CC BY
117
УДК / UDC 582.282.23.000.57.001.25:636.087.73
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ДРОЖЖЕЙ РОДА CANDIDA КАК ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ИСТОЧНИКА КОРМОВОГО БЕЛКА
STUDY OF BIOLOGICAL SAFERTY YEASTS OF THE GENUS CANDIDA AS A POTENTIAL SOURCE OF FEED PROTEIN
Колодина E.H., научный сотрудник
Kolodina E.N., researcher Артемьева O.A., научный сотрудник
Artemyeva O.A., researcher Котковская Е.Н., научный сотрудник Kotkovskaya E.N., researcher Павлюченкова О.В., научный сотрудник
Pavlyuchenkova O.V., researcher Переселкова Д.А., научный сотрудник Pereselkova D.A., researcher Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства им.
академика Л. К. Эрнста» Federal State Scientific Institution "All-Russian Research Institute of Animal Husbandry them. Academician LK Ernst" E-mail: [email protected]
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
дрожжи, штамм-ассоциант, Candida albicans ЛМ-2014, токсичность, биологическая безопасность, кормовой белок.
KEY WORDS
yeast, strain-associates, Candida albicans LM 2014, toxicity, biological safety, feed protein.
Дрожжевые продукты широко используются в качестве кормовой добавки для животных во многих странах мира. Среди производителей мясомолочной продукции и специалистов по вопросам кормления жвачных животных существует мнение, что дрожжевые продукты полезны, они повышают усвоение сухих веществ кормов рациона и способствуют улучшению общего состояния животных (1). Публикации по исследованиям о применении дрожжей и дрожжевых культур в кормлении жвачных животных в научных журналах «Journal of Dairy Science», «Animal Feed Science and Technology» и «Journal of Animal Science» занимают 70 % от общего количества статей. Известно, что дрожжи могут расти в рубце в течение короткого времени, они улучшают расщепление клетчатки и синтезируют питательные вещества, которые стимулируют рост бактерий рубца и играют важную роль в переваривании клетчатки [2,3,4].
В решении проблемы белкового дефицита важная роль отводится производству кормовых дрожжей, получаемых из отходов сельского хозяйства, пищевой промышленности, лесоперерабатывающей промышленности, торфа и др. При этом растительная масса является наиболее перспективным сырьем для получения белка микробиологического синтеза [5].
Дрожжи в рубце стимулируют рост бактерий, утилизирующих сильные органические кислоты, что способствует поддержанию pH среды рубца на уровне 6-7. Таким образом, создаются оптимальные условия пищеварения, и осуществляется профилактика ацидозов [6].
Классические кормовые дрожжи получают путём выращивания грибов рода Candida (реже Torulopsis) на послеспиртовой барде, получаемой как отход в спиртовом производстве [7].
Сахарный сироп, представляющий собой вторичное сырье переработки подсолнечного шрота, является разумной альтернативой для крупномасштабного микробиологического производства кормового белка [8].
Ввиду актуальности исследования и разработки дальнейших этапов биотехнологического получения кормового белка целью данной работы явилось изучение биологической безопасности дрожжей вида Candida albicans.
Биобезопасность исследуемой культуры дрожжей C. albicans определяли в три этапа:
- в опытах на тест-культурах инфузорий Tetrachymena pyriformis;
- путем парентерального введения дрожжевой суспензии лабораторным крысам;
- методом кожной пробы на кроликах.
Изучение биологической безопасности дрожжей проводили in vitro в условиях физиологического двора и лаборатории микробиологии центра биотехнологии и молекулярных исследований ВИЖ им. Л.К.Эрнста.
Объектами исследований являлись: изолят дрожжей, выделенный из рубцового содержимого гибридных баранов (архар х % романовская). По результатам проведенного анализа нуклеотидной последовательности, кодирующей часть 18S rRNA исследуемого штамма ФГУП ГосНИИГенетика (Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов) установлено, что исследуемый штамм наиболее близок к виду C. albicans (98%). Данной культуре было присвоено название C. albicans ЛМ-2014. В качестве штамма-ассоцианта использовался эталонный штамм C. albicans АТСС 10231 (патогенные биологические агенты III группы), предоставленный Государственной коллекцией патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ - Оболенск).
Наращивание культур дрожжей проводили на плотной селективной среде дрожжевой-агаровой-пептонной (ДАП) [9] при 280С в течение 48 часов. Суспензию дрожжей получали путем смыва культур с чашек Петри стерильной водой, концентрацию клеток определяли методом подсчета в камере Горяева.
