CC BY
221
AZЭRBAYCAN К1МУА ШШЛЫ № 4 2014
93
УДК 628.543.96
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ ПОЧВ
Э.Р.Бабаев
в1Ъв1ЪаЪаву@уакоо. ёв
Институт химии присадок им. А.М.Кулиева Национальной АН Азербайджана
Поступила в редакцию 24.11.2014
Описана схема фиторемедиации нефтезагрязненных почв Апшеронского полуострова с использованием растений и ассоциированных с ними сообществ микроорганизмов - деструкторов нефти. Из ризосферы толерантных к нефтезагрязнениям растений выделены и отселектированы активные штаммы - деструкторы нефтепродуктов. Подобраны добавки, стимулирующие интенсификацию процессов фиторемедиации с помощью растений и микроорганизмов-деструкторов.
Ключевые слова: нефтезагрязнение, рекультивация, микроорганизмы, биоремедиа-ция, штаммы, фиторемедиация.
Загрязнения природной среды нефтью и сопутствующими загрязнителями является острейшей экологической проблемой во многих нефтедобывающих районах Азербайджана, в частности, Апшеронского полуострова. Эксплуатация существующих месторождений нефти, а также проводимые работы по освоению новых запасов нефти привели к загрязнению нефтепродуктами значительных площадей на суше и в море. В настоящее время борьба с нефтезагрязнениями стала рассматриваться как одна из главных проблем, требующих срочного решения.
Традиционные технологии детоксикации и рекультивации нефтезагрязненных почв не всегда эффективны и потому использование их сегодня не целесообразно. Наиболее дешевым и достаточно эффективными признаны биологические методы (биоремедиация) очистки нефтесодержащих объектов.
В последние годы развивается новый подход к биоремедиации, использующий объединенный метаболический потенциал микроорганизмов и растений, - фиторемедиация [1]. В силу своего взаимовыгодного сосуществования растительно-микробные ассоциации (симбиозы) имеют большие преимущества при выживании в неблагоприятных условиях окружающей среды. Ускорить процессы деградации нефтезагрязнений в почве можно не только путем посева специально подобранных растений, но и созданием условий их потенциального роста и повышения метаболической активности их ризосферного микробиоценоза. Это достигается агротехнической обработкой почвы, внесением удобрений биологических или синтетических ПАВ и др. Известно, что микробные сообщества корневой зоны растений занимают особое место в системе управления факторами естественного плодородия почв.
Целью настоящей работы является разработка методов очистки нефтезагрязненных почв с применением биотехнологий, основанных на микробно-растительных взаимодействиях и учитывающих почвенно-климатические особенности региона.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектами исследований были образцы нефтезагрязненных почв, отобранные с прикорневой сферы (ризосферы) растений, типичных для территорий нефтепромыслового района Гала Апшеронского полуострова. В качестве контроля использовали образцы почв с территории названного района. Образцы почв отбирали стерильным ножом в стерильную посуду. Затем на очищенном спиртом стекле их тщательно перемешивали стерильным фарфоровым шпателем, распределяли тонким слоем и доводили до воздушно-сухого
состояния в чистом сухом помещении, не содержащем в воздухе пыли и газов (NH3, HCl). Был проведен ряд физико-химических (влажность, рН, содержание нефти) и микробиологических анализов образцов.
Содержание нефтепродуктов в почвах определяли весовым методом после экстракции углеводородов из навески почвы горячим гексаном в аппарате Сокслета [2].
Анализы нефтепродуктов, загрязняющих исследуемые образцы почв. Осаждение асфальтенов из экстрактов исследуемой нефти проводили 40-кратным по объему количеством петролейного эфира с температурой кипения 400С. Методом жидкостно-ад-сорбционной хроматографии на колонке с двойным сорбентом (внизу - окись алюминия, наверху - силикагель 40/100 мкм) ("Chemapol", Чехия) деасфальтенизаты разделяли по фракциям, элюированным гексаном, бензолом и смесью бензол-этанол (1:1).
