CC BY
96
Turczaninowia 20 (4): 219-222 (2017) DOI: 10.14258/turczaninowia.20.4.20 http://turczaninowia.asu.ru
ISSN 1560-7259 (print edition)
TURCZANINOWIA
ISSN 1560-7267 (online edition)
УДК 581.143.6:582.475
Оптимизация протокола микроклонального размножения магнолии Суланжа (Magnolia х soulangeana Soul.-Bod.)
Ключевые слова: культура in vitro, микроклональное размножение, ризогенез, фитогормоны, Magnolia х soulangeana.
Аннотация. Исследование проведено с целью разработки эффективного протокола для микроклонального размножения Magnolia х soulangeana Soul.-Bod. (магнолии Суланжа) из пазушных почек. Найдена эффективная схема поверхностной стерилизации почек. Наилучшим стерилизующим раствором оказался тимеразол (мертиолят) в 0,1%-й концентрации. В культуре in vitro было испытано несколько вариантов питательных сред с различным сочетанием фитогормонов. В итоге была выявлена наиболее подходящая схема размножения. Наиболее эффективным составом для инициации побегов in vitro оказалась среда MS c половинным составом солей. Для мультипликации побегов наиболее подходящей оказалась среда QL с добавлением BAP (1 мг/л). Для стимуляции корнеобразования мериклоны переносили на среду WPM с добавлением НУК (0,5 мг/л). Укоренившиеся побеги адаптировали к тепличным условиям. Для этого использовали субстрат в виде смеси торфа, земли и песка в равных пропорциях. Адаптированные растения высаживали в открытый грунт.
Key words, in vitro culture, Magnolia x soulangeana, micropropagation, phytohormones, rhizogenesis.
Summary. This study was aimed to develop an efficiently repetitive protocol for micropropagation of Magnolia x soulangeana using shoot meristem. The effective scheme of bud surface sterilization was found. In our opinion the best sterilizing agent was thimerosal in concentration of 0,1 %. After growing in vitro cultures on different combinations of hormones, mediums supplemented with BAP, IAA, NAA, IBA were found to be most efficient and productive combination for shoot proliferation. MS medium with half salt composition showed itself as the most effective composition for shoot initiation in vitro. The most adequate for shoot multiplication was QL medium with adding BAP (1 mg/l). The proliferated shoots were transferred to different root induction media, which resultantly showed that WPM media supplemented with NAA (0.5 mg/l) was the most efficient root inducing media. Rooted plants were adapted to the green house conditions. For these purposes we used substrate consisted of turf, soil and sand in equal parts. Finally, these plants were successfully established in soil.
М. М. Середа, Е. В. Луценко, А. В. Верещагина
Южный федеральный университет, ул. Ботанический спуск, 7, г. Ростов-на-Дону, 344041, Россия.
E-mail: [email protected]
Optimization of in vitro micropropagation for Magnolia х soulangeana Soul.-Bod.
M. M. Sereda, E. V. Lutsenko, A. V. Vereshchagina
Southern Federal University, Botanicheskiy Spu.sk st., 7, Rostov-on-Don, 344041, Russia.
Поступило в редакцию 25.10.2017 Принято к публикации 05.12.2017
Submitted 25.10.2017 Accepted 05.12.2017
Середа М. М. и др.
Оптимизация протокола микроклонального размножения Magnolia х soulangeana
Введение
Магнолия Суланжа (Magnolia х soulangeana Soul.-Bod.) - ценная декоративная культура. Представляет собой сильно ветвистый кустарник или небольшое дерево с чередующимися, простыми, блестящими, темно-зелеными овальными листьями на толстых стеблях. Цветки крупные, обычно 10-20 см в диаметре, окрашены в различные оттенки белого, розового и темно-бордового цветов, появляются до распускания листьев весной (Gardiner, 2000).
Magnolia х soulangeana является гибридом магнолии обнаженной и магнолии лилиецветной (М. denudata Desr. х М. liliflora Desr.), полученным Этьеном Суланжем во Франции в 1820 г. С тех пор было зарегистрировано более 50 форм этой магнолии. Практически каждый сеянец, выращенный из семян, полученных в результате обратного скрещивания и неконтролируемого опыления, представляет собой новый гибрид, поэтому использование семенного размножения нежелательно (Radomir, 2012).
Ряд видов рода Magnolia L. представляет фармакологическую ценность и также нуждаются в быстром и продуктивном размножении (Ziaev et al., 1999; Syu et al., 2004; Yu et al., 2012).
Разработка методов микроклонального размножения магнолии начиналась с применения соматического эмбриогенеза (Degivry, 1970; Merkle, Watson-Pauley, 1993; Merkle, 1999; Kim et al., 2007; Park et al., 2012), затем стал применяться метод активации пазушных меристем (Kamenicka, Valova, 1994; Kamenicka, Lanakova, 2000; Sokolov et al., 2014). Экземпляры магнолии Суланжа из коллекции Ботанического сада Южного федерального университета (далее ЮФУ) малоэффективно размножались методом активации пазушных меристем, как предлагают указанные выше авторы, а путь размножения через соматический эмбриогенез является более длительным по времени и трудоемким.
