CC BY
46
УДК: 636.087.24:636.084
ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ, В КАЧЕСТВЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОДУЦЕНТОВ КОРМОВОГО БЕЛКА
1 2 3 4 ©
Логвинова Т.И. , Колодина Е.Н. , Артемьева О.А. , Никанова Д.А.
12
Кандидат биологических наук, научный сотрудник; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник; 3кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник; 4младший
научный сотрудник.
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени Л.К. Эрнста
Аннотация
Отбор активных и высокопродуктивных штаммов является важным фактором в производстве кормового белка. Выделены три изолята дрожжей из химуса гибридных животных (архара и овцы романовской породы). Получены их чистые культуры, изучена морфология, биологическая безопасность, определен химический и аминокислотный состав у выделенных изолятов дрожжей. Полученные в ходе научно-исследовательской работы, данные позволяют предположить возможность использования выделенных изолятов дрожжей в качестве продуцентов кормового белка, с последующей отработкой этапов биотехнологического процесса, направленного на повышение продуктивности сельскохозяйственных животных.
Ключевые слова: изоляты дрожжей, кормовой белок, химический состав, аминокислоты, дрожжевая биомасса, токсичность, биологическая безопасность.
Keywords: isolated yeast feed protein, cell morphology, chemical composition, amino acid, yeast biomass, toxicity, biological safety.
Проблема белка - одна из самых актуальных, поскольку кормовая база в настоящее время удовлетворяет потребность животноводства в нем всего на 70-75 %. Постоянный дефицит белка не только снижает продуктивность животных и качество продукции, но и ведет к крайне непроизводительному расходу кормов, удорожанию мяса, молока и других продуктов. Ведь при нехватке в рационах 20-25 % белка расход кормов у животных увеличивается почти в полтора раза.[1].
Отбор активных и высокопродуктивных штаммов микроорганизмов является важным фактором в производстве кормового белка [2].
Цель работы состоит в поиске высокоэффективных продуцентов микробного происхождения выделенных из природных биотопов и изучении свойств штаммов дрожжей для дальнейшего использования их в качестве кормового белка.
Материалы и методы исследований.
Объектами исследований являлись изоляты дрожжей, выделенные из химуса гибридных животных, полученных в результате скрещивания дикой формы архара и овцы романовской породы, содержащихся в условиях физиологического двора ВИЖ им. Л.К.Эрнста.
Эксперименты по изучению выделенных штаммов дрожжей проводились в лаборатории микробиологии ВИЖ им. Л.К.Эрнста.
Для выделения изолятов дрожжевых клеток использовали метод десятикратных разведений рубцового содержимого на 0,9% физиологическом растворе с последующим поверхностным посевом 0,2 мл на агаризованную среду Сабуро с серией последовательных
© Логвинова Т.И., Колодина Е.Н., Артемьева О.А., Никанова Д.А., 2016 г.
пересевов для получения чистых дрожжевых культур [3]. Наращивание матровой расплодки изолята №1 проводили на чашках Петри с плотной селективной средой дрожжевой-агаровой-пептонной (ДАП) [4]. Изоляты №2 и №3 наращивали на модифицированной среде, следующего состава (г/л): сахарный сироп - 90,0, дрожжевой экстракт - 2,0, пептон - 2,0, агар микробиологический - 20,0, рН среды - 5,5. Условия культивирования были общими: 48ч, при температуре 28±20С. Концентрацию бактериальной массы изолятов №1, №2, №3, полученной в результате смыва стерильной водой определяли в камере Горяева, титр которой составил: 2*107; 3*107; 1*107 КОЕ/мл соответственно. Наращивание биомассы дрожжей проводили глубинным методом в жидкой среде в колбах на качалке в течение 18-20 часов при температуре 28±20С, 130 об./мин.
Морфологию клеток определяли методом световой микроскопии.
Качество дрожжевой биомассы, полученной при культивировании оценивали по следующим показателям: влажность, сухое вещество, содержание сырого протеина, сырого жира, БЭВ, массовая доля золы, аминокислотный состав в соответствии с ГОСТ 20083-74[7]. Химический состав определяли в лаборатории химико-аналитических исследований ВИЖ им Л.К.Эрнста по общепринятым химико-аналитическим методикам. Аминокислотный состав определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на Shimadzu LC-30.
