CC BY
12
VeStnik KQzfimU № I - 2020
внутриклеточных сигнальных путей. Измерение уровня экспрессии микроРНК в крови позволяет использовать их в качестве биомаркеров и предикторов заболевания.
Ключевые слова: эпигенетика, микроРНК сахарный диабет 2 типа, ожирения, болезнь Альцгеймер, болезнь Паркинсон.
A.Ye.Yessenbekova1 , N.T. Ablaikhanova w, I.Rusanova2, A.N Kozhakhmetova1'2, A.S.Kozhamzharova3
1Kazakh National University named after Ai-Farabi, Kazakhstan, Almaty 2University of Granada, Spain, Granada 3Asfendiyarov Kazakh National Medical University, Almaty, Kazakhstan
THE ROLE OF MICRORNAS IN THE ETIOLOGY OF AGE-RELATED DISEASES
Resume. The article describes the general characteristics and biogenesis of circulating biomarkers, the role of miRNAs in Alzheimer's and Parkinson's disease, diabetes and obesity, as well as diseases of the cardiovascular system. The literature review summarizes the current evidence on the effect of micro-RNA on the function of age-related diseases and their possible influence on the development of pathological processes. MicroRNAs regulate various links in the pathogenesis of diabetes mellitus, including insulin action, adipokine expression,
adipogenesis, lipid metabolism. Different types of miRNAs can both activate and inhibit adipogen, by influencing certain substrates of intracellular signaling pathways. Measuring the level of microRNA expression in the blood allows using them as biomarkers and predictors of the disease.
Key word: sepigenetics, microRNA, type 2 diabetes, obesity, metastasis, Alzheimer's disease, Parkinson's disease.
УДК 612.111
Э.М. Сабирова1, Р.А. Гареев2 , Н.О. Кудрина2, А.М. Калекешов2
1 Казахский национальный университет имени аль-Фараби кафедра биофизики и биомедицины, elya_sabirova@list.ru 2РГП на ПХВ «Центральная лаборатория биоконтроля, сертификации и предклинических испытаний» КН МОН РК
ИЗУЧЕНИЕ СУБСТАНЦИЙ ПЕРЕНОСИМЫХ НА ПОВЕРХНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ
В Казахстане впервые разработана методика получения субстанций с поверхности эритроцитов и лейкоцитов. Создана она на основе многолетних исследованиях обмена субстанций между кровью, тканями и лимфой. Субстанции, переносимые на поверхности эритроцитов, в целом еще слабо изучены.
Цель данного исследования состояла в изучении субстанций на поверхности эритроцитов и возможности дальнейшего использования этих субстанций в качестве составляющих лекарственных препаратов. В работе использовались биохимический и иммуноферментный анализы.
Ключевые слова: кровь, эритроциты, субстанции, IgG, IgA, IgD.
Введение.
Использование крови как лекарства, известно еще с самых древних времён. Так как в крови содержится полный комплекс веществ, для стабильной жизнедеятельности организма, её целесообразно использовать в качестве лечебного средства. По мере развития фармакологии и медицины в целом, удалось извлечь всё самое ценное из крови и производить для общества некоторые препараты. Наиболее важным компонентом для создания препаратов, которые используются для профилактики и лечения железодефицитных состояний является кровь. Кровь также используется для создания ряда таких лечебных препаратов как например, кровозаменитель БК-8, гидролизин Л-103, аминопептид-2, фибриновые пленки, гемостатическая губка. Таким образом, сельскохозяйственные животные являются источником не только пищевого и кормового, но и лечебного сырья, используемые как человеком, так и ветеринарным врачом. В научных исследованиях субстанции крови порой включаются в среды для выращивания микробиологических материалов [1]. Показатели крови, как одной из физиологических систем, являются интеграционным индикатором
