Изучение свойств психротрофных микроорганизмов-нефтедеструкторов, выделенных из почв Западного Казахстана Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

Шарипова Г.Ж.1, Хасенова Э.Ж.2, Махатова А.С.3, Молдагулова Н.Б.4©

123Младший научный сотрудник; 4ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук;

1 2 3 4РГП «Национальный центр биотехнологии», г. Астана

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПСИХРОТРОФНЫХМИКРООРГАНИЗМОВ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПОЧВ ЗАПАДНОГО КАЗАХСТАНА

Аннотация

В статье приводятся результаты по изучению культурально-морфологических, физиолого-биохимических (сахаролитические, протеолитические, ферментативные) свойств психроактивных штаммов, выделенных из нефтезагрязненной почвы Западного Казахстана.

Ключевые слова: углеводородокисляющие психротрофные микроорганизмы, культуральноморфологические свойства, биохимические свойства.

Keywords: hydrocarbon-oxidizing psychrophilic microorganisms, cultural-morphological

properties, biochemical рroperties.

Введение

Микробиологические методы являются неотъемлемым компонентом современной биотехнологии для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов. Основную роль в биологической ремедиации нефтезагрязненных почв играет количество и активность нефтеокисляющих микроорганизмов. Поиск и изучение свойств психротрофных бактерий, проявляющих высокую нефтедеструктивную активность является весьма актуальной задачей [1,2]. Применение биопрепаратов-нефтедеструкторов на основе психротрофных

нефтеокисляющих микроорганизмов в сочетании с традиционными методами позволит проводить биоремедиационные работы круглый год. Сократиться время на очистку единицы площади от нефтезагрязнении. Соответственно сократятся финансовые и материальные расходы на проведение самих биоремедиационных работ в пересчете на единицу очищаемой площади [3].

Цель настоящей работы - изучение свойств психротрофных микроорганизмов-деструкторов, выделенных из почв Западного Казахстана.

Материалы и методы.

Выделение психротрофных углеводородокисляющих культур микроорганизмов проводили из нефтезагрязненной почвы методом накопительных культур и путем высева почвенной суспензии на агаризованную среду Ворошиловой-Диановой, в которую добавляли в качестве единственного источника углерода и энергии - 1% сырую нефть [4,5]. Проверку чистоты культур определяли методом микроскопии.

Выделенные бактерии из почвы идентифицировали на основе изучения культуральных, морфологических, физиолого-биохимических свойств в соответствии с определителем Берджи (1997) [6], также идентификацию проводили на бактериологическом анализаторе VITEK Compact.

Для выявления протеолиза казеина использовали молочный агар. Величина зоны просветления молочного агара вокруг выросших по штриху колоний бактерий свидетельствовала об интенсивности протеолиза казеина. Гидролиз крахмала обнаруживали после обработки агаровой пластинки раствором Люголя [7,8].

Ферментативные активности изолятов проводили с использованием готовых микротестов: каталазный - оксидазный тесты фирмы «Becton, Dickinson and Company USA», микротесты для определения индола, нитрата, фенилаланина, полоски для определения сероводорода (Hi-Media) [9].

Результаты исследований.

©© Шарипова Г.Ж., Хасенова Э.Ж., Махатова А.С., Молдагулова Н.Б., 2014 г.

С целью выделения активных штаммов углеводородокисляющих психротрофных микроорганизмов нами были отобраны 105 культур из нефтезагрязненных почв и нефтешламов Западного региона Казахстана. В процессе скрининга наибольшей нефтеокисляющей активностью обладали только 7 штаммов. Для определения

нефтеокисляющей активности, отобранные культуры культивировали на среде ВД с содержанием 3 % сырой нефти при температуре +10 0С. Результаты гравиметрического анализа деструкции нефти представлены в таблице 1.

Таблица 1

Нефтеокисляющая активность выделенных изолятов

Наименование штамма ДН-1 А1 КЛ1 КЛ4 ЖН-1 S20 15/6

Деструкция нефти, % 99 50 76 77 86 53 78

Данные из таблицы свидетельствуют о том, что все 7 штаммов обладают нефтеокисляющей активностью.

Далее были изучены культурально-морфологические, биохимичекие свойства отобранных культур микроорганизмов.

Таблица 2

Культурально-морфологические свойства активных штаммов углеводородокисляющих

микроорганизмов

Шта Морфология колоний Морф о Реак Разме Отнош Си Под

ммы Раз поверх край форм цвет профит Л О ГИЯ ция ры ение к ор виж

мер ноетъ а ь клеток по клето От ы ноет

ы. Гра к ь

мм мму

КЛ4 2-5 гладка ровны кругл розов выпукл палочк + 0,5x2, аэроб - +

я й ая ый ый и 0

15/6 1-3 гладка ровны кругл розов ко нус О кокки + 0,7 аэроб - -

я й ая ый видны й

А-1 1-3 гладка ровны кругл о еже выпукл палочк + 0,9 х Ф- - +

я й ая вый ый и 25 анаэро б

ДН-1 3-5 гладка ровны кругл о еже выпукл палочк + 1,2 х аэроб - -

я й ая вый ый и 2,0

S20 3-5 гладка ровны кругл о еже капле о кокко- + 0,5 х Ф- - -

я й ая вый бразны й палочк и 0,8 анаэро б

Ю11 1-2 гладка ровны кругл МОЛ О выпукл палочк - 1,2 х аэроб - +

я й ая чный ый и 2,0

жн- 1- гладка ровны кругл розов выпукл кокк- + 0,8 х Ф- - +

1 1—* '’L'l я й ая ый ый палочк и 1,0 анаэро б

При изучении культуральных свойств активные углеводородокисляющие микроорганизмы были представлены в виде: колонии круглые, гладкие с блестящей поверхностью бежевого, розового и молочного цвета с ровными краями. Преобладают культуры с выпуклым профилем колонии. Размер колоний в среднем составляет 1-5 мм. По отношению к кислороду культуры относятся к аэробам и факультативными анаэробами.

