CC BY
38
УДК 663.052
Стасенко А.И., Романова М.В., Белодед А.В.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АДАПТАЦИИ БАКТЕРИЙ XANTHOMONAS САМРЕБТЯШК ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ НА БИОСИНТЕЗ КСАНТАНОВОЙ КАМЕДИ
Стасенко Александра Игоревна, студентка 2 курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Романова Мария Васильевна, аспирант факультета биотехнологии и промышленной экологии; Белодед Андрей Васильевич, к.б.н., доцент кафедры биотехнологии, [email protected] Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20.
В настоящей работе представлено влияние адаптации к окислительному стрессу, вызванному экзогенным пероксидом водорода, на культуру бактерий Xanthomonas campestris и биосинтез ксантана. В результате исследования установлена разница в морфологии неадаптированной и адаптированной культур, выражающаяся в незначительном изменении формы бактерий и цветности культуры. Анализ молекулярной массы, мономерного состава, концентрации синтезируемого ксантана в культуральной жидкости и вязкости его водных растворов показал изменение этих характеристик у полисахарида адаптированной культуры, что может свидетельствовать о положительном влиянии адаптации на биосинтез ксантана и его качественные характеристики.
Ключевые слова: Xanthomonas campestris, экзополисахариды, ксантан, адаптация, окислительный стресс
STUDY OF THE EFFECT OF ADAPTATION OF XANTHOMONAS CAMPESTRIS BACTERIA TO OXIDATIVE STRESS ON XANTHAN GUM BIOSYNTHESIS
Stasenko A.I., Romanova M.V., Beloded A.V.*
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: [email protected]
This paper presents the effect of adaptation to oxidative stress caused by exogenous hydrogen peroxide on the culture of bacteria Xanthomonas campestris and xanthan biosynthesis. As a result of the study, the difference in the morphology of the non-adapted and adapted cultures was established, which is expressed in the insignificant use of the population form and the color of the culture. An analysis of the molecular weight, monomer composition, synthesized xanthan in the culture medium and the viscosity of the liquid of its aqueous solutions showed a change in this characteristic of the selected culture polysaccharide, which may indicate a positive effect of adaptation on xanthan biosynthesis and its qualitative characteristics.
Keywords: Xanthomonas campestris, exopolysaccharides, xanthan, adaptation, oxidative stress
Введение
Ксантан - природный полисахарид, продуцируемый бактериями р. Xanthomonas. Он активно применяется в пищевой промышленности для загущения и стабилизации таких продуктов, как заправки для салатов, соусы, плавленые сыры, в хлебопечении ксантан используется для поддержания формы и текстуры хлебобулочного изделия [1]; в нефтяной промышленности он входит в состав буровых растворов, используемых для закачивания в скважины и пласты [2]. Достаточно популярным является его использование в различных средствах личной гигиены (зубных пастах, шампунях, гелях для душа), средствах по уходу за кожей (кремах, лосьонах), средствах для стирки и уборки помещений [3].
Промышленным продуцентом ксантановой камеди являются аэробные мезофильные бактерии Xanthomonas campestris, которые представляют собой грамотрицательные палочки с оптимальной температурой роста 25-30°С Ксантан является вторичным метаболитом, выделяемым в виде капсул и слизи, которые способствуют выживаемости культуры и её устойчивости к внешним раздражителям и различным стрессовым условиям.
Промышленный синтез ксантана осуществляется путем аэробной ферментации, после проведения которой, полисахарид осаждают из культуральной жидкости спиртом, сушат, измельчают в порошок для дальнейшего использования [4].
Окислительный стресс — это явление, вызванное дисбалансом между производством и накоплением активных форм кислорода (АФК) в клетках и тканях и способностью биологической системы обезвреживать эти реактивные продукты. АФК могут участвовать в различных физиологических процессах и обычно генерируются как побочные продукты кислородного метаболизма у животных, растений, грибов, аэробных бактерий и архей. Значительному увеличению продукции АФК способствуют стрессоры окружающей среды (например, УФ, ионизирующее излучение, загрязняющие вещества и тяжелые металлы) и ксенобиотики (например, антибиотики,
противоопухолевые препараты). Активное образование АФК приводит к повреждению клеток и тканей [5]. Окислительный стресс у бактерий рода Xanthomonas способствует повышению уровня ферментов (каталазы и супероксиддисмутазы), которые защищают микроорганизмы от
ингибирующих рост эффектов [6]. Помимо этого, окислительный стресс способствует увеличению секреции различных веществ, имеющих практическую ценность, например, антибиотика пиоцианина [7], полисахарида ксантана [8]. При культивировании Xanthomonas campestris
окислительный стресс может вызываться различными стрессорами, такими как пероксид водорода [8], неионогенные поверхностно-активные вещества [9] и другими детергентами [10-11].
