или НУК (0,5, 2,0 или 5 мкМ) (табл. 2). Нами установлено, что лучшим стимулятором ризогенеза для побегов ежевики явилась ИМК в концентрации 2 мкМ. В этом варианте ризогенез не сопровождался каллусогенезом базальных частей побега, и у каждого побега регенерировало по 4-5 корней. Использование другого стимулятора ризогенеза - НУК приводило к развитию каллуса. Такой результат получали даже в том случае, если НУК была добавлена в состав
питательной среды в относительно небольшой концентрации (0,5 мкМ). Кроме того, регенерировавшие корни имели ненормальную морфологию (широкие, плоские), были ломкими.
От растений-регенерантов были взяты одноузловые черенки (при этом побег с 2-3 узлами и корневой системой использовался для высадки в почвенный субстрат) и помещены на среду для регенерации корней с 2 мкМ ИМК. Так же как и побеги, они укоренялись. Такой способ размножения (микрочеренкование) при использовании одной только среды (для укоренения) позволил получать коэффициент размножения 4-5 за один пассаж. Этот подход также может быть использован для микроразмножения ежевики.
Заключение. Изучена регенерационная способность пазушных почек бесшипой ежевики и установлено, что на этапе собственно размножения наиболее целесообразно использование невысоких концентраций БАП (0,5-1 мкМ). Для укоренения полученных побегов в редуцированную вдвое по минеральному составу основную питательную среду необходимо вводить 2 мкМ ИМК. При продолжительном процессе микроразмножения для ежевики можно применять микрочеренкование побегов. Культивирование микрочеренков с 2-3 пазушными почками необходимо проводить на среде с 2 мкМ ИМК.
Библиографический список
1. Bonga, J.M. Applications of tissue culture in forestry I J.M. Bonga II Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue and organ culture, Ed. by Reinert J., Bajaj Y.P.S. - 1977.
- Pt. 5.
2. Туровская, H.R Mикроклональное размножение малины I H.K Туровская, О.В. Стрыгина II Садоводство и виноградарство. - 1990. - №8.
3. Катаева, Н.В. Клональное размножение растений в культуре тканей / Н.В. Катаева, В.А. Аветисов // Культура клеток растений. - М., 1981.
4. Zlenko, V.A. In vitro propagation of grapevine. Part I. Cultivation of shoot apexes and in vitro proliferation of axillary grapevine buds / V.A. Zlenko, L.P. Troshin, I.V. Kotikov // Vitis: Viticulat. And Enol. Absir. - 1999. - 38. - №3.
биологические науки
5. Свитайло, A.M. вокальное микроразмножение подвоев и сортов плодовых культур I A.M. Свитайло, П.Е. Бондаренко, КС. Шевчук II Биология культивируемых клеток и биотехнология. - Швосибирск, 1988. - Т. 2.
6. Высоцкий, ВА. Mикроразмножение здорового посадочного материала ягодных культур I ВА. Высоцкий,
З.Т. Тарашвили // Садоводство. - 1982. - №2.
7. Shibli, R.A. In vitro multiplication of bitter almond (Prunus amygdalus) from North. Jordan / R.A. Shibli, A.C. Jaradat, M.M. Ajloni, S. Aijanabi // In vitro Cell. and Dev. Biol. Anim. -1996. - 32. - №3. - Pt. 2.
