CC BY
12
579.222: 543. 422.23
П. П. Суханов, А. Ю. Крыницкая, Е. В. Петухова, М. Н. Мещерякова, П. П. Крыницкий
ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ДИНАМИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ДРОЖЖЕВОГО ПРЕПАРАТА МЕТОДОМ ЯМР РЕЛАКСОМЕТРИИ. СООБЩЕНИЕ 5. ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСОНА ОЭДФ НА ПРОЦЕСС КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Ключевые слова: культивирование хлебопекарных дрожжей, комплексон, механизм, молекулярное структурно-
динамическое состояние, ЯМР релаксометрия.
Методами ЯМР-релаксометрии показано, что влияние комплексона на рост хлебопекарных дрожжей носит локально-экстремальный (псевдоколебательный) характер, обусловленный наличием как минимум двух механизмов воздействия комплексона на микроорганизмы, суммарный вклад от которых в процесс культивирования нелинейно зависит от его концентрации. Введение оптимальной концентрации гидрокси-этилидендифосфоновой кислоты (ОЭДФ) позволяет заметно повысить выход биомассы дрожжей Saccharomycescerevisiae - 509 без существенных изменений в их качественных показателях.
Keywords: baker's yeast cultivation, complexon, mechanism, molecular structural-dynamical state, NMR relaxometery.
It is shown with the help of NMR relaxometry methods, that the complexon's influence on the baker's yeast growth demonstrates locally extreme (pseudo vibrational) character due to the existence minimum of two mechanisms of the complexon's action on microorganisms, whose summary control of culturing process changes nonlinearly with complexon concentration. Injection of the opti-mal concentration of hydroxyethylidendiphosphone acid (HEDF) allows to get a marked increase of Saccharomyces cerevisiae - 509 biomass output without essential changes of its qualitative parameters.
Введение
В настоящее время комплексоны и комплексонаты металлов находят широкое применение в различных областях современной человеческой деятельности [1, 2]. Способность комплексонов выступать в роли хелатирующего агента, образовывать биологически активные комплексонаты и менять ионный состав среды имеет огромное значение для метаболизма живых организмов. Последнее является важнейшей предпосылкой применения комплексообразующих соединений в биотехнологических процессах, используемых в пищевой промышленности, медицине, сельском хозяйстве. И в связи с вовлечением в эти сферы фосфорсодержащих комплексонов, не склонных к биоразложению, таких, например, как гидроксиэтилиден-дифосфоновая кислота (ОЭДФ), наиболее остро встает вопрос о механизмах их действия и последействия на биологические объекты [3 - 5]. Это относится, в том числе, и к рассматриваемому в данной работе влиянию ОЭДФ на структурно-динамическое состояние молекул хлебопекарной дрожжевой культуры 8ассЬаготусе8сегеу181ае - 509 по мере ее культивирования.
Экспериментальная часть
Выращивание дрожжевой массы осуществлялось по стандартной методике методом качалочного культивирования [6].
Полная информация о применяемой аппаратуре и методиках ЯМР эксперимента изложена в работе [7]. Обезвоживание полученной биомассы (удаление малоинформативной относительно свободной влаги) осуществлялось по отработанной для спектроскопических исследований методике [8]. Для обеспечения
статистической достоверности полученных результатов проводилось по 3 серии измерений
Результаты и их обсуждение
На рис.1 представлены данные, характеризующие влияние комплексона на рост дрожжей ЗассИаготусе^'сегеуг^чае (раса 509), из которых видно, что снижение содержания ОЭДФ в питательной среде приводит к нелинейному изменению концентрации биомассы, по форме аналогичному закону затухающих колебаний, со статистически достоверным максимумом прироста биомассы в 18% относительно контрольного уровня. В целом зависимость концентрации биомассы дрожжей
ЗассИаготусе^'сегеуг^чае - 509 носит локально экстремальный (псевдоколебательный) характер с абсолютным максимумом в точке, соответствующей концентрации ОЭДФ 0,01г/л, и относительным максимумом (8% прироста биомассы) при концентрации ОЭДФ 1г/л.