Простейшая адаптация бактерий к стрессу происходит во время стационарной фазы роста, при которой клетки испытывают нехватку питательных веществ. Многие грамотрицательные бактерии переходят во время стационарной фазы в такое состояние, которое позволяет им оставаться жизнеспособными в течение длительного периода времени. Как правило, во время этого состояния они становятся сверхустойчивыми к такому типу стресса, как оксидативный стресс [12]. Было отмечено, что клетки Xanthomonas в стационарной фазе обладают повышенной устойчивостью к Н202, органическим пероксидам и генераторам супероксидов [13]. В настоящее время регуляторный механизм, контролирующий устойчивость к стрессу у Xanthomonas, в достаточной мере не изучен, а некоторые характеристики ответа на стресс отличаются от ответа других бактерий. Однако общим для различных культур микроорганизмов является то, что воздействие низких концентраций индуктора окислительного стресса - Н2О2, вызывает высокий уровень устойчивости к последующему воздействию даже летальными концентрациями [14].
Экспериментальная часть
В качестве объекта для исследования и адаптации была выбрана культура Xanthomonas campestris В-2228. Оксидативный стресс вызывали внесением в питательную среду сублетальных доз пероксида водорода. С целью определения сублетальной дозы провели культивирование штамма X. campestris в колбах объемом 250 мл на термостатируемом шейкере при 180 об/мин и 27 С, с варьированием концентрации вносимого Н202 в интервале от 0 до 300 мМ Н202. Состав среды был следующим: сахароза - 30 г/л, триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 10г/л. Пероксид водорода вносился по достижении замедленной фазы роста (через 24 часа от начала культивирования). После этого культура инкубировалась в течении часа при комнатной температуре и далее осуществлялся рассев на чашки с питательной средой для проведения количественного учета микроорганизмов методом КОХа. Из рисунка 1 следует, что сублетальной для штамма В-2228 является концентрация пероксида водорода 150 мМ. В данном исследовании за сублетальную концентрацию принимали концентрацию пероксида водорода, при которой в условиях эксперимента наблюдалась выживаемость 0,01% популяции клеток Xanthomonas campestris.
и Э» а>
ч
1 г з 1 ь е 7 о
№ ОМЫ 111ЫХ Обр I (!.'':( , |1 /Л
опытные образцы ■ концентрации пероксида подорода.мМ
Рис. 1. Определение сублетальной концентрации пероксида водорода у исходного штамма Xanthomonas campestris B-2228
Для получения адаптированной культуры провели последовательное пассирование линии продуцента в колбах объемом 250 мл на термостатируемом шейкере при 180 об/мин и 27 С в течение 3 суток. Адаптация проводилась на жидких средах следующего состава: сахароза - 30 г/л, триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 10г/л. Пероксид водорода вносили через 24 часа по достижении замедленной фазы роста бактериями. Параллельно вели контрольную линию продуцента ксантана, пассируемую на той же питательной среде, но без внесения Н2О2. Количество пассажей составило 15. По окончании адаптации полученная адаптированная и контрольная культуры сравнивались между собой как по внешнему виду, количеству, форме и виду образующихся колоний микроорганизмов, а также микроморфологии, так и по способности обеих культур синтезировать ксантан.
Для подтверждения адаптации полученной культуры было проведено повторное определение чувствительности культуры к пероксиду водорода. В эксперименте показано, что при концентрации 150 мМ наблюдается выживаемость чуть менее 10% клеток Xanthomonas campestris, а сублетальная концентрация значительно увеличилась и составила уже 250 мМ H2O2 (рис. 2)
•> зоо „-
Hin
1 2 3 4 5 £
N? опытных образцов, п/п
опытные образцы комцнн i ри цин пероксида над»род«», мМ
Рис. 2. Определение сублетальной концентрации
пероксида водорода H2O2 у адаптированной культуры Xanthomonas campestris
На следующем этапе исследования сравнивалась морфология культур, а также был проведен их количественный учет. Сравнение микроморфологии
культур показало незначительные изменения длины клеток, палочковидная форма клеток адаптированной культуры стала более округлой. Также было отмечено изменение цвета культуры при росте на жидкой питательной среде. Методом Коха было определено, что на момент окончания культивирования (72 ч) количество клеток у адаптированной и контрольной культур составляло 3,97*109 и 3,43*108 КОЕ/мл соответственно.