Токсичность исследуемых микроорганизмов определяли с применением тест-культур инфузорий T. pyriformis. Из исходной концентрации клеток методом серийных десятикратных разведений готовили рабочие растворы. Титр которых находился в диапазоне от 1-1011 до 1106 КОЕ/мл. Автоматической пипеткой с заменяемым наконечником отбирали по 20 мкл среды с инфузориями и помещали в каждый из пяти микроаквариумов для исследования одной концентрации. Подсчет инфузорий проводили под микроскопом при увеличении 2x10. В каждом микроаквариуме количество инфузорий составляло от 10 до 20 шт, при этом травмированные клетки (неподвижные, округлой формы) не учитывали. Затем туда же автоматической пипеткой с чистым наконечником вносили по 200 мкл исследуемого разведения дрожжевой суспензии, подготовленной для биотестирования. Наблюдение и подсчет инфузорий
проводили в течение трех часов с интервалом 30 мин. Для того чтобы за время экспозиции растворы в лунках не подсохли, под блок микроаквариумов подкладывали смоченную водой фильтровальную бумагу и накрывали их стеклянным колпаком. Выживаемость инфузорий N%, вычисляли по формуле:
N = ^•100, (1)
N v '
где N2 - среднеарифметическое (из пяти испытаний) число инфузорий через каждые 30 мин. экспозиции, шт;
N1 - среднеарифметическое (из пяти испытаний) число инфузорий в начале опыта, шт;
100 - коэффициент перевода результата в проценты [10,11]
Эксперимент по изучению токсичных свойств обеих культур рода Candida проводили на крысах самцах линии ВИСТАР массой 70-80г. Животных разделили на три группы по 10 особей: две из которых были опытные и одна контрольная. Все животные, участвующие в эксперименте, содержались в групповых условиях согласно нормам посадки (по 5 особей в клетке), на общевиварном рационе, поение неограниченно. Животным 1 опытной группы подкожно в область холки инъецировали 0,5 мл дрожжевой суспензии C. albicans ЛМ-2014 с концентрацией клеток 1*10л, крысам 2 опытной группы вводили 0,5 мл суспензии C. albicans 10231 той же концентрации, 3 контрольной группе животных - 0,5 мл стерильной воды. В течение 7 суток ежедневно учитывали физиологическое состояние животных. Эвтаназию экспериментальных животных проводили методом цервикальной дислокации. При вскрытии учитывали патологоанатомические изменения внутренних органов и их микробиологический профиль в среднем по группе (методом мазков-отпечатков на предметные стекла и посева на дифференциально-диагностические среды, с последующим изучением морфолого-биохимических свойств выросших микроорганизмов) [12].
Определение степени токсичности тест-культуры дрожжей C. albicans ЛМ-2014 и штамма-ассоцианта С. albicans 10231 проводили методом кожной пробы на кроликах породы «Белый великан». На выстриженный участок кожи кролика размером 6x6 см пластиковым шпателем наносили, слегка втирая, половину исследуемой пастообразной массы дрожжей с концентрацией клеток 4,01011 КОЕ/г, полученной в результате наращивания и центрифугирования при 3000 об'15, вторую половину оставляли в холодильнике для повторного нанесения на следующий день. В качестве контроля использовали оголенный участок кожи, на который не наносили испытуемые образцы. С целью предупреждения слизывания пасты, нанесенной на кожу, на шею кролика надевали воротник, который снимали по окончанию исследования. Наблюдение за реакцией начинали на следующий день после повторного нанесения пастообразной массы и продолжали в течение 7 суток, при этом оценивали изменения кожных покровов. Для оценки возможного инфицирования подопытных животных микроорганизмами в ходе исследований, исследовали кровь на стерильность. Для этого асептически были отобраны образцы крови из ушной вены в стерильные вакуумные пробирки. Посев проводили в ламинарном шкафу 2 класс защиты на тиогликолевую среду в два этапа: 1 мл крови засевали в 2 пробирки, содержащие по 20 мл тиогликолевой среды и инкубировали при 25° С и 35° С в течение 48 часов, затем производили пересев по 0,5 мл из каждой пробирки в другие 2 пробирки, содержащие по 10 мл тиогликолевой среды. Пересевы
выдерживали при тех же температурах, что и пробирки, на которых был произведен высев. Результаты регистрировали через 72 часа после первичного посева [13].
Для статистической обработки данных, полученных в результате исследований использовали программу MS Excel и параметрические методы.