Далее эти и подобные им точки с положительным (по отношению к контролю) приростом биомассы рассматриваются как область стимулирования процесса культивирования микробиологической системы (МБС), а противоположные им по свойствам - как область ингибирования того же процесса. При этом проведенные исследования технологических показателей дрожжей (подъемной силы, маль-тазной и зимазной активностей) показали, что внесение в среду комплексона в стимулирующих концентрациях не влечет за собой ухудшения этих показателей. Для дрожжей ЗассИаготусе^'сегеуг^чае -509 отмечено, что подъемная сила в этом варианте опыта не ниже контрольного уровня. В целом значения остальных технологических показателей стимулированной ОЭДФ дрожжевой культуры нахо-
к §
дятся в пределах, определяемых ГОСТом как «хорошее» качество дрожжей каждого вида.
1 140 т 120 -100 -80 -60 -40 -20 -0 -I—'-1—I—'-1—Ь
§
л
и и я
г
о я ю
Контроль
-4 0,0001
-3 0,001
-2 0,01
-1
0,1
0
1
2,5 + 2
ч И
Ч
+ 1,5 3
и и я
--1 -- 0,5
е в
«О
§
0,3 2
- О Ь8С
Конц. ОЭДФ, г/л
Рис. 1 - Концентрация биомассы Saccharomycescerevisiae - 509 в зависимости от концентрации комплексона
Для определения характера непосредственного влияния ОЭДФ на консорциум микроорганизмов (МКО) в целом и(или) дрожжевые клетки в частности был проведен структурно-динамический анализ дрожжей методом ядерной магнитно-резонансной релаксометрии (ЯМРР). ЯМР релаксометрия представляет собой один из эффективнейших методов неразрушающего контроля и мониторинга структур-
Таблица 1 - Параметры ЯМР-релаксации биомассы ОЭДФ
но-динамического состояния любой молекулярно-динамической системы. Это особенно ценно в случае анализа поведения живых микроорганизмов. Относительные изменения в строении и поведении биомассы или ее отдельных компонентов помогают понять механизмы процессов, влияющих на результативность культивирования. Результаты ЯМРР анализа представлены в таблице 1.
дрожжей, выращенной в присутствии комплексона
Концентрация ОЭДФ, г/л 1** Время поперечной ядерной магнитной релаксации ТУ , мкс Населенности (относительное содержание протонов со значениями Т2=Т/*) р/*, %
Контроль 1 135 38
2 18* 62
0,01 (стимулирование) 1 134 37
2 15* 63
0,001 (ингибирование) 1 85 40
2 19* 60
*- неэкспоненциальный по форме спад свободной индукции (ССИ), из которого Т2 определялось как время падения амплитуды сигнала ССИ в е раз; **- номер структурно-динамической (СД) фазы
Анализируя полученные значения времен релаксации Т2 и населенностей Рi СД фаз, а также принимая во внимание значения магнитно-резонансных параметров (МРП) модельных МБС [9] и природы высокомолекулярных соединений, образующих оболочки дрожжевых клеток, можно провести общий предварительный анализ полученных данных.
Судя по МРП исследованных образцов, наблюдаемая более подвижная фаза, характеризуемая релаксационными параметрами Т21 и Р1, сформирована либо гибкоцепными (макро)молекулами, либо их водными растворами или комплексами, локализованными по обе стороны клеточной стенки. Вторая фаза (Т22,Р2) с наиболее коротким временем релак-
сации, характерным для жесткоцепных полимеров (в том числе - для производных целлюлозы), закономерно связана с поведением твердоподобных высокомолекулярных соединений в составе клеточных стенок (КС).
И здесь следует отметить, что изменения в релаксационных параметрах биомассы, культивировавшейся в присутствии стимулирующей и ингиби-рующей концентраций комплексона, заметно различаются. В частности, образец биомассы, полученной в присутствии оптимальной (стимулирующей) концентрации комплексона, отличается от контрольного пониженным значением времени Т2 , в то время как ингибирующая концентрация добавки приводит
к формированию биомассы с меньшей величиной Т2\ при сохранении значения Т22 близким к контрольному. Отсюда можно предположить, что в случае ингибирования роста биомассы комплексо-ном клеточная оболочка микроорганизма практически не меняется, в то время как активность более подвижной фазы (связанной воды и(или) протоплазмы) по обе стороны от КС заметно падает. При оптимальных концентрациях комплексона наблюдаемые изменения в релаксационных параметрах могут объясняться другими причинами: сохранени-
ем активности протоплазмы (Т2:) на фоне перегруппировки клеточных оболочек в направлении их
г-т 2
уплотнения - о чем свидетельствует падение Т2 .