функционирования всего организма [2]. Выполняя
разнообразные функции, они могут характеризовать уровень адаптации животных разных пород к конкретным условиям внешней среды. Приблизительно 99% общего объема форменных элементов крови приходится на эритроциты (около 1% занимают лейкоциты, а тромбоциты - до 0,1%), меньше всего стволовых клеток. Некоторые изменения состава крови животных связаны не только с породой, но также с упитанностью, возрастом, полом, условиями кормления и т. д. Соотношение клеток крови у разных животных несколько отличается [3]. В Казахстане разработана методика получения субстанций с поверхности эритроцитов и лейкоцитов [4]. Основана она на основе многолетних исследований обмена субстанций между кровью, тканями и лимфой. В РК обоснована новая функция эритроцитов, названная адсорбционно-транспортной (АТФЭ). Главная особенность этой функции -регулируемая адсорбция субстанций плазмы крови на поверхности эритроцитов с последующим транспортом этих субстанций в обменный слой кровеносных капилляров. АТФЭ участвует в обеспечении быстрого и селективного поступления субстанций из крови в ткани [5,6,7,8]. Врачи различных специальностей часто сталкиваются с трудностями в лечении больных аутоиммунными,
хроническими и острыми инфекционными заболеваниями. Основной причиной тяжелого течения многих заболеваний являются врожденные или приобретенные нарушения в иммунном ответе, преимущественно в системе гуморального звена иммунитета [9]. Антитела, специфически взаимодействующие с антигенами, были обнаружены во фракции у-глобулинов сыворотки крови. Позднее было идентифицировано семейство иммуноглобулинов и разработаны технологии получения их препаратов, которые в настоящее время широко и с успехом используются в комплексном лечении различных заболеваний [10]. Иммуноглобулины широко используются для лечения и профилактики осложнений аутоиммунных, воспалительных заболеваний и иммунодефицитных состояний у новорожденных, детей, подростков и взрослых [11].
Таким образом, целью данной работы является разработка биопрепаратов на основе биоактивных и
иммунологических субстанций, переносимых на поверхности клеток крови животных. Материал и методы исследования.
Материалом для исследования послужила кровь лошади, полученная при забое. Кровь собиралась в стерильную посуду с добавлением антикоагулянта 0,1 М Цитрата натрия, в соотношении 1:10 и доставлялась в лабораторию. Вся полученная кровь центрифугировалась в режиме 3000 об/ мин в течении 15 минут, надосадочная плазма собиралась для проведения тестов. В осадок добавлялось равное количество раствора Рингера и 4% натрия хлорида, аккуратно перемешивалось и подвергалось повторному центрифугированию в режиме 3000 об/ мин в течении 15 минут. Надосадочная жидкость (смыв с эритроцитов и лейкоцитов) использовалась для биохимического и иммуноферментного анализа. Эксперименты с определением смывов, получаемых с помощью растворов высокого осмотического давления (4, 5, 6, 7, 8 % хлористого натрия) выявили тенденцию образования эритроцитарных агрегатов. Были опробованы растворы на базе раствора Рингера, к раствору Рингера добавлялось 4, 5, 6, 7 % хлористого натрия. Однако и в этом случае сохранилась некоторая агрегация эритроцитов. Проведение биохимических видов исследований Кровь центрифугировалась 20 мин при 1000 об/мин для получения плазмы. В плазме крови, с использованием коммерческих наборов Биосистемс (Испания), изучались основные биохимические показатели: общий белок (г/л), альбумин (г/л), холестерин (ммоль/л), триглицериды, (ммоль/л). Результаты исследований регистрировались на полуавтоматическом биохимическом анализаторе Screen Master (Италия).