Цель настоящей работы состояла в оптимизации протокола микроразмножения Magnolia х soulangeana, генотипов, представленных в коллекции Ботанического сада ЮФУ.
Материалы и методы
Микроразмножение осуществлялось методом активации пазушной меристемы. В качестве первичного экспланта была взята пазушная почка маточного растения из дендрологической коллекции Ботанического сада ЮФУ. Перед стерилизацией почки отмывались в водопроводной воде с несколькими каплями TWIN в течение 20
мин. Затем они обрабатывались 1%-м раствором фундазола (30 мин.) и промывались в стерильной воде. Дальнейшая стерилизация почек проводилась в двух вариантах с применением таких стерилизующих агентов, как 0,1%-й раствор тимеразола, либо 0,1%-й раствор сулемы. Время экспозиции варьировали. Стерилизация и высадка эксплантов на среду осуществлялась в ламинар-боксе.
Для культивирования были использованы среды Murashige and Skoog basal medium (МС) (Murashige, Skoog, 1962), Quoirin and Lepoivre (QL) (Quoirin, Lepoivre, 1977) и среда Maccown (WPM) (Maccown, 1981) с применением 6-бен-зиламинопурина (БАП), нафтилуксусной кислоты (НУК), индолилмаслянной кислоты (ИМК) и глутамина.
Стерилизация сред проводилась в автоклаве при температуре 121 °С в течение 20 мин. В качестве гелеобразующего средства применялся агар (6 г/л). Ph среды доводился до значения 5,8 с помощью 1 М раствора KOH. Культуры помещались в условия 16-часового фотопериода при температуре 25 °С под флуоресцентные лампы, обеспечивающие фотосинтетически активную радиацию величиной в 18 цмоль/м2/сек.
Результаты и их обсуждение
Стерилизация 0,1%-м раствором сулемы более 3 мин. приводила к гибели эксплантов. Наилучший результат наблюдался при стерилизации 0,1%-м раствором тимеразола (мертиолят) с экспозицией 20 мин. (табл.). Выяснилось, что оптимальная схема стерилизации почек Magnolia х soulangeana следующая: 1%-й раствор фундазола (30 мин.) ^ промывка в стерильной воде (5 мин.) ^ 70%-й этанол (1 мин.) ^ 0,1%-й тиме-разол (15-5 мин.) ^ стерильная дистиллированная вода (3 раза по 15 мин.).
После стерилизации экспланты высаживались на среду МС с половинным содержанием солей с целью инициировать развитие меристемы. На 4-й неделе культивирования отмечалось появление новых листьев и рост побегов в длину. Для мультипликации побегов испытывались среды QL с добавлением 1 мг/л БАП и МС с добавлением 1,5 мг/л БАП или 0,5 мг/л БАП. Побеги, которые культивировались на среде МС, отставали в развитии от побегов на среде QL, что выражалось в укороченности побегов и меньших размерах листьев к четвертой неделе культивирования. Коэффициент размножения во всех вариантах не выходил за пределы 4-5. Таким образом, более продуктивная мультиплика-
Turczaninowia 20 (4): 219-222 (2017)
221
Таблица
Эффективность поверхностной стерилизации Magnolia х soulangeana
Стерилизующий агент Экспозиция, мин. Свободные от контаминации экспланты, % Погибшие экспланты, %
Сулема, 0,1%-й раствор 3 0 100
5 10 100
7 90 100
Тимеразол, 0,1%-й раствор 15 30 70
20 90 20
25 98 90
ция наблюдалась на среде QL с добавлением 1 мг/л БАП (рис. 1а, Ь).
Стоит отметить, что после 3-5 пассажей наблюдалось замедление роста и снижение эффективности мультипликации. Для восстановления коэффициента размножения каждый 4-й пассаж проводили на безгормональную среду.
Наибольшие затруднения вызвал этап укоренения. Данной проблеме в литературе уделяется особое внимание (Катешска, 1996, 1998).
Для укоренения нами были испробованы среды Уайта, МС с половинным содержанием солей без гормонов и с добавлением 4 мг/л ИМК, QL с добавлением 4 мг/л ИМК (Kamenicka, Lana-kova, 2000; Radomir, 2012; Sokolov et al., 2014), а также среда WPM с половинным содержанием солей с добавлением 0,5 мг/л НУК (Boboshko-Bardin, 2015). После 3 недель культивирования ризогенез отмечался только на среде WPM с добавлением 0,5 мг/л НУК (рис. 1c), при этом уко-
Рис. 1. Magnolia х soulangeana в условиях эксперимента: a, b - на среде QL с добавлением 1 мг/л БАП; c - развитие корней на среде WPM с добавлением 0,5 мг/л НУК; d - адаптация регенерантов к условиям теплицы.
Середа М. М. и др.
Оптимизация протокола микроклонального размножения Magnolia х soulangeana
ренилось лишь 80 % побегов, и на среде QL с добавлением 4 мг/л ИМК укоренилось только 20 % побегов.
