CC BY
68
СИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ № 1 2008 (выпуск 2)
УДК: 616 - 001.17 : 612.017.1 - 053.2
С.А. Артемьев, Г.В. Булыгин, Н.И. Камзалакова, В.Г. Булыгин
E-mail: [email protected]
ОНТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПАРАМЕТРОВ ИММУННОГО СТАТУСА И МЕТАБОЛИЗМА ЛИМФОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ
ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия»
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время известно, что здоровый ребенок рождается, имея сформировавшиеся центральные ор-
ганы иммунитета и различные иммунокомпетентные клетки, но функционирование его иммунной системы в процессе роста и развития организма имеет ряд особенностей. В процессе развития ребенка наблюдаются определенные критические периоды [6], когда на антигенное воздействие иммунная система дает неадекватный или даже парадоксальный ответ. Он может носить очень слабый характер, недостаточный для защиты, или, наоборот, чрезмерный, гиперергический (аллергический) [2].
Цель исследования: выявление функциональных особенностей иммунокомпетентных клеток в различные периоды онтогенеза.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследованы фактически здоровые дети обоего пола: 25 детей в возрасте 1-5 лет и 25 детей в возрасте 6-10 лет. Фенотип лимфоцитов обследованных детей оценивался методом непрямой флуоресценции
с мышиными моноклональными антителами на люминесцентном микроскопе «Люмам И-1». На лимфоцитах определялось наличие молекул различных CD-рецепторов [1; 3; 7]. Моноклональные антитела, использованные при проведении этой методики, выпускаются ЗАО «Сорбент».
Для характеристики функции фагоцитов наиболее информативным оказался показатель времени выхода на пик графика индуцированной хемилюминесцен-ции (ХЛ), который оценивался по методике De Soli P. et al. [8] с опсонизированным зимозаном в качестве активатора индуцированной хемилюминесценции. Фагоцитарный индекс устанавливался методом определения фагоцитарной активности нейтрофилов с использованием латекса.
Состояние гуморального звена иммунной системы оценивалось следующими методами:
• определение концентрации циркулирующих иммунных комплексов проводилось после инкубации сыворотки крови с раствором ПЭГ-6000 и последующим учетом результатов на фотоэлектрокалориметре [10].
• концентрация сывороточных иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG определялась по методике радиальной иммунодиффузии Manchini G. et al. [9];
• содержание общего IgE в сыворотке крови определялось с помощью моноклональных антител (инструкция по применению иммуноферментной тест-системы АОЗТ «Биоиммуноген», г. Москва). Изучение липидного спектра лимфоцитов периферической крови проводилось методом тонкослойной хроматографии. Липидные экстракты из лимфоцитов (4,0-6,0106 клеток) готовились по Folch et al. (1957), разгонка фракций проводилась на силуфолевых пластинках UV-254 с последующим их проявлением 5%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в 96%-ном этаноле. Для определения размеров пиков пластины сканировались на Chromoscan-200. Идентификация липидных фракций осуществлялась при помощи стандартов фирмы Sigma, а также по относительной подвижности фракций [4]. Определялись следующие фракции липидов: фосфолипиды (ФЛ), холестерин (ХОЛ), свободные жирные кислоты (СЖК), триацилглицериды (ТАГ), эфиры холестерина (ЭХ); их соотношения (ХОЛ/ФЛ, СЖК/ТАГ).
Активность внутриклеточных ферментов в общей популяции лимфоцитов периферической крови (400—500 103 клеток) определялась биолю-минесцентным методом с бактериальной люцифе-разой [5]. Активность вычислялась по наработке восстановленного или окисленного кофермента в избыточно обогащенной субстратом среде. Были изучены внутриклеточные НАД(Ф)-зависимые ферменты: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (Г3ФДГ), лактат-дегидрогеназа (ЛДГ), малатдегидрогеназы (НАДМДГ и НАДФМДГ), глутамат- и изоцитратдегидрогеназы (НАДГДГ, НАДФГДГ, НАДИЦДГ, НАДФИЦДГ),
обратные НАДФ- и НАД-зависимые глутаматдеги-дрогеназы (обр. НАДФГДГ, обр. НАДГДГ), а также глутатионредуктаза (ГР). Показатели активности ферментов рассчитывались в мкЕД/104 клеток.
Данные в тексте и в таблицах приведены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего значения (М±т). Статистическую значимость различий анализировали с помощью ^критерия Стьюдента-Фишера в доверительном интервале более 95% при нормальном распределении вариационного ряда.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Обследование фактически здоровых детей 1-5 и 6-10 лет показывает, что возрастных особенностей гормонального фона у них нет. Среднегрупповые показатели концентраций кортизола, инсулина, тиреоид-ных гормонов в сыворотке детей указанных двух групп статистически значимо между собой не различаются. Это позволило высказать предположение о том, что имеющие место различия в иммунных показателях и в характере внутриклеточного метаболизма лимфоцитов обусловлены особенностями развития иммунной системы в онтогенезе.