Проведение иммуноферментного анализа. Концентрация иммуноглобулинов A, M, G, E в плазме крови и смывах с эритроцитов определялась при помощи коммерческих наборов IgE-общий - ИФА - БЕСТ, IgA-общий - ИФА - БЕСТ, IgM-общий - ИФА - БЕСТ, IgG-общий -ИФА - БЕСТ (МЕ/мл)
Так, все образцы плазмы и смывов собрались с использованием 0,1М цитрата натрия в качестве антикоагулянта (одна десятая от объема). Далее
центрифугировались образцы при 3000 оборотов/мин в течение 10 минут. Перед постановкой анализа стандарты, образцы, выдерживались при комнатной температуре (20-25°C). Требуемое для проведения анализа число 8-луночных стрипов помещались их в рамку - держатель. В соответствующие лунки вносился требуемый объем стандартов IgA, IgM, IgG, IgE и тестируемых образцов, лунки микропланшета закрывались пленкой и инкубировались в течение 20 минут при температуре 37°С в термошейкере при 700 об/ мин. После первой инкубации лунки микропланшета промывались 5 раз, используя по 400 мкл рабочего раствора фосфатно-солевого буфера для промывок на лунку на один цикл промывки. После внесения буфера для промывок удалялось содержимое лунок, переворачивая на фильтровальную бумагу 5 раз. После промывки вносилось по 100 мкл рабочего раствора конъюгата антител классов IgA, IgM, IgG, IgE человека, микропланшет закрывался пленкой и содержимое инкубировалось в течение 20 минут при температуре 37°С в термошейкере при 700 об/ мин. Затем после второй инкуб ации лунки микропланшета промывались и удалялось содержимое лунок по аналогичному принципу описанному выше. Далее вносилось по 100 мкл раствора ТМБ (хромогенного субстрата) в каждую лунку, закрывался микропланшет пленкой и содержимое инкубировалось в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. После этого добавлялось по 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку. Оптическая плотность измерялась при 450 нм против 630 нм сразу после внесения стоп-раствора. Рассчитывалось среднее значение ОП для каждого стандарта и образцов, строилась калибровочная кривая, откладывая концентрации стандартов по оси Х против соответствующих средних значений ОП стандартов, измеренной при 450 нм, по оси Y. Используя калибровочную кривую, определялась концентрация в тестируемом образце и значение умножалось на фактор разведения. Результаты выражали в МЕ/мл.
Проведение иммуноферментного анализа иммуноглобулина D (нг/мл). Исследование иммуноглобулина D проводилось аналогичным методом, но с использованием коммерческого набора Human IgD ELISA для количественного определения иммуноглобулина D человека, каталожный номер № EI7800 Assay Pro.
Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку данных проводили с определением среднего значения, среднеквадратичного и стандартного отклонения, статистической ошибки средней и процента различий. При определении достоверности разницы между показателями сравниваемых групп вычислялся t-критерий достоверности, величину р определяли по таблице значений Стьюдента, изменения считали достоверными при р<0,05. Все данные были рассчитаны в пакете программ MS Offis Excel 2010. Результаты.
В исследовании изучалось изменение содержания общего белка и альбумина в плазме крови и в смывах с «молодых» и «старых» эритроцитов. Полученные данные представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Биохимические показатели плазмы крови и смывов с мембран эритроцитов и лейкоцитов у лошади
Показатель, ед.измерения Плазма крови Смыв с молодых эритроцитов Смыв со старых эритроцитов
Общий белок, г/л 66,94±1,23 32±1,17 29,6±1,05
Альбумин , г/л 27,83±1,08 16,34±0,81 16,4±0,63
Холестерин, ммоль/л 2,89±0,032 1,64±0,05 0,9±0,015
Холестерин ЛПВП, ммоль/л 1,18±0,021 0,66±0,04 0,4±0,01
Холестерин ЛПНП, ммоль/л 0,89±0,023 0,34±0,013 0,28±0,013
Триглицериды, ммоль/л 0,94±0,022 0,4±0,012 0,3±0,001
Примечание: * статистически достоверные изменения по отношению к контрольной группе (р<0,001)
Белки сыворотки крови, являются важной составной частью внутренней среды организма. Изменения концентрации общего белка в смывах с «молодых» и «старых» эритроцитов по сравнению плазмой были ниже на 51-56%. Альбумин - основной белок плазмы крови, который
составляет 40-60% от общего количества белка плазмы. [18,19]. Альбумины выделяют в отдельную группу белков в крови, которые дают более значимую информацию, нежели просто общий белок. Альбумин в плазме находился в количестве 27,83±1,08 г/л, в смывах с молодых и старых
УекЫЬ КагПГШ № I - 2020
эритроцитов - 16,34±0,81 и 16,4±0,63 соответственно. Установлено, что содержание альбумина в смывах с «молодых» и «старых» эритроцитов и лейкоцитов не слишком отличаются.