Микроморфологические свойства выделенных изолятов представлены граммположительными палочками, кокками, коккоподобными клетками различных размеров.

Изучение биохимических свойств микроорганизмов показало, что все культуры каталазаположительные, КЛ4, А-1 и S20 - оксидазаположительные. Амилолитической активностью обладало подавляющее большинство культур, среди них наиболее активными являются ДН-1, ЖН-1, 15/6, S20. Размеры зоны гидролиза колебались в пределах 15-35 мм. Казеинолитическую активность проявили штаммы ЖН-1, S-20 (от 15-24 мм). Полное разжижение желатины было отмечено у штаммов ДН-1, ЖН-1, КЛ-1. Все изученные культуры микроорганизмов не образовывали индол, сероводород продуцировали только КЛ4 и 15/6, нитриты восстанавливали до нитратов. Все культуры росли на среде Эшби кроме культуры КЛ1.

Биохимический анализ штаммов

Таблица 3

Штаммы Свойства 1 А-1 ДН-1 о гч ЖН- 1

Каталазная активность + + + + + + +

Оксидазная активность + - + - - + -

Разжижжение желатины - - + - - - -

Дезаминирование фенилаланина “ ■ “ “ “ “ ■

Гидролиз казеина - - - - + - -

Г идролиз крахмата - + - - + - -

Образование H2S + + - - - - -

Образование индола - - - - - - -

Образование аммиака + + + - - + +

Восстановление нитратов - - - - + - -

Рост на среде Эшби + + + + + - +

Примечания 1. «+» - признак выражен 2. «-» - признак отсутствуют

Также изучали способность выделенных микроорганизмов сбраживать следующие виды углеводов: лактозу, глюкозу, целлобиозу, тригалозу, раффинозу, галактозу, рамнозу, маннит, фруктозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннозу, мелибиозу, салицин, сахарозу. Результаты расщепления углеводов представлены в таблице 2.

Таблица 4

Способность микроорганизмов ассимилировать углеводы

Штаммы Углеводы КЛ4 15/6 А1 ДН-1 S20 КЛ 1 ЖН -1

рафиноза + + + + + + +

рамноза + + + + + + +

инулин + + + + + + +

мелибиоза + + + + + + +

сахароза + + + + + + +

лактоза + + + + + + +

трегалоза + ± - + + + +

сорбитол + + + + + + +

инозит + + + + + + +

арабиноза + + + + + + +

галактоза + + + + + + +

целлобиноза + + ± ± + + +

ксилоза + + + + + + +

манноза + + + + + + +

маннит + ± + + + + +

дульцит + + + + + + +

салицин - + + + + + -

фруктоза + + - - + + +

мальтоза - ± - + + + -

глюкоза + - - + - + +

Примечания 1. «+» - признак выражен 2. «-» - признак отсутствуют 3. «±» - слабовыраженная положительная реакция.

Заключение

В результате проведенных исследований из нефтезагрязненных почв Западного Казахстана было отобрано 30 почвенных образцов, выделено 105 культур микроорганизмов. По способности к нефтеокислению было отобрано 7 психротрофных культур микроорганизмов. На основании фенотипической идентификации определена родовая принадлежность активных штаммов микроорганизмов. Основными представителями углеводородокисляющих микроорганизмов Западного Казахстана являются микроорганизмы рода Rhodococcus.

Литература

1. Бельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. - 1995. - № 3-4. - С. 20-27.

2. Белоусова Н.И., Шкидченко А.Н. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах // Прикладная биохимия и микробиология. -2004.- № 3.- С. 312-316.

3. Стабникова Е.Б., Селезнева М.Б., Рева О.Н., Иванов Б.Н. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв // Прикладная биохимия и микробиология. - 1995. - № 5. - С. 534-539.

4. Лушников С.В. Очистка воды и почвы от нефти и нефтепродуктов с помощью культуры микробов-деструкторов // Экология и промышленность России. - 1999. - № 2. - С. 17-20.

5. Булатов А.И., Макаренко П.П., Шеметов В.Ю. Охрана окружающей среды в нефтегазовой промышленности. - М.: Недра, - 1997. - С. 470.

6. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии /М.:Изд.центр «Академия», - 2005. С. 118-128.

7. Определитель бактерий Берджи. Пер.с англ./Под ред.Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уильямса.-М.:Мир, - 1997. - С. 567-568.

8. Теппер Е.З., Шильникова В.К. Практикум по микробиологии. Москва, Колос, - 1979. - С. 78-85.

9. Аристовская Г.В.Большой практикум по микробиологии. -М.:Академия, - 2005. - С. 51-56.