Микробиологические исследования проводили немедленно после отбора образцов почв. Численность гетеротрофных микроорганизмов в почве определяли методом 10-кратных разведений почвенной суспензии [3] с последующим высевом на поверхность агаризованных сред - мясо-пептонный агар (МПА) для бактерий и сусло-агар (СА) для грибов и дрожжей - при 28-320С.
Колонии бактерий определяли через 3 дня, а грибов и дрожжевых - через 5 дней.
Для определения количеств углеводородокисляющих бактерий была использована минеральная среда состава (г/л): KH2PO4 - 0.5, K2HPO4 - 0.5, MgSO4^O - 0.3, FeCh - 0.01, NaCl - 0.01, CaCl2 - 0.01, NaNO3 - 2.5, агар-агар - 20, вода дистиллированная - 1 л, рН 7.
Культивирование микроорганизмов проводили в колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл жидкой питательной среды, на круговой качалке (180 об/мин) при 240С в течение 10 суток.
Количественный учет анаэробных азотфиксирующих бактерий осуществляли, пользуясь жидкой питательной средой Виноградского. Инокулят вносили на дно простерили-зованной пробирки с питательной средой. Для аэробных азотфиксирующих микроорганизмов в качестве питательной среды использовали среду Эшби. Результаты регистрировали после инкубации культур при температуре 280С в течение 12-14 суток. В пробирках с развивающимися культурами на поверхности питательной среды образовывалась тонкая пленка.
Накопительные культуры анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий получали, выращивая их на разнообразных средах, в которые добавляли клетчатку. Состав питательной среды для анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий (г/л): (NH4)2SO4 - 10.0, K2HPO4 - 2.0, MgSO4-7 H2O - 0.4, NaCl - следы, CaCO3 - 20.0, фильтровальная бумага.
Для выделения целлюлозоразлагающих аэробов использовали питательную среду Гетчинсона и Клейтена состава (г/л): K2HPO4 - 1.0, CaCh - 0.1, MgSO4 ^H2O - 0.3, NaCl -0.1, FeCl2 - 0.01, NaNO3 - 2.5, дистиллированная вода - 1000 мл.
Фитотоксичность почвы оценивали биотестом - (пщеница, кукуруза) по соотношению числа проросших и не проросших семян, а также длин проростков и корней. Продолжительность эксперимента - 30 суток [4].
Выделение и подсчет денитрификаторов осуществляли с использованием питательной среды состава (г/л): NaNO3 - 20.0, KNO3 - 2.0, K2HPO4 - 0.5, MgS04•7Н20 и FeSO47H2O - следы, дистиллированная вода - 1000 мл.
Количественный учет споровых форм микроорганизмов проводили по смешанной среде: МПА + СА в соотношении 1:1. Инкубацию проводили в течение 5-6 дней. Они хорошо развиваются в более глубоких слоях почвы в условиях, близких к анаэробным.
Э.Р.БАБАЕВ
95
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Несмотря на наличие общих черт внутрипочвенной деструкции нефти в почвах различных типов и биологических зон, скорость естественного самоочищения почв сильно различается в зависимости от состава нефти или нефтепродуктов, а также зонально-климатических особенностей и других факторов [5]. В связи с этим при разработке технологии фиторемедиации нефтезагрязненных почв необходимо учитывать все факторы, влияющие на скорость и результат этого процесса.
Объектами исследований служили образцы нефтезагрязненных почв с различным содержанием нефтепродуктов, отобранных с прикорневой сферы (ризосферы) растений, типичных для территории нефтепромыслового района Гала. В качестве контроля использованы образцы почв с территории этого района (табл.1).
Таблица 1. Характеристика исследуемых образцов почв
Образцы нефтезагрязненных почв
Характеристика вариант 1 вариант 2 чистая поч-
образцов почв прикорневая поверхностный прикорневая поверхностный ва
зона слои зона слой (контроль)
содержание нефти, % 3.85 6.6 10.2 12.2 -
влажность:
полевая 14.5 17.0 22.0 25.0 20.0
гигроскопическая 1.7 1.9 1.9 2.2 1.8
рН 8.2 8.12 7.8 7.4 7.2
Для дальнейших исследований были использованы почвы с содержанием 6.6% нефтепродуктов - наиболее приемлемым для получения по возможности полной информации.
