CC BY
401
УДК 631.461
О. Б. Сопрунова, М. А. Клюянова Астраханский государственный технический университет
ШТАММЫ-ДЕСТРУКТОРЫ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ
Нефть относится к наиболее токсичным загрязнителям окружающей среды. Несовершенство технологий добычи, транспортировки, переработки и хранения нефти приводит к ее значительным потерям [1]. Естественное самоочищение природных экосистем происходит обычно с недостаточно высокой скоростью, особенно при массированных загрязнениях и в регионах с пониженной температурой [2].
В условиях практически полной репрессии функциональной активности почвенной флоры и фауны определяющая роль в деградации нефтепродуктов в почве принадлежит микроорганизмам. Разложение углеводородов в почве обеспечивается прежде всего деятельностью угле-водородокисляющих микроорганизмов, способных в конструктивном и энергетическом обмене оксигенировать углеводородные субстраты, минерализовать их до СО2 и воды или превращать в соединения, утилизируемые другими группами микроорганизмов. В настоящее время установлено, что углеводородокисляющие микроорганизмы расселяются повсюду, особенно много их там, где в почве имеются газообразные или жидкие углеводороды [3].
Существуют два принципиальных подхода к биодеградации углеводородов в естественной среде: 1) стимуляция углеводородокисляющей (УВО) микрофлоры путем создания оптимальных условий для ее развития (внесение азотно-фосфорных удобрений, аэрация и др.,); 2) введение в загрязненную экосистему активных УВО-микроорганизмов наряду с добавкой солей азота, фосфора, извести и т. д. [4]. Наиболее перспективным способом очистки, особенно при наличии небольших площадей загрязненных почв, является биообработка in situ, при которой отсутствует необходимость в транспортировке загрязненной почвы. Эффективность процесса зависит от ряда факторов, в том числе от правильного выбора микроорганизма-деструктора [5].
Целью данной работы являлось выделение из нефтезагрязненных почв штаммов бактерий, обладающих способностью к деградации нефтяных углеводородов.
Объекты и методы исследований
Объектом исследований служили штаммы бактерий, выделенные методом накопительной микробной культуры из нефтезагрязненных почв буровых площадок Республики Калмыкия и почвогрунтов нефтебазы, расположенной в черте г. Астрахани. Накопительные микробные культуры выращивали на жидкой среде для УВО-микроорганизмов [6] с добавлением сырой стерильной нефти в качестве единственного источника углерода и энергии. Культивирование проводили в периодических условиях при температуре 28 °С в течение 14 суток. Из накопительных культур, в которых наблюдался микробный рост, путем высева на агаризованные среды для УВО-микроорганизмов, Миллса, Маккланга, Чапека и мясопептонный агар (МПА) из отдельных колоний выделяли чистые культуры микроорганизмов. Чистоту культур микроорганизмов определяли общепринятыми методами: микроскопическим контролем и рассевом на агаризованные питательные среды.
Чистые культуры бактерий использовали для изучения способности усваивать жидкие нелетучие углеводороды методом лунок на твердой минеральной среде для УВО-микроорганизмов [7]. Источником углерода служили стерильные нефть и нефтепродукты, которые вносили в лунки, проделанные в твердой питательной среде в чашках Петри стерильным пробочным сверлом. От лунки к периферии чашки производили штрихом посев культур. Об использовании нефти и нефтепродуктов судили по интенсивности роста по штриху через 15 суток культивирования по сравнению с контролем, которым служили чашки без внесения нефти. Идентификацию чистых культур выделенных бактерий проводили по культурально-морфологическим и физиологическим признакам, используя общепринятые методики [8, 9]. Филогенетическое положение выделенных штаммов проводили на основании анализа 16S РНК [10].
Культивирование и определение УВО-активности выделенных штаммов бактерий проводили в жидких питательных средах: Чапека, для парафинокисляющих (ПО) и УВО-микроорганизмов. В качестве источника углерода в среды вносили 2 % стерильной нефти. Культивирование проводили при температуре +28 °С на качалке при 190 об/мин в течение 14 суток. Периодически осуществляли визуальный контроль, отмечая образование осадка, хлопьев, помутнение и изменение нефтяной пленки.