Простейшие, такие как стилонихии, колподы, дафнии высокочувствительные микроорганизмы, которые реактивно откликаются на любые, в том числе и негативные, изменения окружающей среды. Поэтому их используют в качестве биотеста для определения степени токсичности различных продуктов как растительного, так и животного происхождения. Оценивая результаты, полученные в ходе проведения эксперимента на инфузориях T. pyriformis необходимо отметить, что в течение первых 1,5 часов во всех образцах численность клеток, подвижность и характер движения не менялись. Начиная со второго часа наблюдений, отмечалось снижение численности клеток в первой группе до 94,79%, во второй опытной группе до 80,00% в растворах с концентрацией дрожжевых клеток 1011. По результатам расчетов выявлено, что процент выживаемости инфузорий был выше 80% во всех исследуемых концентрациях рабочих растворов С. albicans ЛМ-2014 и С. albicans 10231 (табл.1). Это дает возможность предположить, что данные объекты не обладают явно выраженным токсическим действием.
Таблица 1. Динамика изменения численности инфузорий T. pyriformis (%)
Название м.о. Разве дение Время экспозиции, ч.
0,5 1,0 1,5 2 ,0 2,5 3,0
Выживаемость инфузо рий, %
C. albicans ЛМ-2014 106 98,95 97,89 96,84 96,84 96,84 95,79
107 98,96 98,96 97,92 97,92 98,96 98,96
108 98,95 98,95 97,89 97,89 96,84 95,79
109 98,94 97,87 97,87 96,81 96,81 95,74
1010 97,85 95,70 95,70 94,62 94,62 95,70
1011 97,92 96,88 95,83 95,83 94,79 94,79
C. albicans 10231 106 98,92 98,92 98,92 97,85 97,85 97,85
107 98,98 97,96 97,96 96,94 96,94 96,94
108 98,95 97,89 96,84 95,79 94,74 92,63
109 98,94 97,87 96,81 94,68 93,62 92,55
1010 96,81 93,62 89,36 87,23 84,04 82,98
1011 93,68 88,42 84,21 83,16 82,11 80,00
Контроль Стери льная вода 97,87 97,87 97,87 96,81 96,81 96,81
*М.о. - микроорганизм
Методы определения общей токсичности основаны на биотестировании параллельно на кроликах (кожная проба) и мышах (крысах). Результат определяют по совокупности реакций в обоих методах: продукт нетоксичный (нетоксичен в обоих тестах), продукт токсичный (токсичен хотя бы в одном тесте) [13].
Исходя из данных листа наблюдений за крысами контрольной и опытных групп, можно отметить, что активность, поза, частота дыхания соответствовали физиологической норме. Ежедневно регистрировалось увеличение веса тела грызунов на 5-9% от предыдущего значения. Суточное потребление воды и корма - в норме. Исследовательская активность, издаваемые звуки - сохранены. Диарея, дегидратация, захваты и конвульсии, раны, кровотечения и другие нарушения не наблюдались.
При вскрытии контрольных и опытных животных патологоанатомических изменений внутренних органов не обнаружено. Отсутствуют геморрагические воспаления желудочно-кишечного тракта, дегенерации и кровоизлияния во внутренних органах. При микроскопии мазков-отпечатков внутренних органов, обнаружены дрожжевые клетки Грамм (+), размером преимущественно 6,2 х 5,0 мкм, форма округлая, вытянутая, лимонообразная. Обнаруженная культура по своим морфологическим свойствам значительно отличалась от исследуемых объектов. Тест-культура C. albicans ЛМ-2014 представляет собой Грам (+) клетки, размером в среднем 5,1 х 3,3 мкм, овальной формы. Дрожжевые клетки штамма-ассоцианта С. albicans 10231 - Грам (+), размером 2,0 х 4,0 мкм, яйцевидной формы. Важно отметить, что дрожжи, высеянные с внутренних органов подопытных животных, не имеют принадлежности к изучаемым образцам дрожжевых культур.
Результаты исследования микробиологического профиля внутренних органов крыс самцов, линии ВИСТАР, представлены в таблице 2. Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы рода Staphylococcus, Streptococcus, представители БГКП, в том числе Salmonella, гемолитические и анаэробные бактерии не обнаружены. У животных второй опытной группы из печени, селезенки и почек были выделены ПБА IV группы: Bacillus cereus.