Для выделения из почв и учета групп микроорганизмов применяли специальные методы и питательные среды. Они различаются в зависимости от биохимических особенностей выделенных микроорганизмов.
Полученные результаты микробиологических исследований приведены в табл.2.
Таблица 2. Количественный учет микроорганизмов в исследуемых почвах
Группы микроорганизмов Образцы почв
нефтезагрязненная почва прикорневая зона чистая почва
бактерии 35•106 32108 18-10'
грибы 550 36103 72-102
актиномицеты 23•103 85 104 34 104
споровые 14103 54104 62-102
дрожжи 67 102 70-102 74 103
углеводородокисляющие 11•104 84 105 29103
аэробные азотфиксирующие 465 31102 612
анаэробные азотфиксирующие 500 22 102 290
аэробные целлюлозоразлагающие 16102 17•103 13 103
анаэробные целлюлозоразлогпющие 312 21 102 12-102
нитрификаторы 937 11102 11-102
динитрификаторы 37102 52102 197
По ним можно сделать вывод, что в исследуемых почвах количество бактерий значительно превышает количество грибов и дрожжевых. Количество углеводородокисляю-щих микроорганизмов в нефтезагрязненных образцах почв больше, чем в контрольном. Это объясняется наличием большого количества органического питания в среде.
Помимо учета общего количества микроорганизмов на питательных средах, ставилась задача изучения более узких групп микроорганизмов, так называемых физиологических. Эти микроорганизмы связаны с определенным этапом превращения органических и неорганических веществ. Например, определенные группы микроорганизмов связаны с
отдельными стадиями превращения азота: азотфиксаторы, нитрофиксаторы, денитрифик-саторы. Большое значение имеет изучение целлюлозоразлагающих микроорганизмов, способных утилизировать труднодоступные для растений соединения фосфора, а также участвующие в определенных этапах превращения соединений серы, железа. Наличие большого количества микроорганизмов, участвующих в процессах азотфиксации, нитрификации, разрушения целлюлозы свидетельствует о плодородии почв.
Из табл. 2 следует, что число аэробных азотфиксирующих бактерий в нефтезаг-рязненной почве меньше, чем в контрольной. Количество анаэробных азотфиксаторов в загрязненной почве больше, чем в контрольной. Целлюлозоразлагающие бактерии лучше развиваются в почве прикорневой зоны. В целом из анализа полученных данных следует, что количество микроорганизмов в ризосфере больше, чем в остальной части почвы. Это, возможно, связано с тем, что в выделениях корней имеются органические соединения, обладающие большой физиологической активностью: витамины, ростовые вещества, гормоны и т.д. , играющие большую роль во взаимоотношениях растений с микроорганизмами. Фитотоксичность почв оценивали биотестом (пшеница, кукуруза и др.) по соотношению числа проросших и не проросших зерен, а также длин проростков и корней.
Для наблюдения за процессом фиторемедиации в лабораторных условиях изучены образцы почв с различной степенью загрязненности, а также смеси активных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из ризоидной сферы прорастающих на нефтезагрязненных почвах исследуемых территорий. Штаммы изучали отдельно и в сочетании с компонентами, обогащающими почвы питательными веществами (органические удобрения). Способность штаммов к деградации определяли как степенью активности соответствующих ферментов, так и числом клеток микроорганизмов, осуществляющих этот процесс (табл. 3).
Таблица 3. Результаты вегетационного эксперимента (60 суток)
Образы почв Нефтезагряз-ненность, % Фитотоксичность почв Количество углеводород-окисляющих бактерий Степень утилизации нефти, %
количество исхода посаженных зерен количество исхода проросших зерен средний рост стеблей 30 суток 60 суток 30 суток 60 суток
чистая почва + зерна кукурузы 6.6 8 8 49.5 18104 85 104 - -
нефтезагрязненная (н/з) почва + зерна кукурузы 8 5 22.8 92 104 96105 14.9 17.8
н/з почва + зерна кукурузы + углеводородокисля-ющие культуры 8 7 37.3 25 106 59107 19 22
н/з почва + углеводород-окисляющие культуры + зерна кукурузы + органическое удобрение 8 8 40.1 46 107 38 • 108 21 25
Из данных табл. 3 следует, что внесение в почву смеси отселектированных углеводо-родокисляющих бактерий в смеси с органическими удобрениями способствует повышению степени утилизации нефтезагрязнений.
