CC BY
407
УДК 57.083.1:576.8.093
И. Ю. Куликова, И. С. Дзержинская Астраханский государственный технический университет
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ДЛЯ ОЧИСТКИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ МОРСКОЙ ВОДЫ
В современной концепции охраны природы, построенной на основе представления о структуре и свойствах биосферы, исключительная роль принадлежит микроорганизмам. Именно они выполняют основное условие существования всего живого в биосфере, которое заключается в сбалансированном продуцировании и разложении органического вещества. Неуправляемое антропогенное воздействие на природную среду в настоящее время привело к нарушению этого баланса, т. к. скорость накопления загрязняющих веществ превышает процессы их деструкции как при самоочищении природных экосистем, так и в техногенных экосистемах. Это справедливо и для нефтяных углеводородов, загрязнение которыми природной среды все увеличивается в результате того, что в современном мире нефть стала одним из самых необходимых органических соединений для жизнедеятельности человечества. Нефтяные углеводороды отличаются от других загрязнителей тем, что являются природными органическими веществами, а значит, имеют природных деструкторов в мире бактерий (процессы образования и редукции нефтепродуктов по последним научным данным существуют уже миллионы лет).
Усилия по предотвращению загрязнения морей нефтью, предпринимаемые во всем мире, уже дали определенные результаты, однако энергетическое значение углеводородов, высокие уровни добычи нефти, интенсивность ее транспортировки морским путем перекрывают достигнутые успехи в борьбе с загрязнением.
Особую значимость представляет изучение процессов трансформации нефтяных углеводородов в районах разведки, бурения и эксплуатации нефтяных скважин в шельфовой зоне морских вод, т. к. для данных экосистем наиболее остро стоит проблема сохранения их целостности в условиях возрастающей антропогенной нагрузки [1].
Интенсивное загрязнение территорий и акваторий нефтепродуктами требует разработки различных способов их очистки. На основе исследований по изучению способности природных экосистем к самоочищению и определению нефтелитических свойств микроорганизмов-деструкторов разрабатывают биопрепараты для очистки объектов, загрязненных нефтью.
Однако эффективность применения биопрепаратов зависит от ряда факторов. Зачастую активность внесенных препаратов подавляется аборигенными микробными популяциями, поэтому наиболее эффективными считают биопрепараты на основе природных углеводородокисляющих микроорганизмов различных таксономических и физиологических групп.
В связи с этим особую актуальность приобретают научные исследования по изучению реакции природных сообществ микроорганизмов на нефтяное загрязнение, определению их роли в процессе самоочищения морских акваторий от нефти с целью создания на их основе новых биопрепаратов для активизации этого процесса.
Целью настоящей работы был поиск активного штамма, интенсифицирующего процесс самоочищения морской воды от нефтяного загрязнения, определение его таксономического положения, а также изучение его углеводородокисляющей активности.
Методы исследования
В работе исследовали штаммы микроорганизмов, способных к деструкции нефтяных углеводородов, выделенные из проб воды Северного Каспия в районе разведочного бурения нефтяных скважин.
Чистые культуры получали путем последовательных пересевов накопительных культур с минеральной среды Миллса (среда ММС) [2] с добавками нефти на агаризованные питательные среды (мясопептонный агар (МПА), Миллса и Чапека) с нефтью и нефтепродуктами. Для выделения углеводородокисляющей микрофлоры некоторые исследователи используют среды с низким содержанием нефтепродукта или среды, содержащие наряду с нефтепродуктами дрожжевой авто-
лизат. Элективность таких сред низка, поскольку среди микроорганизмов имеется большое количество форм, развивающихся даже за счет незначительных примесей органических веществ. Поэтому применение таких сред позволяет отбирать не только истинные углеводородокисляющие бактерии, но и микроорганизмы, у которых способность к окислению углеводородов проявляется лишь в присутствии других органических соединений [3]. Среда Миллса имеет стабильный солевой состав, достаточную буферность и не содержит посторонней органики.
Изучение свойств выделенных штаммов проводили по общепринятым методикам и определителям [4, 5]. Для определения биохимических свойств микроорганизмов использовали также пластины биохимические для идентификации энтеробактерий (ПБДЭ).
Для определения филогенетического положения наиболее активного и жизнеспособного штамма в центре «Биоинженерия» Института микробиологии РАН был выполнен анализ последовательности (сиквенс) его 168 рибосомного гена.
Для оценки углеводородокисляющей активности использовали метод микроэкосистем в трех вариантах, поставленных на морской воде с внесением нефти и чистых культур микроорганизмов.
