CC BY
41
УДК 636.087.8:579.8
ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИЗОЛЯТОВ ДРОЖЖЕЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ, ДЛЯ УТИЛИЗАЦИИ УГЛЕВОДОВ, УВЕЛИЧЕНИЯ БИОМАССЫ - ИСТОЧНИКА КОРМОВОГО БЕЛКА
1 2 3 4 ©
Ралкова В.С. , Артемьева О.А. , Колодина Е.Н. , Никанова Д.А.
12
Научный сотрудник; кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник;
3кандидат биологических наук, старший научный сотрудник;
4
младший научный сотрудник.
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени Л.К. Эрнста
Аннотация
В решении проблемы белкового дефицита важная роль отводится производству кормовых дрожжей, получаемых из отходов сельского хозяйства, пищевой промышленности, лесоперерабатывающей промышленности, торфа и др. При этом растительная масса является наиболее перспективным сырьем для получения белка микробиологического синтеза. Отбор активных и высокопродуктивных штаммов является важным фактором в производстве кормового белка. Выделены пять изолятов дрожжей из химуса гибридных животных (архара и овцы романовской породы), содержимого толстого отдела кишечника сельскохозяйственных животных. Получены их чистые культуры, изучена морфология. Проведено жидкофазное и твёрдрфазное культивирование дрожжевых изолятов на средах модифицированного состава. Чувствительность изолятов дрожжей к противогрибковым препаратам проводили диско-диффузным методом. Была изучена способность выделенных изолятов дрожжей ферментировать сахара. Размеры клеток выделенных дрожжей, как перспективный источник кормового белка находились в пределах от 3,0 х 1,5 мкм до 6,7 х 5,0 мкм. Наибольшими параметрами обладает изолят №2.1 в среднем на 24% - 45% в отличие от других происследованных штаммов. Выделенные изоляты №2, 3, 2.1 расщепляют сахарозу при 28°С в течение 18-24 ч. Изолят №2.1 ферментирует L- и D- изомеры галактозы. Согласно критериям интерпретации результатов, определения чувствительности пограничных значений диаметров зон подавления роста все изученные изоляты дрожжей оказались чувствительными к основным противогрибковым препаратам, кроме интраконозола с концетрацией 20 мкг.
Анализируя полученные данные предлагается использовать выделенные перспективные штаммы для переработки вторичных продуктов, содержащих повышенное количество сахаров пищевой и сельскохозяйственной промышленности для получения кормового белка микробного происхождения, необходимого для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных.
Ключевые слова: изоляты дрожжей, кормовой белок, морфология клеток, противогрибковые препараты, дрожжевая биомасса.
Keywords: yeast isolates, protein feed, cell morphology, antifungal drugs, yeast biomass
Специфические структура и физиология дрожжевых клеток обусловливают широкое распространение дрожжей в аутохонной микрофлоре и их богатые биотехнологические возможности [4, 3]. Обширная номенклатура дрожжевых метаболитов (промежуточных продуктов обмена веществ в клетках) обеспечивает очень широкий спектр применения
© Ралкова В.С., Артемьева О.А., Колодина Е.Н., Никанова Д.А., 2016 г.
дрожжей в производственной деятельности человека - от сельскохозяйственного производства до медицины.
Дрожжевую клетку можно рассматривать как кладезь превосходных продуктов питания. Она содержит протеин, витамины, нуклеотиды, аминокислоты и микроэлементы. Химический состав примерно следующий: 75% воды, 25% сухого вещества, которое содержит 18-44% углеводов, 36-60% протеина, 4-8% нуклеиновых кислот, 4-7% липидов и 610% неорганических веществ, в том числе 1-3% фосфора, 1-3% калия и 0,4 серы. Дрожжи содержат массу важнейших микроэлементов и такие витамины, как тиамин, рибофлавин, фолиевую кислоту и др. 8ассЬагошусе8сегеу181ае способны расти в широком интеграле температур (от 5 до 35°С), но оптимальная температура для их воспроизводства 28°С [4, 5].