Для сравнительной оценки способности синтезировать ксантан и характеристики полисахарида, культуры были пересеяны на среду для биосинтеза ксантана следующего состава (г/л): сахароза (50% р-р) - 50, дрожжевой экстракт - 5, М§Б04 - 1, МПБ04 - 0,1, К2НРО4 - 7,5, КН2РО4 - 7,5, (NN4)2804 - 0,5. Объем питательный среды - 35мл, количество вносимого инокулята составляло 10 % от объема питательной среды. рН среды перед стерилизацией доводился до 7,0 раствором 5М №ОН, сахароза стерилизовалась отдельно и вносилась в стерильных условиях перед засевом. Культивирование проводили в колбах объемом 250 мл на термостатируемом шейкере при 180 об/мин и 27 С в течение 5 суток, пероксид водорода вносили через 24 часа по достижении замедленной фазы роста бактериями. Полученный ксантан по окончании процесса культивирования осаждали Таблица 1. Сравнительная характерис
этиловым спиртом в соотношении 1:3, сушили в течении суток в сушильном шкафу, измельчали для дальнейшего анализа. Полученные пробы ксантана сравнивались по молекулярной массе, мономерному составу и вязкости образуемых ими водных растворов.
Определение вязкости полисахаридов проводилось капиллярным вискозиметром ВПЖ - 2 и определялось как произведение времени истечения жидкости через капилляр на постоянную вискозиметра. Для определения постоянной в качестве эталонной жидкости с известной кинематической вязкостью была использована вода.
Определение молекулярной массы ксантана проводилось вискозиметрическим методом с использованием констант уравнения Марка-Хоувинка [15].
Масса ксантана определялась его взвешиванием на лабораторных весах после осаждения из культуральной жидкости и сушки, а концентрация определялась соотношением полученной массы к объему культуральной жидкости.
Сравнительные данные по молекулярной массе, вязкости 2% растворов ксантана, концентрации и массе ксантана приведены в Таблице 1.
ка ксантана контрольной и адаптированной культур
Вязкость, мПа*с Масса ксантана, г Концентрация ксантана, г/л Молекулярная масса, кДа
Контрольная культура 2,3 0,403 16,79 117,42
Адаптированная культура 3,8 0,597 19,9 169,46
Обе пробы были гидролизованы для дальнейшего определения мономерного состава полисахарида с помощью хроматографа Agilent 1220 Infinity LC методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Для гидролиза был приготовлен 2% раствор ксантана каждого образца и 2 М H2SO4. Гидролиз осуществлялся следующим образом: раствор ксантана и раствор H2SO4 смешивали в пробирке в соотношении 1:1. После перемешивания до однородной консистенции все пробы подвергались автоклавированию. Конечные концентрации ксантана и кислоты (в результате смешения), условия гидролиза и последующей нейтрализации представлены в Таблице 2. Гидролиз осуществляли в автоклаве при 0,7 ати в течении 30 минут.
Таблица 2. Условия проведения гидролиза образцов ксантана
Результаты анализа мономерного состава ксантана, полученного после гидролиза, представлены в Таблице 3.
Таблица 3 - Мономерный состав проб после
гидролиза
Результаты Проба хроматографии,
_г/л_
Глюкоза: 0,866 Манноза: 0,824 Пируват: 0,000 Ацетат: 0,254
I = 1,944 Глюкоза: 0,815 Ксантан Манноза: 0,963 адаптированной Пируват: 0,000 культуры Ацетат: 0,294 _ I = 2,072
Анализ результатов эксперимента позволяет сделать вывод о том, что характеристики ксантановой камеди адаптированной культуры в основном соответствуют (качественный состав мономеров), а по некоторым показателям (молекулярной массе, концентрации ксантана в
Проба Состав пробы pH Нейт р ализ ация
Контрольная культура 2% р-р ксантана, 2М H2SO4 6,75 1,89 мл 5М NaOH
Адаптированная культура 6,78 1,85 мл 5М NaOH
Ксантан контрольной культуры
культуральной жидкости) превосходят показатели исходной (неадаптированной) культуры.
Заключение
В результате проделанной работы было показано положительное влияние адаптации к пероксиду водорода культуры Xanthomonas campestris на биосинтез ксантана и его качественные и количественные характеристики: концентрацию, молекулярную массу, вязкость раствора. Отмеченное в ходе исследования изменение морфологии клеток бактерий Xanthomonas campestris является одним из возможных признаков окислительного стресса. Изменения в размере и форме клеток при воздействии окислительного стресса на Xanthomonas campestris отмечалось и другими исследователями [16, 17]. Таким образом, влияние окислительного стресса на культуру Xanthomonas campestris и получение адаптированных культур промышленных штаммов-продуцентов представляет собой большой интерес, и очевидно, что такого рода воздействия могут приводить к положительным практическим эффектам, наиболее важным из которых является влияние на биосинтез ксантана и улучшение его качественных характеристик.
