CC BY
85
ВЫВОДЫ:
1. В количестве 20,0 g/kg сапропель увеличивает стандартный урожай помидоров сорта «Идеал» на 11,6%, по сравнению с контролем, в используемом торфперлит-навозном субстрате.
2. Сапропель нейтрализует кислотность почв и субстратов от 5,7 до 7,02 рН
Литература:
единиц.
3. Сапропель может быть использован в качестве органоминерального удобрения для обогащения субстратов и почв, где содержание питательных элементов недостаточно.
1. Димитров П., Велев В. Возможности использования глубоководных сапропелоидных осадков Черного моря для агробиологической и промышленных целей. Океанология, кН.17, София, 1988.- С.92-95.
2. Димитров П., Димитров Д., Солаков Д. Применение донных отложений Черного моря как природные экологические удобрения и для рекультивации истощенных почв. Междунар. конф. Геолого-минералогических ресурсов Черного моря. Киев, 1999.- 24-28 ноября.- № 182.- С.418.
3. Димитров П., Николов Н., Симеонова Н., Шабан Н., Камбурова М., Москова Цв., Запрянова П., Димитров Д., Солаков Д. Мелиорант для почв и субстратов. BG Патент № 63868, София, 2003.
4. Чолаков Д., Петкова В., Христова Д. Оптимизация азотного удобрения при выращивании ранних помидоров в неотапливаемых пластиковых домах с помощью гранул, содержащих сапропель и модифици-
рованные полимеры. Сб. докладов Интерн. конф. «Агро-Эко», Пловдивский сельскохозяйственный университет, 2005.- кн.5.
5. Георгиев Г. Биологические препараты с росто-регулирующими и пестицидными свойствами. Новости, Бюллетень БАН, София, 2005.- № 9825.-т.Ш.- С.1-2.
6. Gorbanov, Станчев Л. Агрохимия. Изд. «Дионис», софия, 2007.- С.35-39.
7. Котева В., Артинова Н. Влияние многогодичного использования минеральных удобрений на содержание гумуса в Cambisol в юго-восточной Болгарии. София, Почвоведение, агрохимия, экология, 28, 132-162, 1993.
8. Трендафилов Р, Попова. Руководство по почвоведению. Акад. изд. Сельскохозяйственного университета, Пловдив, 2007.- С.95
УДК 550.72:579.8.019.9
ИЗУЧЕНИЕ НЕФТЕДЕСТРУКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Апендина Г.С., Туякбаева А.У.
РГП «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан», г. Астана
Интенсивная разработка и добыча углеводородного сырья в Северо-Западном регионе Казахстана привела к возникновению проблемы восстановления и очистки замазу-ченных почв. Наиболее полное, экологически безопасное и экономически обоснованное восстановление загрязненных нефтью и нефтепродуктами биоценозов может быть достигнуто при применении микробиологического метода с использованием высокоэффективных культур нефтеокисляющих микроорганизмов [1].
Многие микроорганизмы способны усваивать углеводороды нефти в качестве единственного источника углеродного питания. Этим они и отличаются от всех остальных представителей живого мира [2].
В этой связи особую актуальность приобретают исследования, направленные на выделение и отбор наиболее активных угле-
водородокисляющих микроорганизмов, способных трансформировать и утилизировать нефтяные углеводороды. Имеется ряд российских и зарубежных препаратов, разработанных на основе микроорганизмов, предназначенных для ремедиации нефтезагрязненных территорий. Несмотря на это поиск местных аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов на территории Казахстана, где происходит основная добыча нефти, актуален, это связано, в первую очередь, с высокой степенью аридности климата и особенностями пустынных почв.
Целью проведенной работы являлось изучение нефтеокисляющей активности наиболее активных углеводо-родокисляющих микроорганизмов, вы-
деленных из нефтезагрязненных почв Западного Казахстана.
Материалы и методы Объектами исследования являлись уг-леводородокисляющие микроорганизмы, выделенные из нефтезагрязненных почв месторождений Западно-Казахстанской области.
Нефтедеструктивную активность уг-леводородокисляющих микроорганизмов проверяли путем культивирования их в среде Ворошиловой-Диановой с содержанием 10% сырой нефти месторождения Каражанбас (состав нефти масс, %: серы 1,68; смолы 21,6; асфальтуны 5,3; парафиновые 71,0; нафтеновые 15,1; ароматические 13,9, температура застывания от -20°С до -25°С). Контролем служила минеральная среда Ворошиловой-Диановой с нефтью без внесения микроорганизмов. В колбы со стерильной средой Во-рошиловой-Диановой вносили по 1 мл ино-кулята. Титр исследуемых культур составлял 10 млн.кл/мл. Культивирование проводили в течение 14 суток при постоянной аэрации и температуре 28°С.