Дрожжи занимают доминирующее положение в биотехнологии благодаря тому, что продуцируемые ими метаболиты обладают повышенной лабильностью (функциональной подвижностью), которая обусловливает исключительно высокую эффективность ферментативной системы дрожжей. Эта особенность позволяет им выживать при значительных колебаниях температуры, влажности, состава и свойств питательных сред. Дрожжи длительно сохраняют присущие им биосистему и биопотенцию, переходя в анабиоз - состояние, при котором жизненные процессы организма резко замедляются, что способствует его выживанию в неблагоприятных условиях [6, 9]. Широкое использование дрожжевой продукции в жизни и деятельности человека объясняется также тем, что они практически безвредны для животных и растений. Более того, некоторые дрожжи применяют для производства лечебно-профилактических препаратов [1, 6, 7].
Высокий уровень молочной кислоты оказывает негативный эффект на рост полезных бактерий из-за резкого снижения рН в пищеварительном тракте жвачных животных. Дрожжи усиливают рост рубцовых бактерий, которые расщепляют молочную кислоту, что стабилизирует рН в рубце [7].
Дрожжи быстро создают анаэробную среду, идеальную для рубцовых целлюлозолитических бактерий. Они также стимулируют рост специфических рубцовых бактерий, таких, как 8е1епошопаБ [7].
В решении проблемы белкового дефицита важная роль отводится производству кормовых дрожжей, получаемых из отходов сельского хозяйства, пищевой промышленности, лесоперерабатывающей промышленности, торфа и др. При этом растительная масса является наиболее перспективным сырьем для получения белка микробиологического синтеза [7, 8, 9].
Сырьевая база для производства дрожжей практически неограниченна, тем более что дрожжи вырабатывают на предприятиях микробиологической, пищевой и целлюлозно-бумажной промышленности. Производство кормовых дрожжей на отходах способствует не только решению проблемы получения высокоценного белка для животноводства, но и созданию безотходных и малоотходных технологических циклов [4, 5].
Материалы и методы исследований.
Объектами исследований являлись изоляты дрожжей, выделенные из химуса гибридных животных, полученных в результате скрещивания дикой формы архара и овцы романовской породы, содержимого толстого отдела кишечника с/х животных, содержащихся в условиях физиологического двора ВИЖа им. Л.К.Эрнста.
Эксперименты по определению титра клеток исследуемых штаммов дрожжей и наращивание дрожжевой биомассы на плотных питательных средах проводили в лаборатории микробиологии центра биотехнологии и молекулярных исследований.
Для выделения изолятов дрожжевых клеток использовали метод десятикратных разведений на 0,9% физиологическом растворе с последующим поверхностным посевом 0,2 мл на агаризованную среду Сабуро с серией последовательных пересевов для получения чистых дрожжевых культур [8, 9]. Наращивание матровой расплодки изолятов проводили на чашках Петри с плотной селективной средой дрожжевой-агаровой-пептонной (ДАП) [3]. Условия культивирования были общими: 48ч, при температуре 28±20С. Концентрацию
бактериальной массы изолятов №1 - №5 полученной в результате смыва стерильной водой определяли в камере Горяева. Наращивание биомассы дрожжей проводили глубинным и поверхностным методами параллельно на модифицированной среде следующего состава (г/л): сахарный сироп - 90,0, дрожжевой экстракт - 2,0, пептон - 2,0 рН среды - 5,5. Жидкофазное культивирование проводили в колбах на качалке. В среду объёмом 100 мл вносили по 5 мл маточной культуры изолятов с определённой концентрацией при одинаковых условиях культивирования в течение 18-20 часов при температуре 28±20С, 130 об./мин. Твёрдофазное культивирование осуществляли при аналогичных параметрах на матрасе с идентичной питательной средой с добавлением микробиологического агара из расчета 20,0 г/л.