В среду, очищаемую от нефти, рекомендовано вносить не менее 106 бактериальных клеток в 1 мл, причем определение жизнеспособных клеток рекомендуется проводить перед использованием суспензии микроорганизмов [6, 7].
Суспензию штамма получали, смывая морской водой чистые двухсуточные культуры, выращенные на скошенном МПА, затем дважды отмывали бактериальные клетки от агара. Микроорганизмы отделяли центрифугированием (8 тыс. об/мин), ресуспендировали в морской воде и вносили суспензию в опытные емкости. Биомассу отделяли центрифугированием (8 тыс. об/мин, 20 мин), сухой вес биомассы определяли по общепринятой методике [8].
Вариант 1. В аквариумы вместимостью 6 000 мл, содержащие 5 000 мл морской воды, вносили сырую стерильную нефть (1 % по объему) и суспензию штамма из расчета 2,0 X 106 кл./мл (сухой вес биомассы - 92,4 мг/л). Контролем служили аквариумы с морской водой с добавлением стерильной нефти (1 % по объему) без внесения штамма.
Углеводородокисляющую активность штамма оценивали по изменению суммарного количества углеводородов на приборе Флюорат-02-3 М флюориметрическим методом [9]. Пробы на анализы отбирали через 3, 10, 20, 30 суток.
Вариант 2. В колбы Эрленмейера вместимостью 250 мл, содержащие 100 мл стерильной морской воды, вносили сырую стерильную нефть (1% по объему) и 1,0 мл суспензии штамма (2,0 X 106 кл./мл). Контролем служили колбы со стерильной морской водой с добавлением стерильной сырой нефти (1 % по объему) без добавления штамма. Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 10 суток. Через 1,
3, 7, 10 суток в колбах определяли содержание суммарных углеводородов.
Вариант 3. В колбы Эрленмейера вместимостью 250 мл, содержащие 100 мл среды Миллса, вносили сырую стерильную нефть (1 % по объему) и 1,0 мл суспензии штамма (2,0 X 106 кл./мл). Контролем служили колбы со средой Миллса без добавления суспензии штамма и с добавлением сырой стерильной нефти (1 % по объему). Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 10 суток.
Через 1, 2, 3, 7, 10 суток в колбах определяли содержание суммарных углеводородов.
Результаты исследований и их обсуждение
В ходе исследований из проб воды, отобранных в районе разведочного бурения нефтяных скважин на Северном Каспии, были выделены микроорганизмы, растущие на жидких и плотных средах с нефтью и нефтепродуктами. Просмотр посевов из накопительных культур на агаризо-ванной среде позволил выделить доминирующий штамм.
Выделенный штамм при культивировании на МПА образовывал круглые колонии 1-2 мм в диаметре, выпуклые, блестящие, слизистые, с ровным краем. Пигментация колоний от светлорозовой до красной. На МПБ культура образует однородную муть и осадок, на жидкой среде Миллса с нефтью в стационарных условиях появляется пленка розового цвета. Штамм представляет собой грамвариабельные прямые подвижные палочки, не образующие спор. Культура является аэробной, оксидазоположительной, каталазоположительной, галотолерантной (рост в интер-
вале солености 0,05-20 % №С1), не гидролизует крахмал, казеин, пектин и целлюлозу, не разжижает желатин, не образует сероводород и индол, восстанавливает нитраты в нитриты, образует кислоту из глюкозы, не окисляет лактозу. Выделенный микроорганизм не имеет аргининдегидро-лазы, лизин- и орнитиндекарбоксилаз, уреазы, фенилаланиндезаминазы, Р-галактозидазы, не утилизирует цитрат и малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой.
Способен к росту на средах Чапека, Миллса, магниево-калиево-дрожжевой (МКД), Макк-ланга как с добавлением дизельного топлива и нефти, так и без добавления.
Филогенетический анализ последовательностей гена 168 рРНК показал, что штамм относится к подразделению альфа-протеобактерий, к кластеру членов семейства РНуПоЪаМепасеа. Внутри этого семейства изучаемый штамм обнаружил наиболее высокое сходство нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК с родом РИуПоЪа^епит myrsinacearum (97,0-97,5 %).
Изучение скорости микробного окисления нефти в морской воде свидетельствует о неравномерном потреблении субстрата в период инкубации штаммов. Максимальное потребление нефти бактериальными культурами с визуально заметной дисперсией нефтяной пленки совпадало с логарифмической стадией их роста, что, по-видимому, естественно в связи с наибольшей скоростью роста микробной популяции в ее логарифмической фазе.