Остаточное содержание нефти в культурной жидкости исследуемых микроорганизмов определяли в лаборатории мониторинга АО «Биомедпрепарат инжиниринговый центр» г. Степногорск методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе Hewlett Packard HP-6890, укомплектованным UV/Vis и RI детекторами [3].
Результаты и обсуждение Для изучения изменения качественного состава сырой нефти при культивировании отобранных культур углеводородокисляю-щих микроорганизмов использовали жидкую
минеральную среду В-Д с добавлением 10%-ной сырой нефти месторождения Каражанбас. Анализ проводили методом газожидкостной хроматографии (рисунок 1). В качестве контроля использовали жидкую мине-ральную среду В-Д без внесения микроорганизмов.
При высокой нефтедеструктив-ной активности отмечается отсутствие маслянистости на стенках колбы, изменение нефтяной пленки в виде взвеси мелкодисперсной эмульсии, хлопьев, мелких гранул, цвет культуральной жидкости меняется с прозрачной до светло- или темно-коричневой. Метод ГЖХ позволяет не только количественно оценить изменение в составе сырой нефти по ее ароматической и алифатической фракциям, но и качественно по изменению содержания отдельных нефтяных углеводородов.
Для выявления наиболее активных культур углеводородокисляющих микроорганизмов нами проведен ряд опытов по культивированию микроор-ганизмов-нефтедеструкторов в минеральной среде В-Д с добавлением 10%-ной сырой нефти месторождения Кара-жанбас.
Анализ количественного изменения сырой нефти показал разную угле-водородокисляющую активность монокультур микроорганизмов. Результаты газохрамотографического анализа представлены на рисунке 1.
АТ3 KN3 KU1 MB3 MB5 U2.1 U2.6 U2.5 KR6 Культуры микроорганизмов
Рисунок 1 - Углеводородокисляющая активность монокультуры методом газожидкостной хроматографии
0
По рисунку 1 видно, что наименьший процент деструкции наблюдается в варианте с культурой микроорганизмов Rhodococcus erythropolis Кл1 31,53%, наибольший в варианте с культурой микроорганизмов Dietzia maris U2.1 - 57,31%. Остальные культуры микроорганизмов показали процент деструкции нефти в диапазоне от 40,07 до 48,51%. В контрольном варианте деструкция не отмечается. По данным рисунка 1 можно отметить, что наибольшей углеводородокисляющей активностью по отношению к сырой нефти обладают культуры микроорганизмов Dietzia maris U2.6, Rhodococcus erythropolis KN3, Dietzia maris Ku1, Rhodococcus erythropolis Кл1, Dietzia maris U2.1 и Rhodococcus erythropolis Кл4, которые за 14 суток утилизировали от 37,82 до 57,31%.
При этом нужно отметить, что наилучший результат по деструкции фракций нефти показали культуры микроорганизмов Dietzia maris U2.6 и Dietzia maris U2.5, так за 14 суток содержание нефти снизилось на 57,31% и 48,51% соответственно.
Полученные нами данные по углево-дородокисляющей активности показали, что культуры микроорганизмов лучше деструк-тируют сырую нефть. Это подтверждается и литературными данными [4], при изучении деструкции нефти отдельными видами микроорганизмов рода Rhodococcus и консорциумом этих микроорганизмов отмечено, что при внесении отдельного штамма микроорга-
низмов в титре 2 млрд. кл/мл по истечении 3-х суток степень разложения нефти составила 8-18%, остаточное содержание нефти в культуральной жидкости составило 73%. Наши результаты согласуются с данными [4].
По результатам определения остаточной нефти в колбах при культивировании исследуемых культур микроорганизмов на 10%-ной сырой нефти из 13 культур микроорганизмов нами отобрано 7 наиболее активных культур микроорганизмов Dietzia maris U2.6, Rhodococcus erythropolis KN3, Dietzia maris Ku1, Rhodococcus erythropolis Кл1, Dietzia maris МВ3, Dietzia maris U2.1 и Rhodococcus ruber Кл4.
Также нами проведен анализ концентрации индивидуальных углеводородов нефти путем сравнения содержания отдельных углеводородов в куль-туральной жидкости монокультур микроорганизмов и в контроле (среда В-Д с нефтью без микроорганизмов) в течение 14 суток культивирования. Анализ количественного изменения ароматической и алифатической фракций, смол асфальтенов и парафинов сырой нефти показали разную углеводородокисляю-щую активность монокультур микроорганизмов.