Поэтому для выявления вклада пространственных факторов в наблюдаемые явления нами были проведены сравнительные исследования влияния ОЭДФ на культуру бактерий ВасШиББиЫШБ 26 Б, клетки которых по линейным размерам отличаются от дрожжевых на порядок [10]. Результаты этих исследований представлены на рис. 2.
140 п
120
£ с; о о.
H X
о ¡2
и о о я s о s ю
100 -
80 -
60 -
40 -
20
-4
0,7 Lgc
-3 -2 -1 0 0,3 0,5 0,6 -о-биомасса З.сегеу1з1ае; -□-биомасса В.зиМШэ
Рис. 2 - Накопление биомассы бактерий БасШж8иЫШ8 (1) и дрожжей Saccharomycescerevisiae (2) в зависимости от концентрации комплексона ОЭДФ
Анализ зависимости уровня накопления биомассы от концентрации комплексона для обеих микробных культур позволяет уточнить наблюдаемые закономерности (рис.2).
Низкие концентрации комплексона не оказывают стимулирующего воздействия на рост исследуемых МКО. Уровень биомассы бактерий Bacillussubtilis мало отличается от контрольного уровня, а в случае дрожжей Saccharomycescerevisiae - 509 происходит ингибирование роста, степень которого обратно пропорциональна концентрации ОЭДФ.
Таким образом, при введении комплексона в питательную среду для дрожжей в диапазоне концентраций от 0,0001 г/л до 1 г/л на фоне постепенного роста биомассы с увеличением концентрации ОЭДФ дважды наблюдается резонансноподобная форма зависимости стимулированного (выше контроля) выхода биомассы. В то же время рост бактериальной культуры стимулируется при внесении ком-плексона в несколько более высоких концентрациях - около 2 г/л и носит острорезонансный характер с последующим значительным ингибированием роста биомассы по мере увеличения дозировки комплек-сона.
Полученные кривые для обеих микробных культур можно представить как экстремальные (моноэкстремальная - у бактерий, периодически экстремальная (колебательная) - у дрожжей). Однако экстремумы этих зависимостей приходятся на различные концентрации комплексона, которые обратно
пропорциональны площадям поверхностей соответствующих клеток (для дрожжей максимальный прирост биомассы наблюдается при внесении комплексона в концентрации 0,01 г/л, в то время как для бактерий наибольшая стимуляция роста наблюдается в присутствии ОЭДФ в концентрации 2 г/л).
Принимая во внимание достаточно крупные размеры молекул хелатирующего агента, можно предположить, что подобная избирательность молекул комплексона обусловлена существенными различиями в пространственных и(или) структурно-динамических характеристиках объектов воздействия. И наиболее вероятно, что первичной мишенью атаки молекул комплексона являются клеточные оболочки.
Известно, что дрожжи относятся к эукариотиче-ским организмам. Они, в отличие от прокариот (к которым принадлежат бактерии), имеют сложноор-ганизованную и многослойную клеточную оболочку. Наружная часть оболочки дрожжевой клетки образована полисахаридами типа гемицеллюлоз, преимущественно маннаном и небольшим количеством хитина. Внутренняя часть сформирована белковыми веществами, фосфолипидами и липоидами. Наружная часть оболочки бактериальной клетки также состоит из полисахаридов, а во внутреннюю часть могут входить белки, липополисахариды и липопротеины [10, 11].
