CC BY
65BIOLOGICAL SCIENCES
УДК 664.641
THE DEGREE OF BIODEGRADATION OF PETROLEUM HYDROCARBONS BY MICROORGANISMS AT POSITIVELY LOW TEMPERATURES
Saltybaev A.
Candidate of biological sciences, acting. assistant professor Almaty Technological University, Almaty
Asenov A.
Candidate of biological sciences, acting. assistant professor Almaty Technological University, Almaty
Muratova A.
Master of Teaching Almaty Technological University, Almaty
СТЕПЕНЬ БИОДЕГРАДАЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ МИКРООРГАНИЗМАМИ ПРИ ПОЛОЖИТЕЛЬНО НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ
Салтыбаев А.Д.
к.б.н., и.о. доцент
Алматинский Технологический университет, гАлматы
Асенов А.Р. к.б.н., и.о. доцент
Алматинский Технологический университет, гАлматы
Муратова А.А.
Магистр преподаватель
Алматинский Технологический университет, гАлматы
Abstract
This article discusses the opportunities of an association of active psihrotrofnyh microorganisms - destructors of oil hydrocarbons as the basis of a biological preparation for bioremediation of oil-contaminated soil , determining its effectiveness in laboratory, as well as the preparation of microbial associations on the basis of combining the properties of microorganisms , as well as by the selection in a batch culture oil as substrate. Works devoted to the breeding of microorganisms capable of degradation of oil and oil products at low positive temperatures , very little. In this regard, particularly relevant study psihrotrofnyh microorganisms - destructors of oil and petroleum products.
Аннотация
В данной статье рассматривается возможность создания ассоциации активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти как возможной основы биопрепарата для биоремедиа-ции нефтезагрязнённых почв, определение её эффективности, а также составление микробных ассоциаций на основании комбинирования свойств микроорганизмов, а также путём селекции в условиях периодического культивирования с нефтью в качестве субстрата. Работ, посвященных селекции микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при низких положительных температурах, пока незначительно. В связи с этим особенно актуально исследование психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов.
Keywords: oil, oil pollution , transformation of hydrocarbons, bioremediation, autoremediation, strains.
Ключевые слова: нефтепродукты, загрязнение нефтью, среда обитания, трансформация углеводородов, ауторемедиация, биоремедиация, штаммы.
Введение
Среди многочисленных вредных веществ антропогенного происхождения, попадающих в окружающую среду, нефтепродуктам принадлежит одно из первых мест. По степени вредного влияния на экосистемы нефть, нефтепродукты и нефтесо-держащие промышленные отходы занимают ведущее место [1]. Работа автотранспорта и предприятий нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности, газообразные выбросы и сточ-
ные воды промышленных предприятий, многочисленные разливы нефти и нефтепродуктов в результате аварий трубопроводов и нефтеналивных судов (танкеров), аварий и пожаров на нефтехранилищах и нефтеперегонных заводах приводят к загрязнению воздуха, воды и почвы значительными количествами сырой нефти и продуктов её переработки и создавая серьёзную угрозу экологии в целом [1, 2].
В мире большинство месторождений нефти расположено в северных регионах, вследствие чего, именно в регионах с холодным климатом часто
происходит загрязнение нефтью как наземных, так и водных экосистем. Попадание нефти и её компонентов в окружающую среду вызывает серьезные изменение физических, химических и биологических свойств природной среды обитания, нарушает ход естественных биохимических процессов. Трансформация углеводородов нефти, как правило, образовывает достаточно устойчивые к микробиологическому расщеплению соединения весьма токсичные обладающие мутагенными свойствами.
Процесс естественного восстановления загрязненной окружающей среды является очень длительным. Ауторемедиация нефтезагрязненных почв при уровне загрязнения 5 г/кг длится от 2 до 30 лет и более. В северных регионах скорость этих процессов еще ниже. В связи с этим, последствия загрязнений нефтью там сказываются многие десятилетия, поскольку период деструкции нефти и её производных в условиях низких температур составляет минимум 50 лет [3]. Основную роль в ремеди-ации in situ играет биологический фактор — активность микроорганизмов, участвующих в процессах утилизации и трансформации углеводородов нефти. Микробиологичекие методы являются неотъемлемым компонентом современной биотехнологии очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов в восстановлении основных свойств почвы.