Результаты гравиметрического анализа представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Деструкция углеводородов нефти монокультурами микроорганизмов, %
№ Наименование культур Алифатическая фракция Ароматическая фракция Смолы Асфаль-тены Парафины
1 Rhodococcus erythropolis KR6 66,81 28,77 63,77 19,34 15,28
2 Rhodococcus ruber Кл4 68,3 49,17 48,67 59,26 20,41
3 Rhodococcus luteus AT2 35,87 41,1 47,31 64,61 1,71
4 Dietzia maris Ku1 48,63 60,24 56,97 51,44 30,64
5 Dietzia maris MB 5 53,27 45,81 65,53 46,5 11,35
6 Dietzia maris U2.1 63,85 34,7 63,83 55,56 15,6
7 Dietzia maris U2.6 72,45 63,76 63,02 48,97 20,94
8 Rhodococcus erythropolis Кл1 40,47 35,61 54,59 65,84 23,71
9 Dietzia maris МВ3 52,54 47,79 49,22 13,17 1,61
10 Rhodococcus erythropolis KN2 46,69 44,83 40,65 65,02 27,57
11 Rhodococcus erythropolis KN3 57,87 57,9 50,85 68,72 22,39
12 Dietzia maris АТЗ 55,66 43,88 31,82 15,23 26,92
13 Dietzia maris U2.5 57,46 49,6 46,97 29,63 10,46
По данным таблицы 1 необходимо отметить, что наибольшей углеводородокис-ляющей активностью по отношению к алифатической фракции нефти обладают культуры микроорганизмов Dietzia maris U2.1, Dietzia maris U2.6, Rhodococcus ruber Кл4 и Rhodo-coccus erythropolis КR6, которые за 14 суток утилизировали от 63,85% до 72,45%, тогда как по отношению к ароматической фракции нефти наибольшую деструкционную активность проявили культуры микроорганизмов Dietzia maris U2.6, Dietzia maris Ku1 и Rhodococcus erythropolis KN3, которые деструкти-ровали от 57,9 до 63,76%. Наилучший результат по деструкции фракции смолы в культу-ральной жидкости показали культуры микроорганизмов Rhodococcus erythropolis КR6, Di-
etzia maris U2.1, Dietzia maris U2.6 и Dietzia maris U2.1, Dietzia maris МВ5 до 65,53%, а наименьшую деструкционную активность показали культуры микроорганизмов Rhodococcus luteus AT2, Rhodococcus erythropolis KN3 и Dietzia maris АТЗ.
При этом нами определялось изменение численности исследуемых культур углеводородокисляющих микроорганизмов на исходные, 2, 4, 6, 8 и 10 сутки, также определялось остаточное содержание нефти в культуральной жидкости исследуемых культур микроорганизмов. Результаты представлены в таблице 2.
№ Наименование штаммов Исходный 2 сутки
1 Dietzia maris МБ 5 3,69+0,22х107 1,34+0,13х108
2 Rhodococcus ruber Кл4 3,6+0,20х108 5,16+0,82х107
3 Rhodococcus erythropolis KR6 2+0,16х109 1,13+1,22х108
4 Dietzia maris U2.1 2,66+0,18х108 1,81+0,15х107
5 Dietzia maris U2.6 1,32+0,13х108 7,5+0,10х107
6 Rhodococcus luteus AT2 2,75+0,19х108 4,2+0,73х106
7 Dietzia maris KU1 4,73+0,8х107 4,2+0,73х107
8 Dietzia maris U2.5 2,37+0,17х107 4,33+0,34х106
9 Dietzia maris МВ3 2,61+0,18х107 3,33+0,21х108
10 Rhodococcus erythropolis Кл1 3,26+0,20х107 2+0,51х107
11 Rhodococcus erythropolis KN3 1,08+0,12х107 1,13+0,38х107
12 Dietzia maris АТЗ 9,63+1,13х106 3,2+0,12х106
13 Rhodococcus erythropolis KN2 4,18+0,26х106 7,66+3,19х107
4 сутки 6 сутки 8 сутки 10 суток
2,03+0,36х108 1,06+0,11x108 6,7+0,94х107 8,83+0,08х107
3,88+0,69х107 5,15+1x107 6,83+0,95х107 1,43+0,13х108
2,65+0,95х108 3,96+0,72х108 1,79+0,15х108 2,88+0,19х108
6,45+0,74х107 1,9+0,5х107 2,3+0,55х107 1,51+0,14х107
6,21+0,37х107 145+0,13х108 3,4+0,17х107 8,63+1,07х107
7,23+0,57х106 1,07+0,11х108 3,96+0,72х108 5,76+0,87х106
6,12+0,19х107 6,3+0,91х107 4,96+0,18х107 2,41+0,17х107
2,12+0,33х106 1,73+0,48х106 1,0,3+0,37х106 1,03+0,37х106
2,66+0,61х108 1,7+0,47x10 1,76+0,48х106 1,36+0,42х106