При этом наружные мембраны, как правило, стабилизируются ионами кальция, но могут присут-
ствовать и другие двухвалентные ионы металлов [11]. Комплексон ОЭДФ способен образовывать стойкие комплексы с этими ионами [1 - 5], и, тем самым, менять структуру клеточной оболочки, а, следовательно, и ее проницаемость. Причем эти изменения могут оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие на функционирование клетки. Результатом присутствия комплексона в стимулирующей концентрации может стать интенсификация транспортных процессов в микробных клетках. А более активное питание закономерно приводит к стимуляции роста и увеличению скорости накопления биомассы.
Ингибирование роста микробной культуры малыми концентрациями комплексообразующего агента можно объяснить изменением капиллярно-пористой структуры клеточных мембран [12, 13] и(или) условий протекания через них транспортных потоков, в том числе и по стерическим причинам. Подтверждением тому служат как ранее полученные [14], так и вышеизложенные данные ЯМР-релаксометрии, согласно которым при малых концентрациях комплексона клеточная оболочка остается практически неизменной, в то время как существенно снижается активность подвижной фазы (протоплазмы). Это может свидетельствовать о нарушении транспортных процессов, ухудшении питания клетки, а, следовательно, стать причиной снижения скорости накопления биомассы.
Характерно, что у дрожжей наблюдается два максимума прироста биомассы в присутствии ОЭДФ, причем положение на шкале концентраций одного из них (~1 г/л) практически совпадает с положением максимума для бактериальной культуры (~2 г/л). В то же время низкоконцентрационный максимум (~ 0,01г/л) на два порядка отстоит от общего для обоих видов МКО высококонцентрационного максимума (1 ^ 2 г/л). Это коррелирует с обратно пропорциональной зависимостью площадей поверхностей соответствующих МКО и указывает на возможные особенности механизма функционирования ОЭДФ, обусловленные процессами, протекающими на поверхности клеток, клеточных мембран и(или) стенок, а также в пространстве между ними.
Выводы
Влияние комплексонов на оболочки дрожжевых клеток оказывается неоднозначным: ингибирующая концентрация комплексона вряд ли существенно затрагивает клеточную оболочку как таковую, но подавляет активность протоплазмы. И наоборот, стимулирующие концентрации комплексона (на порядок отстоящие от ингибирующей) оказывают влияние на клеточную оболочку, почти не затрагивая протоплазму.
При этом наличие общего высоконцентрацион-ного максимума прироста биомассы можно считать признаком существования аналогичных (общих) стадий в механизмах воздействия комплексона на дрожжи и бактерии, а наблюдаемый низкоконцентрационный максимум свидетельствует о значи-
тельном вкладе процессов, протекающих на поверхности клеток и(или) в пределах их оболочек, в суммарный механизм культивирования дрожжей в присутствии ОЭДФ.
В результате влияние концентрации комплексона на развитие культуры хлебопекарных дрожжей носит волнообразный (колебательный) характер, обусловленный наличием как минимум двух, предположительно, разномасштабных, механизмов воздействия на МКО суммарный вклад от которых в процесс культивирования меняется нелинейно по мере роста концентрации комплексона. В первом приближении один из них (низкоконцентрационный) является преимущественно поверхностно, адругой -концентрационно зависимым. В результате интенсивности транспортных потоков через клеточную стенку микроорганизма также оказываются непропорциональными росту концентрации комплексона, например, вследствие соответствующего изменения ее проницаемости и(или) условий для транспортировки питательных компонентов, в том числе в результате участия ОЭДФ в сопутствующих этим процессам донорно-акцепторным взаимодействиям и(или) обусловленных ими топологических преобразованиях капиллярно-пористого пространства микробной клетки.
При этом с практической точки зрения важно, что использование оптимальной концентрации ком-плексона ОЭДФ (0,01 г/л) позволяет заметно повысить выход дрожжей Saccharomycescerevisiae - 509 без существенных изменений в их качественных показателях.
Литература
1. Васильев, В.П. Комплексоны и комплексонаты / В.П. Васильев. - М.: Химия, 1996.-325с.
2. Дятлова, Н.М. Комплексоны и комплексонаты металлов / Н.М. Дятлова, В.Я. Темкина, К.И. Попов. - М.: Химия, 1989. - 544с.
3. Хартли, Ф. Равновесие в растворах / Ф. Хартли, К. Бергес, Р. Олкок.- М.: Мир.- 1983.-360 с.