В варианте 1 штамм РИ. myrsinacearum показал способность к активизации процесса самоочищения морской воды от нефтяного загрязнения. Наиболее активное окисление углеводородов наблюдалось в течение первых 3 суток, что согласуется с наблюдениями и других авторов [10-12]. За этот период в сосудах с добавлением суспензии штамма убыль углеводородов составила 65,5 %, в контрольных сосудах - 31,6 % (табл. 1).
Таблица 1
Убыль углеводородов в 1 варианте, %
Вариант опыта Продолжительность эксперимента, сут
3 10 20 30
Морская вода 31,6 55,0 64,7 66,0
Морская вода с добавлением РИ. myrsinacearum 65,5 82,1 91,1 96,0
В дальнейшем разложение нефти шло примерно с постоянной скоростью. На 10 сутки эксперимента в емкостях с внесением культуры разложилось 82,1 % нефти, в контроле - 55 %.
Спустя 20 суток экспозиции в вариантах с внесением штамма убыль углеводородов составила 91,1 %, в контроле - 64,7 %.
По окончании экспозиции (30 суток) внесенная культура элиминировала 96 % нефти, в контрольных емкостях разложилось 66 % нефти.
В варианте 2 в ходе экспозиции РИ. myrsinacearum также показал высокую способность к деструкции нефти. Деструкция углеводородов в течение 10 суток составила 66,1 %, в контроле со стерильной морской водой, где убыль происходила без микробиологического окисления, - 28 % (табл. 2).
Таблица 2
Убыль углеводородов во 2 варианте, %
Вариант опыта Продолжительность эксперимента, сут
1 3 7 10
Морская вода стерильная 13,6 19,7 27,8 28,0
Морская вода стерильная с добавлением РИ. myrsinacearum 11,1 21,4 51,9 66,1
В варианте 3 на среде Миллса убыль углеводородов в течение 10 суток составила 54,5 %, в контроле - 42,3 % (табл. 3).
Таблица 3
Убыль углеводородов в 3 варианте, %
Вариант опыта Продолжительность эксперимента, сут
1 2 3 7 10
Среда Миллса 9,3 24,0 24,3 41,2 42,3
Среда Миллса с добавлением РИ. myrsinacearum 24,8 28,4 34,5 40,8 54,5
Таким образом, из проб воды Северного Каспия в районе разведки месторождений углеводородного сырья был выделен бактериальный штамм, филогенетический анализ которого позволил отнести его к виду Phyllobacterium myrsinacearum. Деструктивная активность штамма против углеводородов нефти и нефтепродуктов составляет 54,5-96,0 %.
Род Phyllobacterium был описан в 1962 г. [13], но таксономическое описание получил в определителе Берги. По данным определителя бактерий Берги представители этого рода встречаются в узелках на листьях высших растений видов семейств мирзиновых (Myrsinaceae) и мареновых (Rubiaceae).
Имеются данные о выделении бактерий рода Phyllobacterium из почвы [14-16], из корней сахарной свеклы [17, 18], известны симбиотические взаимодействия между Phyllobacterium myrsinacearum и водорослью Chlorella vulgaris [19], а также между Phyllobacterium sp. и Bacillus licheniformis, выделенных из мангровых растений [20]. Известно, что бактерии рода Phyllobacterium обладают свойством стимулировать устойчивость растений к болезнетворным организмам [17].
Анализ литературных данных и известных технических решений показал, что сведения об использовании бактерий рода Phyllobacterium в качестве углеводородокисляющих бактерий отсутствуют. Получен патент на изобретение «Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 для деструкции нефтяных углеводородов солоноватоводных экосистем» (патент № 2268934, заявка № 2003131668, приоритет изобретения 28.10.2003 г., зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27.01.2005 г.). Изобретение предназначено для использования в экологической биотехнологии, микробиологии при разработке способов биологической очистки водных экосистем от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (коллекционный номер ВКПМ В-9079).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Патин С. А. Экологические проблемы освоения нефтегазовых ресурсов морского шельфа. - М.: ВНИРО, 1997. - 350 с.
2. Mills A. L., Breule C., Colwell R. R. Enumeration of petroleum - degrading marine and estuarine microorganisms by the most probable number method // Canad. J. Microbiol. - 1978. - Vol. 24, N 5. - P. 552.
3. Углеводородокисляющая микрофлора акваторий Балтийского моря и Куршского залива, загрязненных при разливе мазута / Т. В. Коронелли, В. В. Ильинский, В. А. Янушка, Т. И. Красникова // Микробиология. - 1987. - Т. 56, № 3. - С. 472-477.
4. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology / Eds. Williams and Wilkins. - Baltimore, Hong Kong, London, Sydney, 1984-1989. - Vol. 1-4.