1,22+0,11х107 6+0,89х106 2,89+0,19х107 2,5+1,66х106
1,63+0,18х107 4,76+0,79х106 4,26+0,75х106 3,43+0,67х106
3,29+0,42х106 1,63+0,46х106 2,7+0,6х106 8,66+3,39х105
6,58+1,11х107 3,2+0,64х106 1,13+0,38х106 3,33+2,10х105
Таблица 2 - Изменение численности углеводородокисляющих микроорганизмов при культивировании их на жидкой минеральной среде В-Д с добавлением 10%-ной сырой нефти месторождения Каражанбас, кл/мл
Так, определение численности культур углеводородокисляющих микроорганизмов при культивировании их на жидкой минеральной среде В-Д с добавлением 10%-ной сырой нефти показало, что уже на 2 сутки культивирования титр клеток у культуры микроорганизмов Rhodococcus ruber Кл4, Dietzia maris U2.6, Rhodococcus erythropolis KR6, Dietzia maris MB5, Dietzia maris U2.5 снижается на 1 порядок, у культуры микроорганизмов Rhodococcus luteus AT2 на 2 порядка, у остальных культур микроорганизмов Dietzia maris МВ3 и Rhodococcus erythropolis KN2 титр клеток по сравнению с исходным увеличился на 1 порядок, тогда как у культур микроорганизмов Rhodococcus erythropolis Кл1, Rhodococcus erythropolis KN3 и Dietzia maris АТЗ титр клеток не изменялся по сравнению с исходным. На четвертые и шестые сутки культивирования нами отмечено, что у активных культур микроорганизмов не происходит снижение титра клеток по сравнению с исходным показателем.
Также при определении титра клеток на 8 и 10 сутки культивирования нами было выявлено, что титр клеток у всех ис-
следуемых углеводородокисляющих микроорганизмов снизился на 1 порядок по сравнению с исходным показателем.
При сравнении результатов по изменению численности изучаемых культур микроорганизмов и деструкции ими сырой нефти, полученных после 10 суток культивирования, нами выявлено, что наименьший титр клеток и низкий процент деструкции отмечен у культуры микроорганизмов Rhodococcus erythropolis KR6, Dietzia maris MB5, Dietzia maris U2.5, Rhodococcus luteus AT2, Rhodococcus erythropolis KN3, Dietzia maris АТЗ при добавлении 10%-ной сырой нефти месторождения Каражанбас.
Таким образом, в результате изучения нефтеокисляющей активности отдельных культур углеводородокисляющих микроорганизмов с добавлением 10%-ной сырой нефти месторождения Каражанбас, выявлено, что наиболее активными культурами микроорганизмов являются Dietzia maris U2.6, Rhodococcus erythropolis KN3, Dietzia maris Ku1, Rhodococcus erythropolis Ел1, Dietzia maris МВ3, Dietzia maris U2.1 и Rhodococcus rubera4.
Литература
1. Гузев В.С., Левин С.В., Селецкий Г.И., Бабеева Е.Н., Калачникова И.Г., Колесникова Н.М., Оборин А.А., Звягинцев Д.Г. Роль почвенной микробиоты в рекультивации нефтезагрязненных почв// Микроорганизмы и охрана почв.- М.: Наука, 1989.- С.129-150.
2. Плотникова Е.Г. и др. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенных из почв и донных отложений района солеразработок// Микробиология, 2001.- т.70.- № 1.- С.61-69.
3. MADER-EPH-98-1 - Метод определения извлека-
емых нефтяных углеводородов - Отдел защиты окружающей среды штата Массачусетс.
4. Бахаева Л.П., Васильева r.K, Суровцева r.K., Муин В.М. Микробное разложение 3,4-дихлоранилина, сорбированного активированным углем// Микробиология, 2001.- № 3.- С.329-336.
5. Sharma S.L., Pant A. Biodegradation and conversion of alkanes and crude oil by a marine Rhodococcus sp.// Biodegradation, 200.- № 11.- Р.289-294.245 Давыдова С.Л., Тагасов В.И. Нефть как топливный ресурс и загрязнитель окружающей среды.- М.: РУДН, 2004.- 215 с.