На сегодняшний день микробиологический способ более предпочтителен, так как при этом различные фракции нефти используются микроорганизмами в качестве субстратов в полном объеме, почва полностью восстанавливает основные свойства, становится пригодной для вовлечения в сельскохозяйственный оборот.
Биоремедиация обеспечивает экономически выгодную, высокоспецифичную очистку, приводящую к уменьшению концентрации как отдельного загрязнителя, так и смеси поллютантов. Препятствиями в достижении этой цели являются низкая температура, повышенная концентрация соли, низкое содержание питательных веществ, отсутствие или низкая деградативная активность природных микробных популяций.
Короткий летний период — основной лимитирующий фактор при биоремедиации в северных регионах. Поэтому в настоящее время большое внимание исследователей уделяется изучению процессов биоремедиации в регионах с холодным климатом. Штаммы родов Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia,
Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas,
Rhodococcus, Serratia, Bacillus и ряд других бактерии обладают значительным деградативным потенциалом. Рядом исследователей показано, что они способны утилизировать устойчивые загрязнители и ксенобиотики. Эти микроорганизмы часто выделяют из нефтезагрязненных мест, культивируют и используют для очистки при разливах нефти. [4,5].
Объекты и методы исследований
Объектами исследования являлись нефтеза-грязненые почвы, полученные в районе месторождения Каражанбас.
Отбор почвы для микробиологического анализа проводили с глубины 20-25 см стерильной лопатой, тщательно протертой спиртом. На опытном участке отбирали 10 проб массой по 0,5 кг каждая, тщательно перемешивали и отбирали средний образец весом 1 кг в стерильный бумажный пакет, упаковывали и маркировали. Пробы почвы хранили в холодильнике при температуре + 4 °C .
При изучении углеводородокисляющей способности, культуру микроорганизмов выращивали на жидкой среде Воpошиловой -Дшновой (В-Д ) с добавлением. сырой нефти, в качестве единственного источника углерода и энергии. В колбы емкостью 250 мл со 100 мл минеральной среды (В-Д) вносили 1 мл суспензии клеток микроорганизмов-деструкторов и культивировали на орбитальном шейкере. Контролем служила стерильная среда (В-Д) с добавлением такого же количества сырой нефти. Оценку проводили визуально по разрушению нефтяной пленки и определяли гравиметрическим методом по остаточному содержанию нефти. Идентификацию культур проводили по определителю Берджи.
Результаты и их обсуждение
Исследования были направлены на изучение активности процессов биоремедиации в регионах с холодным климатом. Выделение психротрофных нефтеокисляющих микроорганизмов проводили из нефтезагрязненных почв Мангистауской области. Выделения углеводородокисляющих микроорганизмов из загрязненной нефтью почвы проводили методом накопительных культур. С этой целью образцы почвы в объеме 3 г вносили в стерильную жидкую минеральную среду (В-Д) с добавлением сырой нефти в концентрации 1% в качестве единственного источника углерода и энергии. Накопительную культуру инкубировали на термошейкере при температуре +200С в течение 10 суток. Выросшие культуры пересевали методом Дригальского на плотную среду (В-Д) с добавлением нефти.
Таким образом, из загрязненных почв, отобранных из месторождения Каламкас, было изолировано 10 чистых культур углеводородокисляю-щих микроорганизмов. (Pseudomonas aeroginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens. Rhodococcus erithripolis, Rhodococcus rubber, Rhodococcus maris, Rhodococcus luteu, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus methanicus.)
Психротрофность культур микроорганизмов изучали методом культивирования на плотных питательных средах при низких температурных условиях. Оценку роста культур на плотной среде проводили визуально по росту микробных клеток или по образованию колонии на поверхности агара,. Культуры инкубировали при температурах +20 0С, +15 0С, +10 0С и +4 0С. Результаты культивирования микроорганизмов на плотной среде при различных температурных режимах представлены в таблице 1.