Исходя из результатов вегетационного эксперимента, можно рекомендовать биопрепарат, состоящий из ассоциации отселектированных микроорганизмов, выделенных из почв прикорневой зоны растений, толерантных к данным загрязнениям, в комплексе с органическими удобрениями для очищения нефтезагрязненных почв.
Ожидается, что наряду с микробиологической очисткой фиторемедиация будет способствовать повышению плодородия этих почв.
Э.Р.БАБАЕВ
97
При исследовании нефтяных загрязнений, выделенных из исследуемых почв, показано, что, в отличие от добываемых нефтей, нефтяные загрязнения не содержат легких фракций и характеризуются более высокой плотностью.
Таблица 4. Характеристика нефти до и после ее деструкции, мас. %
Объект исследования Плотность, г/см3 Состав компонентов (фракций), мас. %
гексановая бензольная спирто-бензольная ацетоновая
нефть (нативная) 0.8708 60.1 n 2d0 1.4957 16 n D01.5137 11.8 0.8
нефтезагрязнения (экстракт с прикорневой зоны) 0.8923 54 n D0 1.4825 14.5 n D0 1.5225 12.5 1.3
нефтяные загрязнения после фито-ремедиации 0.8857 47 n D0 1.4862 13.7 n D 1.5136 14.7 1.7
Выявлено, что при деструкции нефти, выделенной из загрязненных почв, происходило не просто снижение остаточного содержания, но и изменение фракционного состава. В табл.4 представлены данные фракционного состава нефти до и после ее деструкции. В качестве контроля взята нефть, выделенная из почв и используемая в качестве субстрата при культивировании.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бикинина А.Г., Бакаева М.Д., Логинов О.Н., Силищев Н.Н. // Нефтяное хоз-во. 2007. № 3. С. 119-116.
2. Современные методы исследования нефтей (Справочно-методическое пособие) / Под ред. Богомолова А.И. и др. М.: Недра, 1984. 431 с.
3. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Звягинцева Д.Г. М.: МГУ, 1980. 224 с.
4. Гончарук Е.И., Сидоренко Г.И. Гигиеническое нормирование химических веществ в почвах (руководство) М.: Медицина, 1986. С. 87-104.
5. Солнцева Н.П. Добыча нефти и геохимия природных ландшафтов. М.: Изд-во МГУ, 1998. 369 с.
NEFTL3 ÇÎRKL3NMÎÇ TORPAQLARIN BÎOLOJI T3MÎZL3NM3SÎ
E.R.Babayev
Maqalada bitkilar va nefti parçalayan mikroorqanizm birliklarinin birga tasirindan istifada etmakla Abçeron yarimadasinin neftla çirklanmiç torpaqlarinin fitoremediasiya sxemi tasvir olunmuçdur. Neft çirklanmalarina tolerant olan bitkilarin rizosferasindan neft mahsullarini parçalayan faal çtamlar ayrilmiç va seçilmiçdir. Bitkilar va destruktor mikroorqanizmlar vasibsila fitoremediasiya proseslarini intensiv-laçdiran alavalar seçilmiçdir.
Açar sôzlsr: neft çirkbnmdsi, rekultivasiya, mikroorqanizmlar, bioremediasiya, çtammlar, fitoremediasiya. BIOLOGICAL REMEDIATION OF OIL CONTAMINATED SOILS
E.R.Babaev
in the article there has been described phytoremediation scheme of oil contaminated soils of Apsheron Peninsula with the use of plants and assosiates of microorganisms - oil decomposers. From rhizosphere of plants which are tolerant to oil contamination there have been isolated and selected the active strains -oil products decomposers. The additives stimulating intensification of the phytoremediation processes with the use of plants and microorganisms - decomposers have been chosen.
Keywords: oil contamination, recultivation, microorganisms, bioremediation, strains, phytoremediation.