Чувствительность изолятов дрожжей к противогрибковым препаратам проводили диско-диффузным методом с использованием набора в соответствии с инструкцией по применению (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) [2].
Результаты исследований.
В результате ряда последовательных пересевов с агаризованной среды Сабуро в чистые культуры выделены 5 дрожжевых изолятов отличающихся по морфологическим признакам (таб. 1).
Таблица 1
Морфологическая характеристика дрожжевых изолятов
п/п Показатели Изолят дрожжей №1 Изолят дрожжей №2 Изолят дрожжей №3 Изолят дрожжей №2.1 Изолят дрожжей №6
1 Морфология колоний: - форма - размер - поверхность - профиль - край - структура круглая 8±2 мм гладкая матовая бугристый ровный однородная круглая 9±2 мм гладкая матовая бугристый ровный однородная круглая 10±2 мм гладкая глянцевая бугристый ровный однородная овальная 9±2 мм гладкая глянцевые бугристый ровный однородная овальная 8±2 мм гладкая глянцевые бугристый ровный однородная
2 Морфологические свойства клеток: - форма - размер - окраска по Граму овальная, яйцевидная 5,1 х 3,3 мкм грамполо жительные овальная, удлиненная 5,5 х 3,2 мкм грамполо жительные овальная, округлая 3,0 х 1,5 мкм грамполо жительные овальная, яйцевидная 6,7 х 5,0 мкм грамполо жительные овальная, лимоновидная 6,35 х 3,5 мкм грамполо жительные
3 Рост на Сабуро (Т культивирования 280С) Густой рост, серо-белые колонии, матовые Густой рост, серо-бело- бежевые колонии, матовые. Густой рост, черные глянцевые колонии Густой рост, черные, глянцевые. Густой рост, светло-коричневые, глянцевые.
4 Рост на ДАП (Т культивирования 280С) Густой рост, колонии светлые серо-бежевого цвета. Густой рост, колонии серо- бежевого цвета Густой рост, колонии серо- бежевого цвета. Густой рост, колонии черного цвета Густой рост, колонии персикового цвета.
Оценивая размеры клеток выделенных дрожжей, как перспективный источник кормового белка необходимо отметить, что наибольшими параметрами обладает изолят №2.1 в среднем на 24% - 45% в отличие от других происследованных штаммов (таблица 1).
Изучение биохимических свойств является основополагающим в подборе состава модифицированной среды на которой прогнозируется культивирование дрожжей для наибольшего получения выхода биомассы.
Таблица 2
Биохимическая характеристика дрожжевых изолятов
Сахара Ферментативные свойства
Изолят Изолят Изолят Изолят дрожжей Изолят
дрожжей № 1 дрожжей №2 дрожжей №3 №2.1 дрожжей №6
Глюкоза
Мальтоза
Лактоза + + + + + + + + ---- + + + + + + + +
Маннит ---- ---- ---- ---- ----
Сахароза + + + + + + + +
Ксилоза + + + + + + + + + + + + ++++ + + + +
Ь- + + + + + + + + + + + + ++++ + + + +
Галактоза
Б- + + + + + + + + + + + + ++++ + + + +
Галактоза
Рамноза + + + + + + + + ++++ ++++ + + + +
Раффиноза + + + +
Фруктоза
В результате ферментации углеводов на определенных этапах происходит избыточное образование сахарозы - невосстанавливающий дисахарид из группы олигосахаридов, которые трудно усваиваются организмом животного особенно жвачных. Выделенные изоляты №2, 3, 2.1 расщепляют сахарозу при 280С в течение 18-24 ч.