Триглицериды (или триацилглицериды) представляют собой эфиры жирных кислот и глицерина. Показатели триацилглицеридов в плазме составили 0,94±0,022 ммоль/л, а в смывах со старыми эритроцитами - 0,3±0,001 и в смывах с молодыми-0,4±0,012 ммоль/л.
Холестерин — это стерин, содержащий стероидное ядро из четырех колец и гидроксильную группу. Показатели
Таблица 2 - Показатели уровня иммуноглобулинов классов лошади_
холестерина в плазме составили 2,89±0,032 ммоль/л, а в смывах со старыми эритроцитами - 0,9±0,015и в смывах с молодыми-1,64±0,05ммоль/л.
Показатели содержания холестерина в смывах с «молодых» эритроцитов более значительно выросли по сравнению со смывами «старых» эритроцитов. Транспорт триглицеридов «молодыми» эритроцитами возрос на 20% (Таблица 1). Было проведено исследование уровня иммуноглобулинов IgA, IgG, ^ в плазме крови и смывах с эритроцитов и лейкоцитов, данные представлены в таблице 2.
А, 14, G, Е плазмы крови и смывов с мембран эритроцитов у
Образец ^ г/л ^М г/л IgG г/л IgЕ г/л
Плазма крови животных (п=10) 1,39±0,20 0,7±0,15 10,34±1,2 0,66±0,12
Смыв с лейкоцитов (п=10) 2,58±0,2* 1,88±0,18* 2,8±0,05* 2,66±0,08*
Смыв с молодых эритроцитов (п=10) 2,47±0,08* 1,48±0,12* 3,93±0,05* 2,98±0,08*
Смыв со старых эритроцитов (п=10) 2,6±0,15* 2,1±0,02* 3,4±0,6* 2,8±0,06*
Примечание: * статистически достоверные изменения по отношению к плазме крови (р<0,001)
Как показано в таблице 2 обнаружены статистически значимые (р<0,001) различия между показателями иммуноглобулинов в плазме крови животных и в смывах с мембран эритроцитов у лошади. Так, уровень иммуноглобулина А в плазме составил 1,39±0,20 г/л, иммуноглобулина М 0,7±0,15 г/л, иммуноглобулина IgG 10,34±1,2 г/л, иммуноглобулина Е 0,66±0,12 г/л. Обращает на себя внимание статистически достоверное (р<0,001) возрастание содержания уровня иммуноглобулинов А, М, Е
в смывах с мембран эритроцитов, в то время как уровень иммуноглобулина G в смывах с мембран эритроцитов статистически достоверно снижается в 2,5-3,0 раза с 10,34±1,2 г/л до 2,8±0,05 г/л . Это свидетельствует о том, что иммуноглобулины классов А, М, Е у лошадей представлены преимущественно мембраносвязанными формами, в то время как иммуноглобулин G в основном с растворимой, и способен удаляться с плазмой крови.
Таблица 3 - Показатели уровень иммуноглобулина Б в смывах с эритроцитов лошади с наличием и при удалении фибриногена__
Образец Концентрация IgD, нг/мл
1. Смыв с эритроцитов лошади с фибриногеном (п=5) 0,88±0,02*
2. Смыв с эритроцитов лошади без фибриногена (п=5) 0,92±0,06*
Примечание: * статистически достоверные изменения по отношению к дефибринированной плазме (р<0,001)
В ходе проведения исследования было выявлено отсутствие иммуноглобулина D в смывах со старых эритроцитов. В смывах с молодых эритроцитов выявлено относительно большое количество этого иммуноглобулина, так в смывах с эритроцитов лошади с фибриногеном показатель IgD-0,88±0,02 нг/мл, а смывах без фибриногена -0,92±0,06 нг/мл (Таблица 3). Обсуждение.