Так, в младшей возрастной группе (табл. 1) определяется статистически значимо большее количество лейкоцитов (р<0,05) в периферической крови. При этом среди лейкоцитов преобладают молодые и «пролиферирующие» клетки: палочкоядерные гранулоциты (р<0,05), лимфоциты (р<0,001) и
Таблица 1
Показатели клинического анализа крови и иммунокомпетентных клеток детей 1-5 и 6-10 лет
Показатели 1 - 5 лет (n=25) 6 - 10 лет (n=25)
Лейкоц., мкл 5918,75±218,90 5205,26±160,82
П/я, % 2,50±0,30 1,62±0,15
С/я, % 36,38±1,27 48,68±0,75
Эоз., % 3,13±0,28 3,58±0,29
Мон., % 6,94±0,62 5,11±0,35
Лимф., % 51,06±0,98 41,53±0,77
Лимф., мкл 3004,69±90,36 2159,26±72,15
CD3, % 60,19±0,71 62,37±0,71
CD3, мкл 1804,87±50,55 1343,35±42,38
CD4/CD8 1,33±0,07 1,12±0,04
CD19, % 12,88±0,51 11,26±0,40
CD19, мкл 388,22±22,22 244,75±13,29
IgA, г/л 2,72±0,17 3,39±0,15
IgM, г/л 0,95±0,06 1,03±0,06
IgG, г/л 11,06±0,39 12,87±0,41
IgE, МЕ 61,88±5,73 46,68±3,08
ФИ, % 56,88±2,65 64,37±1,85
ХЛ, мин. 29,13±0,89 22,84±0,71
С.А. Артемьев, Г.В. Булыгин и др.
ОСОБЕННОСТИ ИММУНИТЕТА ЛИМФОЦИТОВ ДЕТЕЙ
Таблица 2
Показатели метаболизма лимфоцитов детей 1-5 и 6-10 лет
моноциты (р<0,05), являющиеся предшественниками макрофагов.
Среди различий в показателях иммунного статуса (табл. 1) следует отметить у детей 1-5 лет более высокое абсолютное содержание лимфоцитов (р<0,001), В-клеток (р<0,001) и Т-лимфоцитов (р<0,001). При этом если уровень последнего параметра обусловлен только более высоким количеством лейкоцитов в периферической крови, то первые два - и большими относительными показателями соответствующих клеток.
Обращает на себя внимание то обстоятельство, что, несмотря на повышенное у этих детей содержание В-лимфоцитов, функция их невысока - концентрации IgA и IgG ниже, чем у детей 6-10 лет (р<0,01 и р<0,01; соответственно). Более же высокий в младшей группе уровень IgE соответствует известной из литературы повышенной аллергической «готовности» в этом возрасте [6].
Необходимо отметить и различия в функциональных показателях фагоцитарной системы детей обследованных групп. Меньшие возможности этой системы
в младшем возрасте подтверждаются снижением ФИ (р<0,05) и большим временем выхода на пик кривой индуцированной ХЛ (р<0,001).
Перечисленные выше онтогенетические различия иммунного статуса обследованных детей сочетались с особенностями структурно-метаболических параметров их лимфоцитов (табл. 2). Последние заключались в меньшем содержании в клетках детей 1-5 лет основных структурных компонентов - холестерина (р<0,01) и фосфолипидов (р<0,05), а также ТАГ (р<0,001). В то же время показатели ЭХ и суммарного холестерина превышали таковые в старшей возрастной группе (р<0,01 - в обоих случаях). Интегративный показатель СЖК/ТАГ, отражающий баланс процессов липо-лиз/липогенез, был выше у младших детей (р<0,01), что свидетельствовало о смещении внутриклеточных реакций в сторону липолиза.
Последнее обстоятельство подтверждалось и более высокой активностью фермента Г3ФДГ (р<0,01), контролирующего подачу избытка субстратов с липидного обмена на гликолиз. Наиболее же характерной чертой метаболизма лимфоцитов детей 1-5 лет является более высокая активность всех НАДФ-зависимых ферментов (табл. 2): Г6ФДГ (р<0,01), НАДФИЦДГ (р<0,1), НАДФГДГ (р<0,001), НАДФМДГ (р<0,01) и ГР (р<0,01). Такой метаболический профиль клеток свидетельствует о высокой интенсивности в них реакций синтеза и способности к пролиферации.