Эмульгирующую способность культуральной жидкости чистых культур бактерий определяли путем добавления к 4 мл исследуемой жидкости 4 мл керосина с последующим встряхиванием в течение 10 минут [11]. Инокулят выделенных штаммов выращивали в пробирках с МПА в течение 5 суток при температуре 25 °С. Клетки смывали средой следующего состава (г/ л): К2НРО4 - 7,0; КН2РО4 - 3,0; СаСЬ (1 %; мл) - 1,0; MgSO4 х 7H2O - 0,1; (N^^4 - 1,0; FeSO4 -
0,5; ZnSO4 - 0,5; MnSO4 - 0,5; H2SO4 (0,1 Н, мл) - 10 с добавлением 0,6 мл глицерина. Далее отбирали часть (4 мл) суспензии и центрифугировали при 6 000 об/мин в течение 15 минут. Изменение индекса эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в измерительной пробирке выражали в процентах.
Результаты и обсуждение
Из нефтезагрязненных почв выделены чистые культуры бактерий, из которых отобраны 3 наиболее активных штамма, способные использовать нефть в качестве единственного источника углерода и энергии. Выделенные штаммы бактерий имели следующие признаки:
— штамм № 1 - грамположительные сферические клетки диаметром 0,5-1,5 мкм, одиночные; неспорообразующие; каталазоположительные и оксидазоотрицательные. Колонии на МПА чистого белого цвета, блестящие, гладкие;
— штамм № 2 - грамвариабельные тонкие, мелкие (0,5-1,0) мкм палочки, спор не образуют; оксидазо- и каталазоположительные, выделяющие диффундирующий нефлуоресцирующий сине-зеленый пигмент;
— штамм № 3 - грамположительные прямые палочки (0,5-2,5 мкм), способные к спорообразованию; оксидазоотрицательные и каталазоположительные.
На основании анализа 16S РНК выделенные штаммы бактерий идентифицированы соответственно как Staphylococcus xylosus; Pseudomonas aeruginosa; Bacillus cereus.
Способность выделенных культур использовать жидкие нефтяные углеводороды, определенная методом лунок, показала достаточно высокую активность в усвоении углеводородов всеми тремя штаммами бактерий (табл. 1). Наибольшая активность отмечена у Pseudomonas aeruginosa. Солярка и машинное масло являются более токсичными для микроорганизмов по сравнению с остальными нефтепродуктами.
Таблица 1
Активность штаммов бактерий, выделенных из накопительной культуры, по отношению к нефти и нефтепродуктам в баллах (тест по Егорову)
Бактерии Активность бактерий при добавлении нефтяных фракций
Контроль Нефть Мазут Солярка Машинное масло Моторное масло
Bacillus cereus 3 3 1 3 3 3
Staphylococcus xylosus 3 3 3 3 3 3
Pseudomonas aeruginosa 4 4 4 4 4 4
Способность выделенных культур использовать нефть на жидких питательных средах также показала высокую активность в усвоении углеводородов всеми штаммами бактерий (табл. 2). Наибольшая активность отмечена для Staphylococcus xylosus.
Таблица 2
Активность штаммов в отношении нефтяных углеводородов на жидких средах в баллах: 1 - очень слабый и медленный рост, 2 - слабый рост, 3 - средний рост, 4 - активный рост, 5 - активный быстрый рост, + - эмульгирование нефтяной пленки
Бактерии Активность бактерий
3 суток 1 7 суток 1 14 суток
Питательная с реда
УВО ПО Чапека УВО ПО Чапека УВО ПО Чапека
Bacillus cereus 1 1 2 3 2 3I+ 4 4 4I+
Staphylococcus xylosus 2 2 2 4I+ 3I+ 4I+
Pseudomonas aeruginosa 2I+ 1 2 2I+ 2I+ 3I+ 4I+ 4I+ 4I+
Известно, что образование биоэмульгатора микробной культурой способствует улучшению условий потребления водонерастворимых субстратов, в том числе и углеводородов нефти [12]. Исследование эмульгирующих свойств культуральных жидкостей изучаемых штаммов бактерий показало, что индекс эмульгирования при смешивании культуральной жидкости в соотношении 1:1 с керосином различен (табл. 3). Наиболее высокая эмульгирующая способность характерна для Bacillus cereus.