Токсичность исследуемых микроорганизмов определяли с применением тест-культур инфузорий Tetrachymena pyriformis. Из исходной концентрации клеток методом серийных десятикратных разведений готовили рабочие растворы. Титр которых находился в диапазоне от 1 • 1011 до 1 • 106 КОЕ/мл. Выживаемость инфузорий N, %, вычисляли по формуле:
N=^•100, (1)
N v '
где N2 среднеарифметическое (из пяти испытаний) число инфузорий через каждые 30 мин. экспозиции, шт.;
N1 - среднеарифметическое (из пяти испытаний) число инфузорий в начале опыта,
шт.;
100 - коэффициент перевода результата в проценты [5].
Эксперимент по изучению токсичных свойств выделенных изолятов дрожжей проводили на крысах самцах линии ВИСТАР массой 70-80г.. Животных разделили на четыре группы по 10 особей: три из которых были опытные и одна контрольная. Животным опытных групп подкожно в область холки инъецировали по 0,5 мл изолятов №1, №2, №3 с концентрацией клеток 1*1011, контрольной группе животных - 0,5 мл стерильной воды. В течение 7 суток ежедневно учитывали физиологическое состояние животных. Эвтаназию экспериментальных животных проводили методом цервикальной дислокации. При вскрытии учитывали патологоанатомические изменения внутренних органов.
Определение степени токсичности изучаемых изолятов дрожжей проводили методом кожной пробы на кроликах породы «Белый великан». На выстриженный участок кожи кролика размером 6х6 см пластиковым шпателем наносили, слегка втирая, половину исследуемой пастообразной массы дрожжей с концентрацией клеток 4,040 КОЕ/г., В качестве контроля использовали оголенный участок кожи, на который не наносили испытуемые образцы. Для оценки возможного инфицирования подопытных животных микроорганизмами в ходе исследований, исследовали кровь на стерильность[6].
Для статистической обработки данных, полученных в результате исследований, использовали программу MS Excel и параметрические методы.
Результаты исследований.
В ходе научно-исследовательской работы была выделена линейка изолятов дрожжевых культур, отличающихся по морфологическим и биохимическим признакам (таблица 1).
Таблица 1
Морфологическая и биохимическая характеристика дрожжевых изолятов
п/п Показатели Изолят дрожжей №1 Изолят дрожжей №2 Изолят дрожжей №3
1 Морфология
колоний: - форма круглая 8±2 мм круглая 9±2 мм круглая 10±2 мм
- размер - поверхность гладкая матовая бугристый гладкая матовая бугристый гладкая глянцевая бугристый
- профиль ровный ровный ровный
- край однородная однородная однородная
- структура
2 Морфологические свойства клеток:
- форма овальная, овальная, овальная, более
- размер - окраска по яйцевидная 5,1 х 3,3 мкм удлиненная 5,5 х 3,2 мкм округлая 3,0 х 1,5 мкм
Граму грамположительные грамположительные гр амположительные
3 Рост на Сабуро (Т культивирования Густой рост, серо-белые колонии, Густой рост, серо-бело-бежевые Густой рост, черные глянцевые колонии с
280С) матовые. колонии, матовые. характерным кисло-сладким запахом.
4 Рост на ДАП (Т Густой рост, Густой рост, Густой рост, колонии
культивирования 280С) колонии светлые серо-бежевого цвета. колонии серо-бежевого цвета серо-бежевого цвета.
Ферментативные свойства
5 Глюкоза
Мальтоза
- - - -
Лактоза + + + + + + + + ----
Маннит ---- ---- ----
Сахароза + + + +
Ксилоза + + + + + + + + + + + +
Ь-Галактоза + + + + + + + + + + + +
Рамноза + + + + + + + + + + + +
Раффиноза + + + + + + + + ++++
Фруктоза
Установлена существенная разница между размерами клеток изолятов №1- 5,1 х 3,3 мкм, №2 - 5,5 х 3,2 мкм и изолята №3 - 3,0 х 1,5 мкм. Колонии изолята №3 на среде Сабуро окрашены в интенсивно черный цвет и имеют характерный устойчивый запах. Отмечается незначительная разница в свойствах ферментации углеводов, при которой титр клеток оказался практически одинаковым в 3 испытуемых образцах.
В результате научно-исследовательской работы был изучен химический и аминокислотный состав изолятов дрожжей (таблица 2).