ВЫВОДЫ
Таким образом, можно заключить, что онтогенетические особенности функционирования иммунной системы детей 1-5 и 6-10 лет обусловлены не только количественными различиями показателей иммунитета, но и структурно-метаболическими характеристиками иммунокомпетентных клеток. Последние у детей 1-5 лет свидетельствуют о том, что в клетках более интенсивно протекают реакции холестеринового и жирнокислотного обмена (в сочетании с повышенными затратами на реакции обмена энергетических субстратов - ТАГ) с перераспределением избытка липидных субстратов на гликолиз. Высока и способность внутриклеточного метаболизма их лимфоцитов к процессам синтеза и пролиферации за счет выработки повышенного количества НАДФН+. Совокупность этих характеристик, как известно, свойственна активно пролиферирующим, быстро обновляющимся клеточным популяциям. Однако возможности гуморального звена, вероятно, в связи с этим же - преобладанием в популяции В-лимфоцитов молодых и функционально незрелых клеток - несколько ограничены, что подтверждается меньшим у младших детей количеством наиболее высокоспецифичных ^А и ^О. Менее высоки в возрасте 1-5 лет и возможности фагоцитарного звена иммунитета, которые лимитируются снижением как поглотительной способности фагоцитов, так и их презентационной функции.
Показатели 1 - 5 лет (n=25) 6 - 10 лет (n=25)
ХОЛ, % 14,20±0,57 16,50±0,46
ФЛ, % 22,09±0,85 25,00±0,76
СЖК, % 8,71±0,49 8,40±0,46
ТАГ, % 9,12±0,31 11,08±0,37
ЭХ,% 45,89±1,67 39,02±1,21
ХОЛ /ФЛ 0,65±0,01 0,67±0,02
СЖК/ТАГ 0,96±0,05 0,77±0,04
Общ. ХОЛ, % 60,09±1,24 55,52±1,02
Г6ФДГ, мкЕ/104кл. 8,47±0,70 5,47±0,66
Г3ФДГ, мкЕ/104кл. 24,59±2,29 16,98±2,08
ЛДГ, мкЕ/104кл. 31,79±2,22 28,26±2,46
НАДМДГ, мкЕ/104кл. 44,93±2,69 41,11±3,55
НАДФМДГ, мкЕ/104кл. 7,09±0,83 4,73±0,42
НАДИЦДГ, мкЕ/104кл. 1,38±0,14 1,56±0,17
НАДФИЦДГ мкЕ/104кл. 19,76±1,99 14,87±1,20
НАДГДГ, мкЕ/104кл. 1,60±0,19 1,74±0,15
НАДФГДГ, мкЕ/104кл. 4,07±0,16 2,94±0,28
ГР, мкЕ/104кл. 6,23±0,61 3,81±0,30
ЛИТЕРАТУРА
1. Иммунология: В 3-х т.: пер. с англ./ под ред. У. Пола. -Москва: Мир, 1987 - 1988. - Т. 2. - 456 с.
2. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. -С-Пб.: Специальная литература, 1998. - С. 216-229.
3. Лесков В.П. Клиническая иммунология для врачей / В.П. Лесков, А.Н. Чередеев, Н.К. Горлина. - Москва, 1997. - 125 с.
4. Ростовцев В.Н. Количественное определение липидных фракций плазмы крови / В.Н. Ростовцев, Г.Е. Резник // Лаб. дело. - 1982. - №4. - С. 218-221.
5. Савченко А.А. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом / А.А. Савченко, Л.Н. Сунцова // Лаб. дело. - 1989. - №11. - С. 23-25.
6. Стефани Д.В. Иммунология и иммунопатология детского возраста / Д.В. Стефани, Ю.Е. Вельтищев. - Москва: Медицина, 1996. - 67 - 88 с.
7. Чередеев А.Н. Интерпретация лабораторных показателей при оценке иммунного статуса человека / А.Н. Чередеев, Л.В. Ковальчук // Лаб. дело. - 1991. - № 2. - С. 6-14.
8. De Soli, P. Whole blood chemiluminescence: a new technical approach to assess oxygen-dependent microbial activity of granulocytes / P. De Soli, S. Lippa, G. Lixxarru // J. Clin. Lab. Autom. - 1983. - Vol. 3. - P. 391-400.
9. Manchini G. Immunochemical quantitation of antigens by single radical immunodiffusi-on / G. Manchini, A.O. Carbonara, J.F. Heremas // Immunochemistry. - 1965. - Vol. 2. - P. 235-254.
10. Simple method of circulating immune complex / V. Haskova [et al.] // Z. Immunol. Forsch. - 1978. - Bd. 154. - Р. 399406.
ONTOGENETIC PECULIARITIES OF PARAMETERS OF IMMUNE STATUS AND METABOLISM OF HEALTHY CHILDREN LYMPHOCYTES
S.A. Artemyev, G.V. Boulygin, N.I. Kamzalakova, V.G. Boulygin
SUMMARY
The condition of lipid spectrum and activity of lymphocytes’ intracellular enzymes in children’s aged from 1to 5 and from 6 to 10 years using immunochemistry methods were studied The study results allow to conclude that functional peculiarities of lymphocytes in children of different age groups are dependent not only on quantitative differences but on structural-metabolic characteristics of the immune competent cells.
Key words: immunity, lymphocytes metabolism, lymphocytes sera, lymphocytes lipid spectrum, immune competent cells.