В крови животных выявляются все известные иммуноглобулины. В настоящее время известно 5 иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM, ^ и IgD). В медицине редко анализируются одновременно все вышеуказанные иммуноглобулины. IgD практически не определяется для диагностики заболеваний и т.д. Его практически нет в плазме крови. Но в смывах с лейкоцитов этот иммуноглобулин всегда есть.В этом направлении нами в Казахстане сделан диагностический прорыв по анализу иммуноглобулинов со смывов с лейкоцитов и с некоторых других клеток крови. Важно выявлять соотношение всех иммуноглобулинов. В крови больше всего IgG. В плазме его почти в 3 раза больше, чем в смыве с эритроцитов В Казахстане впервые в мире выявлено наличие иммуноглобулина Д в смывах с лейкоцитов и юных эритроцитов клеток крови. В зарубежных публикациях имеются предположения, что иммуноглобулин Д участвует
в активации лимфоцитов и функционально тесно связан иммуноглобулином М.
Не исключено, что уменьшение количества или активности иммуноглобулина Д приводит к хроническим воспалительным процессам и увеличивает вероятность возникновения онкозаболеваний. Нами обнаружено существенное отличие количества и соотношение многих субстанций в смывах со старых и молодых (зрелых) эритроцитов и лейкоцитах. Возможно, количество иммуноглобулина Д отличается у разных животных. В данном исследовании использовалась кровь лошадей. Намечается использование крови свиней. Лошади болеют сибирской язвой, инфекционным мытом, лошадиным гриппом и т.д. Крупный рогатый скот болеет специфической чумой, бруцеллезом, стригущим лишаем, туберкулезом, ящуром и т.д. Но у лошадей, несомненно, есть врожденный иммунитет к некоторым другим инфекционным болезням.
Выводы.
Проведенное исследование позволило выделить субстанции на поверхности красных кровяных клеток, которые в дальнейшем могут послужить для создания препаратов. Но живые субстанции крови для использования в медицине требуют дальнейшего исследования. Для Казахстана это важно, поскольку само животноводство широко развито многие столетия.
СПИСОК
1 Mohandas N., Gallagher P., Red cell membrane: past, present, and future // BLOOD. - 2008. - Vol.112, №10. - Р. 39393948.
2 Лазько А.Е., Ярошинская А.П., Морфофункциональное состояние эритроцитов как критерий патологических реакций в организме // Журнал фундаментальных и прикладных исследований. - 2009. - №3(28). - С. 102-107.
3 А.Т. Волков, А.П. Осипов Кровь убойных животных с основами ее переработки и санитарной оценки: учебное пособие. - Пермь: ИПЦ «Прокростъ», 2014. - 124 с.
4 R.A. Gareyev Adsorption-transport function of erythrocytes // Физиология. - 2015. - №1. - С. 50-56.
5 Гареев Р.А. Фундаментальные и прикладные аспекты адсорбционно-транспортной функции эритроцитов // Медицинская экология. - 2011. - №2(45). - С. 22-24.
6 Гареев Р.А. Концепция адсорбционно-транспортной функции эритроцитов // Материалы 5 съезда физиологов Казахстана. - Караганда, 2003. - С. 75-79.
Вестник К03НМУ № I - 2020
7 Gareyev R. Adsorption-transport function of erythrocytes: Important Facts about new diagnostic Capability // International Journal of Applied and Fundamental Research. - 2011. - №1. - P. 5-10.
8 Гареев Р.А. Некоторые итоги исследований и перспективы изучения адсорбционно-транспортной функции эритроцитов // Вестник КазНУ. - 2010. -№2(44). - С. 103-109.
9 Румянцев А.Г. Основные свойства внутривенных иммуноглобулинов и показания к их применению // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2011, - Т.10, №2. - С. 39-50.
10 Донюш Е.К. Использование внутривенных иммуноглобулинов в клинической практике // Вопросы современной педиатрии. - 2011. - Т.10, №2. - С. 49-63.
11 Лазанович В.А., Просекова Е.В. Внутривенные иммуноглобулины: механизмы терапевтических эффектов // Медицинская иммунология. - 2014. - Т.16, №4. - С. 311-322.