Таблица 1
Изучение психротрофности изолированных культур
углеводородокисляющих микроорганизмов на плотной среде
Наименование штамма Температурный диапазон
+20 0С +15 0С +10 0С +4 0С
Pseudomonas aeroginosa + + + +
Pseudomonas putida + + + +
Pseudomonas fluorescens + + + -
Rhodococcus erithripolis + + + +
Rhodococcus rubber + + + +
Rhodococcus maris + + + -
Rhodococcus luteu + + + -
Bacillus thuringiensis + + + +
Bacillus subtilis + + + +
Bacillus methanicus + + + -
Примечание 1 «+»- наличие роста 2 «-» - отсутствие роста
Из полученных данных (таблица 2) видно, что при культивировании коллекционных штаммов уг-леводородокисляющих микроорганизмов все культуры показали хороший рост при температурах +20 0С и +15 0С на 5 сутки после инкубирования. При инкубировании при низких температурных значениях +10 0С и +40С хороший рост наблюдался только у 6 штаммов УОМ, у остальных культур отмечался умеренный рост клеток. Однако процесс инкубирования составил около 12 суток.
Из данных представленных на рисунке 1 видно, что все выделенные психротрофные изо-ляты активно разрушали нефть в искусственно загрязненной почве при +40С. При этом активно разрушала нефть культура Pseudomonas aeroginosa, степень деструкции составила 75%.
Заключение, выводы
На основании исследования микроорганизмов способных к деградации различных углеводородов, отобраны активные психротрофные штаммы-деструкторы нефти и нефтепродуктов.
Выявлена способность микробной ассоциации к деградации нефти в широком температурном диапазоне. Выявлено, что все испытуемые культуры
Далее определяли степень деструкции нефти в почве наиболее активными психротрофными штаммами. Оценку деструктивной активности культур в почве проводили при положительно низкой температуре +40С с добавлением сырой нефти в концентрации 3%, инкубацию проводили в течение 50 суток. При визуальной оценке цвет почвы менялся с темно-коричневого на светло коричневый цвет, отмечалось отсутствие маслянистости. Результаты представлены на рисунке 1.
давали интенсивный рост температурных диапазонах от +200С до +150С, при температуре +40С хороший рост наблюдали только у 6 культур. Внесение эффективных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти в почву совершенно необходимо в северных районах, где тёплый период года непродолжителен и природная микрофлора не успевает адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды. Штаммы родов Pseudomonas aeroginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens. Rhodococcus erithripolis, Rhodococcus rubber, Rhodococcus maris, Rhodococcus luteu, Bacillus thuringiensis, Bacillus
Рисунок 1 - Деструкция нефтепродуктов в почве после внесения культуры на 50 сут, при +4 0С
subtilis, Bacillus methanicus. обладают значительным деградативным потенциалом.
В природных условиях микроорганизмы образуют консорциумы, составляя единую цепь окисления углеводородов нефти. Каждый из микроорганизмов консорциума, обладая специфичными ферментными системами, направленными на использование определенного субстрата (как самих углеводородов, так и их производных) использует данный субстрат в своем метаболизме. Поэтому при совместном воздействии микроорганизмов консорциума происходит извлечение, как большего количества, так и более широкого спектра нефтяных углеводородов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Ананько Г.Г., Пугачёв В.Г., Тотменина О.Д., Репин В.Е. Устойчивость нефтеокисляющих микроорганизмов к низким температурам // Биотехнология. 2005. № 5. С. 63-69.
2. Белоусова Н.И., Барышникова Л.М., Шкид-ченко А.Н. Отбор микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при пониженных температурах // Прикл. бихимияи микробиология. 2002. Т.38. № 5.С513-517.
3. Бельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология.1995.№3-4.С.20-27.
4. Пырченкова И.А., Гафаров А.Б., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Воронин A.M. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти // Прикл. биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. №3. С. 298-305.
5. Малахов A.A., Гирич И.Е., Нечитайло Т.Ю., Карасева Э.В. Роль нефтеокисляющей микрофлоры в биоремедиации почв и почвогрунтов, загрязненных нефтью. Экология 2000: Эстафета поколений. I Международная школа-семинар по экологии. 2000.