Список литературы
1. BeMiller, J. N. Xanthan. Carbohydrate Chemistry for Food Scientists // Carbohydrate Chemistry for Food Scientists. -2019. - P.261-269
2. Силин М.А., Магадова Л.А., Пономарева В.В., Давлетшина Л.Ф., Мухин М.М. Исследование ксантановых загустителей, применяемых в технологиях кислотного гидравлического разрыва пласта // РГУ нефти и газа им. И.М. Губкина - 2010. - №2. - С. 25-29.
3. Карагулов Х.Г., Евсеева С.Б. Косметические средства на основе лечебных грязей: состав и технологические особенности // Изд.дом "Академия естествознания" - Пенза. - 2015. - 225 с
4. Sworn G. Xanthan gum. Thickening and Gelling Agents for Food, 2nd edn // Aspen Publishers Inc., Gaithersburg, MD, 1999. Vol. 8. - P. 186-203
5. Pizzino G, Irrera N, Cucinotta M, Pallio G, Mannino F, Arcoraci V, Squadrito F, Altavilla D, Bitto A. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health // Oxid Med Cell Longev. -2017. -13p.
6. Ou S.H. Bacterial disease. In: Ou, S.H. // (Ed.), Rice Disease. CAB Int., England, 1987, P. 66-96
7. Rao Y. M., Sureshkumar G.K. Oxidative-stress-induced production of pyocyanin by Xanthomonas campestris and its effect on the indicator target
organism, Escherichia coli. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. - 2000. -V. 25. -I.5. -P.266-272.
8. Cheng R., Lin L., Zhang Y. Hydrogen peroxide (H2O2) supply significantly improves xanthan gum production mediated by Xanthomonas campestris in vitro // J Ind Microbiol Biotechnol. -2012. -V. 39. -P.799-803
9. Ghashghaei T., Soudi M.R., Hoseinkhani S., Shiri M. Effects of Nonionic Surfactants on Xanthan Gum Production: a Survey on Cellular Interactions // Iranian J Biotech. - 2018. -V.16. - I.1. -P. 60-66
10. Janas P., Gustaw W., Mleko S., Pielecki J. Effect of detergents on xanthan production during batch and continuous cultivation of Xanthomonas campestris NRRL B-1459 // Technologia Alimentaria. -2003. -V.2. - I.1. -P. 125-133
11. Galindo E., Salcedo G. Detergents improve xanthan yield and polymer quality in cultures of Xanthomonas campestris. Enzyme Microb Technol. -1996. -V.19. - P. 145-149.
12. Mongkolsuk Sk., Dubbs J.M., Vattanaviboon P. Chemical modulation of physiological adaptation and cross-protective responses against oxidative stress in soil bacterium and phytopathogen, Xanthomonas // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. -2005. -V. 32. - I. 11-12. -687p.
13. Vattanaviboon P, Praitaun W, Mongkolsuk S. Growth phase dependent resistance to oxidative stress in phytopathogen Xanthomonas oryzae pv oryzae // Can J Microbiol. -1995. -V. 41. -P.1043-1047
14. Mongkolsuk S, Sukchawalit R, Loprasert S, Praituan W, Upaichit A. Construction and physiological analysis of a Xanthomonas mutant to examine the role of the oxyR gene in oxidant-induced protection against peroxide killing // J Bacteriol. -1998. - V.180. -P. 3988- 3991
15. Бондалетова Л.И., Сутягин В.М. Вискозиметрический метод определения молекулярной массы: Методическое пособие по выполнению лабораторных работ по курсу «Химия и физика высокомолекулярных соединений» для студентов направления 550800, специальности 250500 // Изд. ТПУ. -2003. - 12 с.
16. Roseiro JC, Esgalhado ME, Amaral-Collaço, Emery AN. Medium development for xanthan production // Process Biochem. -1992. -V. 27. -№3. - P. 167-175
17. Ghashghaei T., Soudi M.R., Hoseinkhani S., Shiri M. Effects of Nonionic Surfactants on Xanthan Gum Production: a Survey on Cellular Interactions // Iranian J Biotech. -2018. -V. 16. -№ 1, - P. 60-66.