Таблица 3
Эмульгирующая активность бактерий
Бактерии Общий объем жидкости Объем эмульсионного слоя Индекс эмульгирования, %
Bacillus cereus 5,1 3,1 б0,78
Staphylococcus xylosus 4,7 1,5 31,91
Pseudomonas aeruginosa 4,8 1,2 25,00
Выделенные штаммы бактерий Bacillus cereus, Staphylococcus xylosus и Pseudomonas aeruginosa, растущие с достаточно высокой скоростью в присутствии нефти и нефтепродуктов в качестве единственного источника углерода и энергии, представляют интерес с точки зрения дальнейшего изучения микробной деградации нефтяных углеводородов. Это создает перспективы использования штаммов-деструкторов для получения биопрепаратов и разработки способов очистки нефтезагрязненных почв.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант РФФИ № 05-04-96507 «Перспективные биотехнологии очистки вод и почв от нефтяных углеводородов»).
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Петрикевич С. Б., Кобзев Е. Н., Шкидченко А. Н. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т. 39, № 1. - С. 25-30.
2. Создание и применение жидкого препарата на основе ассоциации нефтеокисляющих бактерий /
B. А. Чугунов, З. М. Ермоленко и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36, № 6. -
C. 666-671.
3. Исмаилов Н. М. Микробиологическая и ферментативная активность нефтезагрязненных почв // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. - М., 1988. - С. 42-56.
4. Вельков В. В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. - 1995. - № 3-4. - С. 70-76.
5. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв / Е. В. Стабникова, М. В. Селезнева, О. Н. Рева, В. Н. Иванов // Прикладная биохимия и микробиология. -1995. - Т. 31, № 5. - С. 534-539.
6. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для вузов / Е. З. Теппер и др. / Под ред. В. К. Шильни-кова. - 5-е изд., перераб. и доп. - М.: Дрофа, 2004. - 256 с.
7. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практ. пособие / Под ред. Н. С. Егорова. -2-е изд. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1983. - 251 с.
8. Определитель бактерий Берджи / Пер. с англ.; Под ред. Дж. Хоулта и др. - В 2 т. - М.: Мир, 1997.
9. Лысак Л. В., Добровольская Т. Г., Скворцова И. Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. - М.: МАКС Пресс, 2003. - 120 с.
10. Метод идентификации при помощи видоспецифических праймеров // Appl. and Envir. Microbiol. -2004. - Vol. 70. - P. 3664-3672.
11. Абрамзон А. А., Зайченко Л. П., Файнгольд С. И. Поверхностно-активные вещества. Синтез, анализ, свойства, применение: Учеб. пособие для вузов. - М.: Химия, 1988. - 200 с.
12. Елисеев С. А., Кучер Р. В. Поверхностно-активные вещества и биотехнология / Под ред. В. П. Кухарь.
- Киев: Наук. думка, 1991. - 116 с.
Получено 1.3.2006
DESTRUCTOR STRAINS OF OIL HYDROCARBONS
O. B. Soprunova, M. А. Klyuyanova
Three bacteria strains, which use oil and oil products as a unique source of carbon and energy are evolved from oily soils and soil-ground. These bacteria strains are identified as Bacillus cereus, Staphylococcus xylosus and Pseudomonas aeroginosa on the basis of the study of cultural-morphological properties and genetic analysis. Their oxidative and emulsifying properties towards to oil hydrocarbons are also investigated.