Таблица 2
Химический и аминокислотный состав изолятов дрожжей, % в сухом веществе
Показатели, % изолят дрожжей № 1 изолят дрожжей № 2 изолят дрожжей № 3
Влажность 73,47 75,58 74,59
Сухое вещество 26,53 24,42 25,41
Сырой протеин 28,98 33,94 44,60
Сырой жир 1,28 1,21 0,78
Сырая зола 3,04 7,32 7,39
БЭВ 60,36 50,83 42,33
Треонин 1,37 1,47 2,40
Метеонин 0,20 0,01 0,36
Лизин 2,02 2,24 3,45
Содержание массовой доли золы (в пересчете на абсолютно-сухое вещество) соответствовало требованиям ГОСТа 20083-74. Значения сырого протеина (%), в исследуемых образцах №1 и №2 были ниже нормы, тогда как образец №3 соответствовал нормам, предъявляемым ко второй и третьей группе [7].
В исследуемом образце дрожжей №3 значение лизина составило 3,45%, а треонина -2,4%, метионина - 0,36%, при массовой доле сырого протеина 44,6%. При этом следует отметить, что уровень содержания метионина был незначительно ниже.
Оценивая результаты, полученные в ходе проведения эксперимента на инфузориях Тв^аекутвпа pyriformis необходимо отметить, что в течение первых 1,5 часов во всех образцах численность клеток, подвижность и характер движения не менялись. По результатам расчетов выявлено, что процент выживаемости инфузорий был выше 80% во всех исследуемых концентрациях рабочих растворов (таблица 3).
Таблица 3
Динамика изменения численности инфузорий
Tetrachymena pyriformis (%).
Название м.о. Разведение Время экспозиции, ч.
0,5 1,0 1,5 2 ,0 2,5 3,0
Выживаемость инфузорий, %
С. аШсапБ ЛМ-2014 106 98,95 97,89 96,84 96,84 96,84 95,79
107 98,96 98,96 97,92 97,92 98,96 98,96
108 98,95 98,95 97,89 97,89 96,84 95,79
109 98,94 97,87 97,87 96,81 96,81 95,74
1010 97,85 95,70 95,70 94,62 94,62 95,70
1011 97,92 96,88 95,83 95,83 94,79 94,79
С. аШсапБ 10231 106 98,92 98,92 98,92 97,85 97,85 97,85
107 98,98 97,96 97,96 96,94 96,94 96,94
108 98,95 97,89 96,84 95,79 94,74 92,63
109 98,94 97,87 96,81 94,68 93,62 92,55
1010 96,81 93,62 89,36 87,23 84,04 82,98
1011 93,68 88,42 84,21 83,16 82,11 80,00
Контроль Стерильная вода 97,87 97,87 97,87 96,81 96,81 96,81
М.о. - микроорганизм
Исходя из данных листа наблюдений за крысами контрольной и опытных групп, можно отметить, что активность, поза, частота дыхания соответствовали физиологической норме. При вскрытии контрольных и опытных животных патологоанатомических изменений внутренних органов не обнаружено.
Метод биотестирования на кроликах (кожная проба) дает возможность учесть дермонекротическое действие токсинов исследуемых объектов на кожу. В результате проведенного эксперимента установлено, что паста клеток изолятов дрожжей не оказала воспалительного действия на кожу опытных кроликов. Исследованные нами образцы крови от опытных животных были стерильны.
Выводы.
Полученные в ходе научно-исследовательской работы, данные позволяют предположить возможность использования выделенных штаммов дрожжей в качестве продуцентов кормового белка, с последующей отработкой этапов биотехнологического процесса, направленного на повышение продуктивности сельскохозяйственных животных.
Литература
1. Новиков Ю.Ф., Рахимов М.М., Ахмаджонов Ш. Т. Выращивание микрогрибов методами твердофазной ферментации// Биотехнология.- 1985. - №4.- С.12-27.
2. Храпова А.В., Сопрунова О.Б. Скрининг новых штаммов дрожжей для получения кормового белка // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011. - Т. 13, №5(3). - С. 210-213.
3. Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. - М.: Пищевая пром-ть, 1979. - 120 с.
4. МУК 4.2.1773-03. Метод микробиологического измерения концентрации клеток Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест.
5. МУ 13-7-2/2156. Методические указания по ускоренному определению токсичности продуктов животноводства и кормов.
6. Инструкция по контролю стерильности консервированной крови, её компонентов, препаратов, консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов. Утв. МИНЗДРАВОМ РФ 29.05.1995.
7. ГОСТ 20083-74 - 1976-07-01. Кормовые дрожжи.