5. Определитель бактерий Берги. - М.: Мир, 1997. - Т. 1-2.
6. Евдокимова Г. А., Месяц С. П., Мозгова Н. П. Пути биодеградации нефти в водоемах высоких широт // Интродукция микроорганизмов в окружающую среду: Тез. докл. конф., 17-19 мая 1994 г. - М., 1994. - С. 33.
7. Ягафарова Г. Г., Гатауллина Э. М., Барахнина В. Б. Биотехнологический способ очистки отходов бурения от нефти и полимерных агентов // Прикладная биохимия и микробиология. - 1999. - Т. 35, № 2. - С. 178-181.
8. Мейнелл Д., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология (Теория и практика) / Под ред. А. С. Кривиского, В. Ю. Урбаха. - М.: Мир, 1967. - 348 с.
9. Сборник методических указаний. Измерение массовой концентрации химических веществ люминесцентными методами в объектах окружающей среды. - М.: Информ.-изд. центр Минздрава России, 1997. - 256 с.
10. Goma G., Pareilleeux A., Durand G. Cinetique de degradation des hydrocarbures par Candida lipolytica // Arch. Microbiol. - 1973. - N 2. - P. 97-109.
11. Perry J. J., Cerniglia C. E. Studies on the degradation of petroleum by filamentous fungi // The microbial degradation of oil pollutants / Georgia State Univ. - Atlanta. - 1973. - Vol. 19, N 2. - P. 35-37.
12. ZoBell C. E. Microbial degradation of oil: present status, problems and perspectives // The microbial degradation of oil pollutants / Georgia State Univ. - Atlanta. - 1973. - P. 153-162.
13. Knosel D. Prufung von Bakterien auf Fahigkeit zur Sternbildung / Zentralbl. Bakteriol. Parasitenk. Infek-tionskr. - 1962. - Vol. 116. - P. 79-100.
14. Megan M. McCoy. Determination of the presence of the catabolic alkane monooxygenase gene from soil microorganisms isolated from coastal sand dunes / Biological Sciences Department, College of Science and Mathematics, California Polytechnic State University. - San Luis Obispo, 2000. - P. 1-15.
15. Hallmann J., Rodriguez-Kabana R., Kloepper J. W. Chitin-mediated changes in bacterial communities of the soil, rhizosphere and within roots of cotton in relation to nematode control // Soil Biology and Biochemystry. -1999. - N 31. - P. 55-560.
16. Antje Lauer. Diversitat und Dynamik nitratreduzierender und denitrifizierender Bakteriengruppen eines Ack-erbodens: Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultat der Christian-Albrechts-Universitat zu Kiel. - Kiel, 2001. - 206 p.
17. The identification and plant interaction of a Phyllobacterium sp. a predominant rhizobacterium of young sugar beet plants / B. Lambert, H. Joos, S. Dierickx et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 1990. - Vol. 56. - P. 1093-1102.
18. Mergaert J., Cnockaert M. C., Swings J. Phyllobacterium myrsinacearum (subjective synonym Phyllobacterium rubiacearum) emend. / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2002, Sep; 52 (Pt 5): 1821-3.
19. Lebsky V. K., Gonzalez-Bashan L. E., Bashan Y. Ultrastructure of interaction in alginate beads between the microalga Chlorella vulgaris with its natural associative bacterium Phyllobacterium myrsinacearum and with the plant growth-promoting bacterium Azospirillum brasilense // Canadian Journal of Microbiology. - 2001. -Vol. 47(1). - P. 1-8.
20. Synergism between Phyllobacterium sp. (N2-fixer) and Bacillus licheniformis (P-solubilizer), both from a semiarid mangrove rhizosphere / A. Rojas, G. Holguin, B. R. Glick, Y. Bashan // FEMS Microbioloby Ecology. - 2001. - Vol. 35. - P. 181-187.
Статья поступила в редакцию 1.03.2006
USE OF MICROBIOLOGICAL METHOD FOR CLEARING THE OILPOLLUTED SEA WATER
I. Yu. Kulikova, I. S. Dzerzhinskaya
The strain Phyllobacterium myrsinacearum, possessing hydrocarbon-oxidizing ability was evolved from the tests of water of Northern Caspian Sea in the region of the oil field exploring. Destructive activity of the strain against hydrocarbon of the oils and oil products makes 54,5-96,0 %. The patent is received for invention, intended for use in ecological biotechnology, microbiology at development of the ways of biological clearing of water ecological systems from oil-pollution and oil product. The strain is deposited in the All-Russia collection of industrial microorganisms.