4. Бек, М. Химия равновесных реакций комплексообра-зования / М. Бек.- М.: Мир, 1973.-359с.
5. Матковская, Т.А. Бифосфонаты: свойства, строение и применение в медицине. /Т.А. Матковская, К.И. Попов, Э.А. Юрьева - М.: Химия, 2001, 224с.
6. Культивирование микроорганизмов. / Под ред. Позмо-говой И.Н. // Итоги науки итехники. Сер. Микробиология, т.24, 1991.
7. Суханов, П.П. Изучение структурно-динамического состояния дрожжевого препарата методом ЯМР релак-сометрии. Сообщение 1. Влияние процесса центрифугирования / П.П. Суханов, А.Ю. Крыницкая, Е.В. Пету-хова, П.П. Крыницкий // Вестник Казан. технол. ун-та. -2013. - № 8, с.239-245.
8. Суханов, П.П. Изучение структурно-динамического состояния дрожжевого препарата методом ЯМР релак-сометрии. Сообщение 2. Влияние процесса сушки. / П.П. Суханов, А.Ю. Крыницкая, Е.В. Петухова, П.П. Крыницкий // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2013. - № 8, с.246-251.
9. Суханов, П.П. Изучение структурно-динамического состояния дрожжевогопрепарата методом ЯМР релак-сометрии. Сообщение 4. ЯМР метки для анализамикро-биологических систем / П.П. Суханов, А.Ю. Крыницкая, П.П. Крыницкий, Г.А. Морозов // Вестник Казан. тех-
нол. ун-та. - 2014. - Т. 17. - № 15, с.187-191.
10. Шлегель, Г. Общая микробиология. / Г. Шлегель -М.: Мир, 1987, 567с.
11. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. / Б. Глик, Дж. Пастернак. - М.: Мир, 2002. - 589 с.
12. Суханов, П.П. Капиллярно-поровое пространство (био)полимеров. Сообщение 1. ЯМР релаксация в увлажненных нитратах целлюлозы различного происхождения / П.П. Суханов, Т.В. Игнашина, А.П. Суханов, П.П. Крыницкий // Вестник Казан. технол. ун-та. -2014. - Т. 17. - № 4, с.172-179.
13. Суханов, П. П. Капиллярно-провое пространство
(био)полимеров. Сообщение 2. Структурно-динамический анализ увлажненных нитратов целлюлозы различногопроисхождения / П.П. Суханов, Т.В. Иг-нашина, А.П. Суханов, П.П. Крыницкий // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2014. - Т. 17. - № 11, с.151-157.
14. Суханов, П.П. Изучение структурно-динамического состояния дрожжевогопрепарата методом ЯМР релак-сометрии. Сообщение 3. Массоперенос вовнутреннем пространстве нитратцеллюлозного аналога клеточной стенки / П.П. Суханов, А.Ю. Крыницкая, П.П. Крыницкий, Г.А. Морозов, Е.В. Петухова // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2014. - Т. 17. - № 15, с.155-161.
© П. П. Суханов - д.х.н., проф. каф. процессов и аппаратов химической технологии КНИТУ, [email protected]; А. Ю. Крыницкая - к.б.н., доцент каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, [email protected]; Е. В. Петухова - к.б.н., доцент той же кафедры, [email protected]; М. Н. Мещерякова - к.т.н., доцент той же кафедры, [email protected]; П. П. Крыницкий - магистрант той же кафедры, [email protected].
© P. P. Sukhanov - Dr.Chem.Sci., professor of Processes and apparatuses of chemical technology Dep. of KNRTU, [email protected]; A. Y. Krynitskaya - Dr.Ph, associate Professor of Food biotechnology Dep. of KNRTU, [email protected]; E. V. Petukhova - Dr.Ph, associate Professor of Food biotechnology Dep. of KNRTU, [email protected]; M. N. Mescherjakova- Dr.Ph, associate Professor of Food biotechnology Dep. of KNRTU, [email protected]; P. P. Krynitskiy - magister student of Food biotechnology Dep. of KNRTU, [email protected].