Э.М. Сабирова, Р.А. Гареев , Н.О. Кудрина, А.М. Калекешов ЭРИТРОЦИТТЕР БЕТ1НДЕ ТАСЫМАЛДАНАТЫН ЗАТТАРДЫ ЗЕРТТЕУ
TyWh: Каза;станда алгаш рет эритроциттер мен лейкоциттердщ бетшен заттарды шайып алу эдга жасалды. Бул эдостщ жасалуына кептеген жылдар бойы ;ан мен улпалардыц, лимфа суйьщтыгыныц арасындагы зат алмасу удеркш зерттеу непз болды. Дегенмен эритроциттер бетшде тасымалданатын заттардыц кейбiр ;асиеттер! толы; зерттелмеген.
Зерттеу жумысыныц ма;саты эритроциттер бетiнде тасымалданатын заттарды зерттей отырып эрi ;арай оларды емдiк препараттар курамында ;олдану мумгандМн ;арастыру. Жумыста биохимиялы; жэне иммуноферменттш талдау эдiстерi ;олданылды.
ТYЙiндi сездер: ;ан, эритроциттер, субстанциялар, IgG, IgA, IgM, IgE, IgD.
E.M. Sabirova, R.A. Gareev, N.O. Kudrina, A.M. Kalekeshov STUDY OF SUBSTANTS PORTABLE ON THE SURFACE OF ERYTHROCYTES
Resume: The method of obtaining substances from the surface of red blood cells and white blood cells has been developed for the first time in Kazakhstan. It was created on the basis of many years of research on the exchange of substances between blood, tissues and lymph. Substances carried on the surface of red blood cells are generally poorly understood.
The aim of the research is to study the substances on the surface of red blood cells and the possibility of further use of these substances as components of drugs. In research used biochemical and enzyme immunoassay.
Keywords: blood, red blood cells, substances, IgG, IgA, IgM, IgE, IgD.
ЭОЖ 612.015.1-3-616
1А.М. Жумабаева, Атанбаева, 2С.Н. Эбд1решов, 3Н.С. Ахмад, 3Г.Т. Алжанбекова, 1М.С. Кулбаева, 1Л.Б. Умбетьярова, 1Н.Б. Исаева, 1М. Молсадьщ^ызы, 1М.^. Телегенова, 1А. Нуржан
1Эл-Фараби атындагы К,азац ¥лттыц Университету Цазацстан, Алматы 2ЦР БГМ ГК Адам жэне жануарлар физиологиясы институты, Цазацстан, Алматы 3С.Ж. Асфендияров атындагы К,азац ¥лттыц медицина университет/
ЖЕДЕЛ ГИПОКСИЯ КЕЗ1НДЕГ1 ЛИМФА АFЫСЫ ЖЭНЕ ЛИМФА ТYЙШДЕРЩЩ ЖИЫРЫЛУ БЕЛСЕНД1Л1Г1Н ЗЕРТТЕУ
Иттер мен егеуцуйрыцтардыц экспериментальды гипоксиясы кезшде цан мен MYшелiклимфаныц реологиялыц цасиеmi бузылуымен, ягни бул олардыц ую жылдамдыгыныц азаюы, цан мен лимфаныц тутцырлыгы жэне тромбогендiк процеа артуымен кврiнедi. Биохимиялыц зерттеулер бойынша лимфа мен цан плазмасында жалпы белок концентрациясыныц твмендеуi жэне АлАТжэне АсАТ белсендшктершц артуы, эритроциттердiц осмостыц meзiмдiлiгшц жэне несептегi иондыц цурамныц езгеруш кврсеттi. Жануарларда экспериментальды гипоксия кезшде лимфа агысыныц, жалпы белоктыц темендеу1 АлАТ пен АсАТ ферменттершц белсендл^шц артуы жэне лимфа мен цанныц реологиялыц цасиеттершц бузылуы аныцталды, эpi лимфа ЖYйеciнiц цурылымдыц-цызметтщ бузылуы байцалды.Бул жумыстар элi де болсада зерттеулердi цажет екенд^н кврcетедi. ТYйiндi сездер: гипоксия, лимфа, лимфа mYйiндерi, лимфа агыны, лимфа тамырлары, цан
Kазiргi кезде адам организмi эртYрлi стресс факторлар элеуметтш-экономикальщ жагдайларды, салауатты вмiр
эсерше ушырауда. Ол факторларга колайсыз экологиялы; салтыныц бузылуын т.б. жаткызуга болады. Fылыми-