Таблица 2. Результаты микробиологического исследования внутренних органов вскрытых крыс КОЕ/г (п=10)
Группа Наименование органа
сердце печень селезенка почки легкие Содержимое кишечника
Опытная 1 cd Д:34 Д:11 Д:16 Д:52 Д:95
Опытная 2 Д:4 Д:50 Д:52 Д:17 Д:53 Д:200
Контрольная Д:не обн. Д:35 Д:14 Д:13 Д:48 Д:81
Д - дрожжеподобные грибы. Не обн. - данный вид микроорганизма не обнаружен
Метод биотестирования на кроликах (кожная проба) дает возможность учесть дермонекротическое действие токсинов исследуемых объектов на кожу. В результате проведенного эксперимента установлено, что паста клеток двух
культур дрожжей не оказала воспалительного действия на кожу опытных кроликов. У животных опытной и контрольной групп отсутствовали признаки воспалительной реакции кожи: гиперемия, отечность, уплотнения, болезненность, шелушение, кровоизлияния. Поведение, физиологические показатели, поедание корма соответствовали норме. По данным Кубася В. Г. и Чайки Н.А. (1994г.) критериями кандидоза является выделение возбудителя в стерильных жидкостях (кровь, ликвор) [14]. Исследованные нами образцы крови от опытных животных были стерильны.
С. albicans - один из постоянных микроорганизмов флоры кишечника. При нормальных условиях присутствует у 80% популяции людей, не вызывая болезней. Дрожжи С. albicans ЛМ-2014 являются микроорганизмами с природным генотипом, что дает право предположить отсутствие токсического действия на окружающую среду и организм в целом. Исходя из новых методологических подходов к практической оценке патогенного потенциала штаммов С. albicans, следующим этапом работы планируется изучение уровня адгезии и выделение антигенов [15].
В результате исследований изолята, выделенного из Рубцовых содержимых гибридов архара, адаптированного к условиям дикой природы и чистопородной романовской овцы, получены данные, подтверждающие его биологическую безопасность и позволяющие в дальнейшем использовать в качестве потенциального продуцента кормового белка.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Кулик М.Ф., Безпалько А. В., Тучик А. В. Влияние дрожжевых культур на продуктивность, содержание жира, белка и микроэлементов в молоке коров при разных типах кормления. Кормопроизводство № 2 2014 с. 41-43.
2. Robinson P. H. Yeast products for growing and lactating dairy cattle: Impact on rumen fermentation and performance // Dairy Rev. — 2002. — Vol. 9. — P.1-4.
3. D. J. Nisbet and S. A. Martin, "Effect of Saccharomyces cerevisiae Culture on Lactate Utilization by the Bacterium Selenomonas ruminantium" Journal of Animal Science, Vol. 69, No. 11, 1991, pp. 4628-4633.
4. G. A. harrison, R. W. Hemken and K. A. Dawson, "Influence of Addition of Yeast Culture Supplement to Diets of Lactating Cows on Ruminal Fermentation and Microbial Populations," Journal of Dairy Science, Vol. 71, No. 11, 1988, pp. 29672975. http://dx.doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(88)79894-X
5. Цугкиева, В. Б. Научное обоснование и практическое использование методов интенсификации кормопроизводства и повышения качества производимых кормов в условиях РСО-Алания: диссертация доктора сельскохозяйственных наук : 06.02.02 / Цугкиева Валентина Батырбековна; [Место защиты: Горе. гос. аграр. ун-т].- Владикавказ, 2008.- 328 е.: ил. РГБ ОД, 71 09-6/63
6. М. Е., Гуляева Л. В. Смирнова Кормовые дрожжи в питании лактирующих коров. Молочнохозяйственный вестник №2, II кв. 2011, с. 11-13.
7. Кормовые дрожжи - сравнительные характеристики питательной и биологической ценности. Подобед Л.И., 2007 г. (http://podobed.org/kormovye_drozhzhi_-
_sravnitelnye_harakteristiki_pitatelnoy_i_biologicheskoy_tsennosti.html)
8. Возможности использования продуктов вторичной переработки для получения кормового белка. Артемьева О.А., Павлюченкова О.В., Котковская
E.H., Ралкова B.C., Переселкова Д.А., Молочное и мясное скотоводство, №6. 2015 г.
9. МУК 4.2.1773-03. Метод микробиологического измерения концентрации клеток Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест
10. МУ 13-7-2/2156. Методические указания по ускоренному определению токсичности продуктов животноводства и кормов.
11. ГОСТ 31674-2012. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности
12. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях. Под редакцией: H.H. Каркищенко и C.B. Грачева, Москва, 2010г. 344 с.
13. Инструкция по контролю стерильности консервированной крови, её компонентов, препаратов, консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов. Утв. МИНЗДРАВОМ РФ 29.05.1995.
14. Кубась В. Г., Чайка Н. А. Кандидоз и СПИД (рекомендации для врачей). - СПб. Изд-во СПбГИДУВ, 1992. -48с.
15. Новый подход к оценке патогенного потенциала клинических штаммов CANDIDA ALBICANS. Автореферат. Лисовская С.А., Казань - 2008. 25 с.