О-галактоза образуется обычно в результате гидролиза в пищевом канале олиго- и полисахаридов корма. Входит в состав лактозы, галактогена, протеогликанов, некоторых липидов и бактериальных полисахаридов. Сбраживается лактозными дрожжами. Может служить сырьём для получения глюкозы или витамина С. При взаимодействии галактозы и аммиака образуется галактозамин, из которого синтезируется хондроитинсерная кислота, которая входит в состав соединительной ткани (например хряще, растущей кости, сухожилиях, сердечных клапанах, кровеносных сосудах и коже).
Ь-галактоза трудно усваивается организмом и транзитом выводиться из организма без изменений. Изолят №2.1 ферментирует оба Ь- и Б- изомера галактозы.
Таблица 3
Чувствительность дрожжевых изолятов к противогрибковым препаратам (п=5)
Название препарата Диаметр зоны задержки роста, мм
Изолят дрожжей №1 Изолят дрожжей №2 Изолят дрожжей №3 Изолят дрожжей №2.1 Изолят дрожжей №6 Candida а1Ыеап8 10231
Клотримазол 10 мкг 19,80±0,42 21,00±0,50 21,20±0,42 20,60±0,45 18,80±0,42 20,00±0,35
Нистатин 80 мкг 20,20±0,42 18,80±0,42* 24,60±0,57** 19,60±0,57 21,20±0,42 20,40±0,27
Флоконазол 40 мкг 21,00±0,50* 20,60±0,45 21,60±0,57* 22,20±0,42 0 19,20±0,42
Интраконозол 10 мкг 6,40±0,27* 6,40±0,27* 15,40±0,27*** 7,60±0,27 5,60±0,27 5,20±0,22
Кетоканазол 20 мкг 29,80±1,19 28,80±0,65 29,00±0,61 29,20±0,82 28,40±0,57 27,60±0,76
Амфотерицин В 40 мкг 22,0±0,61 19,80±0,42 23,20±0,42* 20,20±0,42 21,60±0,57 20,80 ±0,42
* Р>0,95, **Р>0,99, ***Р>0,999.
Согласно критериям интерпритации результатов, определения чувствительности пограничных значений диаметров зон подавления роста все происследованные изоляты дрожжей оказались чувствительными к основным противогрибковым препаратам (таблица 3). Отдельно следует отметить, что к интраконозолу с концетрацией 20 мкг изолят №3 оказался промежуточным в отличие от других изолятов, оказавшихся резистентными к концентрации данного препарата.
Выводы.
Из природных объектов выделено 5 чистых изолятов дрожжей. Анализируя полученные данные предлагается использовать выделенные перспективные штаммы для переработки вторичных продуктов, содержащих повышенное количество сахаров пищевой и сельскохозяйственной промышленности для получения кормового белка микробного происхождения, необходимого для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных.
Литература
1. Патентная заявка 98117372 РФ. Способ получения концентрата молочнокислых бактерий для производства сыров / Сорокина Н.П., Суслов Н.В., Перфильев Г.Д., Мурашова Р.М. МПК А 23 С 19/032, С 12 N 1/20. Опубл. 2000.
2. Инструкция к расширенному набору дисков для оценки чувствительности к противогрибковым препаратам ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.
3. МУК 4.2.1773-03. Метод микробиологического измерения концентрации клеток Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест
4. Бочарова Н.Н. Микрофлора дрожжевого производства. - М.: Мир 1995-231с.
5. Семихатова Н.М. Хлебопекарные дрожжи: - М.: Изд-во «Пищевая промышленность», 1980 г. -200 с.
6. Новое в систематике и номенклатуре грибов. Ред. Ю.Т.Дьяков, Ю.В.Сергеев. М.: Национальная академия микологии. Медицина для всех, 2003, 494 с.
7. Тараканов, Б.В. и др. Изучение микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы/Б.В. Тараканов//М.: Научный мир. - 2006. - 188 с.
8. Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. - М.: Пищевая пром-ть, 1979. - 120 с.
9. Аргунов С.В., Глазунов А.В., Капульцевич Г.Д. Особенности роста дрожжей// Биотехнология, 1993. - №5- с. 22-25.