После укоренения растения высаживались на торф и помещались в тепличные условия для адаптации к условиям закрытого грунта (рис. Ы).
Выводы
В ходе проделанной работы был оптимизирован протокол микроразмножения магнолии Суланжа и выяснено, что наиболее эффективно стерилизация пазушных почек происходила в 0,1%-м растворе тимеразола в течение 20 мин.
Установлено, что оптимальной средой для мультипликации является среда QL с добавлением 1 мг/л БАП, а наиболее эффективный ри-зогенез наблюдается на среде WPM с половин-
ным содержанием солей с добавлением 0,5 мг/л НУК.
Наиболее эффективно адаптация к условиям закрытого грунта проходит с использованием торфяного субстрата.
Благодарности
Работа выполнена в рамках базовой части НИР 6.6222.2017/БЧ «Разработка стратегии, методов и технологий сохранения и рационального использования биологического разнообразия в условиях природных и урбанизированных территорий степной зоны европейской части России» на базе лаборатории клеточных и геномных технологий растений Ботанического сада ЮФУ, а также с использованием оборудования ЦКП «Биотехнология, биомедицина и экологический мониторинг» и ЦКП «Высокие технологии».
REFERENCES / ЛИТЕРАТУРА
Boboshko-Bardin I. M. 2015. Features rhizogeny explants Kobus magnolia (Magnolia kobus DC.) culture in vitro. Scientific Bulletin of National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine 216(1): 109-115.
Degivry M. T. 1970. Dormance de graine associée à une immaturité de l'embryon: Etude en culture in vitro chez Magnolia soulangeana Soul. Bod. et Magnolia grandiflora L. Planta (Berl.) 90(3): 267-271. DOI: 10.1007/BF00387178
Gardiner J. 2000. Magnolias: A Gardener's Guide. Portland, Oregon, 265-280 pp.
Kamenicka A. 1996. Rooting of Magnolia x soulanglana microcuttings. Biologia 51: 435-439.
Kamenicka A. 1998. Influence of selected carbohydrates on rhizogenesis of shoots saucer magnolia in vitro. Âcta Physiologiae Plantarum 20(4): 425-429. DOI: 10.1007/s11738-998-0030-4.
Kamenicka A., Lanakova M. 2000. Effect of medium composition and type of vessel closure on axillary shoot production of magnolia in vitro. Acta Physiologiae Plantarum 22(2): 129-134. DOI: 10.1007/s11738-000-0067-5.
Kamenicka A., Valova M. 1994. The effects of culture media on formation of axillary shoots of Magnolia x sou-langiana Soul.-Bod. in vitro. Annali di Botanica 52: 37-43.
Kim Y. W., Park S. Y., Park I. S., Moon H. K. 2007. Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature seeds of Magnolia obovate Thunberg. Plant Biotechnology Reports 1(4): 237-242. DOI: 10.1007/s11816-007-0037-0.
Merkle S. A. 1999. Somatic embryogenesis in Magnolia spp. Forestry Sciences 55: 387-401. DOI: 10.1007/978-94-017-3032-7_15.
Merkle S. A., Watson-Pauley B. A. 1993. Regeneration of big-leaf magnolia by somatic embryogenesis. Hortic. Sci. 28: 672-673.
Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum 15(3): 473-497.
Park I., Koiso M., Morimoto S., Kubo T., Jin H., Funada R. 2012. Plant regeneration by somatic embryogenesis from mature seeds of Magnolia obovate. Journal of Wood Science 58(1): 64-68. DOI: 10.1007/s10086-011-1212-z.
Quoirin M., Lepoivre P. 1977. Improved media for in vitro culture of Prunus species. Acta Horticulturae 78: 437-442.
Radomir A. M. 2012. Comparative study on the in vitro multiplication potential of Magnolia stellata and Magnolia x soulangiana species. Journal of Horticulture, Forestry and Biotechnology 16(2): 39-44.
Smith M. A., McCown B. H. 1983. A Comparison of Source Tissue for Protoplast Isolation from Three Woody Plant Species. Plant Science Letters 28(2): 149-156.
Sokolov R., Atanassova B., Iakimova E. 2014. Physiological response of in vitro cultured Magnolia sp. to nutrient medium composition. Journal of Horticultural Research 22(1): 49-61. DOI: 10.2478/johr-2014-0006.
Syu W. J., Shen C. C., Lu J. J., Lee G. H., Sun C. M. 2004. Antimicrobial and cytotoxic activities of neolignans from Magnolia officinalis. Chem. Biodivers. 1(3): 530-537. DOI: 10.1002/cbdv.200490046.
Yu S. X., Yan R. Y., Liang R. X. 2012. Bioactive polar compounds from stem bark of Magnolia officinalis. Fitote-rapia 83(2): 356-361. DOI: 10.1016/j.fitote.2011.11.020.
Ziaev R., Stonda H., Sturua M., Abdusamatov A. Tsakadze D. 1999. Alkaloids of Magnolia. Chem. Nat. Comp. 3: 407-408.
