CC BY
18
УДК 579.222: 543. 422.23
П. П. Суханов, П. П. Крыницкий, А. Ю. Крыницкая, Г. А. Морозов
ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ДИНАМИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ДРОЖЖЕВОГО ПРЕПАРАТА
МЕТОДОМ ЯМР РЕЛАКСОМЕТРИИ. СООБЩЕНИЕ 4. ЯМР МЕТКИ ДЛЯ АНАЛИЗА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ
Ключевые слова: микробиологические системы, ЯМР релаксометрия, молекулярное структурно-динамическое состояние.
Представлены оригинальные и некоторые литературные данные о магнитно-релаксационных параметрах ряда нативных и модельных микробиологических объектов и их компонентов, позволяющие проводить сравнительный анализ молекулярного структурно-динамического состояния микробиологических систем invivo и invitro, в том числе и последствий любого воздействия на изучаемый биообъект.
Keywords: microbiological systems, NMR relaxometry, molecular structural-dynamical state.
Original and some literature data about magnetic relaxation parameters of a number of native and model microbiological objects and their components are presented. It enables to produce comparative analysis of molecular structural-dynamical state of microbiological systems in vivo and in vitro, including the consequences of any impact on the studying biological object.
Введение
Ранее [1 - 3] было показано, что в системе ЯМР координат возможен анализ состава и строения микроорганизмов (МКО), а также их эволюции, включая процессы переноса флюидов в водо-полимерных системах биологического
происхождения. Однако для повышения информативности подобных исследований необходимо опираться на ЯМР шкалу, охватывающую значения магнитно-релаксационных параметров (МРП) по крайней мере основных компонентов микроорганизмов. Настоящее сообщение частично решает эту задачу, одновременно продолжая серию работ по выявлению конкретных возможностей
практического применения импульсных методик ЯМР в биотехнологических исследованиях [1 - 3].
Экспериментальная часть
Эксперименты проводились на серии модельных образцов - как индивидуальных соединений категории х.ч., так и специально приготовленных препаратов. К последним относятся:
- КЖ - культуральная жидкость - водная дисперсия МКО или иных биообъектов, содержащая от 0,3 до 1 мас. % твердого компонента;
- ДП - дрожжевой препарат - водная дисперсия дрожжей (в данном случае - выращенной на мелассе музейной культуры расы хлебопекарных дрожжей 8ассИаготусе8сегеу181ае - 509), содержащая до 3 мас. %% твердого компонента [1];
- паста - осадок, полученный после центрифугирования дрожжевого препарата (в данном случае при частотах вращения п1 = 3000 об/мин или п2 = 6000 об/мин с общим числом оборотов от 15000 до 120000) с последующим удалением надосадочной жидкости (> 90% первоначального объема) [1];
- ДМ - дрожжевая масса (или дрожжи шу1уо) - размороженная, но не обезвоженная, музейная культура дрожжей [1, 4];
- ВД - вакуумированные дрожжи - ДМ, обезвоженная вакууммированием;
- СДМ - сухая дрожжевая масса - ДМ, отцентрифугированная и высушенная по разработанной методике [1, 2];
- СДБ - сухая дрожжевая биомасса - ДМ, высушенная до постоянного веса [2];
- ДС - дрожжевая смесь (или дрожжи шуйго) - образец, полученный путем растирания в ступке ДМ (ДСдм) или СДМ (ДСсдм) совместно с битым стеклом; представляет собой смесь компонентов дрожжевой структуры, как нативных, так и преобразованных в результате механической обработки (растирания);
- КС - клеточная стенка - образец, полученный путем растирания пасты в ступке совместно с битым стеклом (аналогично ДС) и дальнейшего центрифугирования полученной массы и ее сушки до постоянного веса (аналогично СДБ); предположительно содержит наиболее твердофазные (преимущественно высокомолекулярные) компоненты дрожжевой структуры, как нативные, так и преобразованные в результате последовательной механической (растирание и центрифугирование) и тепловой (сушка) обработки.
Результаты проведенных при комнатных температурах (17 ^ 270С) измерений на ядрах водорода на частоте 19 Мгц охватывают интервал концентраций Н2О (в МКО или в модельных препаратах) от близких к нулю до 99,7 мас. %. Полная информация о применяемой аппаратуре и методиках ЯМР эксперимента изложена в работе [1], при этом используются следующие сокращения: КП - метод Карра-Парселла-Мейбума-Джилла, ССИ - спад свободной индукции, БП - метод бегущей последовательности [1].
Результаты и их обсуждение
Метод ЯМР-релаксометрии позволяет оценивать структурно-динамические последствия того или иного воздействия на микроорганизмы и
микробиологические системы (МБС) с их участием. Однако для этого необходимо представление о нормальном молекулярном структурно-
динамическом (МСД) состоянии конкретного микробиологического объекта, которое ту11го складывается из МРП отдельных моно-, олиго- и полимерных компонентов различной природы, а также низкомолекулярных соединений в его составе. Тогда сравнение их МРП с аналогичными параметрами нативного образца (МБС шу1уо)
Таблица 1 - МРП образцов, моделирующих состав
позволяет выявить как различия между данными МБС в состояниях шу1уо и ту11го, так и характер изменений, происходящих в них под тем или иным воздействием. Необходимые данные для первичного структурно-динамического анализа дрожжевых систем содержатся в табл. 1. Они получены в результате собственных измерений МРП соответствующих соединений и(или) композиций на их основе.
систем
№ п/п МРП и методика их измерения Образец Т2 Т1, с БП D • 1010, м2/ c
ССИ, мкс КП, мс
1 ДП [1] 140* 1720 (95) 36 (5) 2,5 24
2 ДП после min. Л центрифугирования 140* 165 (91) 4,2 (9) - -
3 Паста лл - 220 ^ 900 (95 ^ 25) 36 ^ 180 (5 ^75) 1,1± 0,15 15 ^ 25 (0,65) 2 ^ 5 (0,35)
4 Фосфатидилхолин (50% водный раствор лецитина) - 500 (90) 70 (7) 7 (3) - -
5 Лецитин(фосфолипид) 125* [10]
6 ДМ [1] 270* (64) 20*(36) 25 ^ 36** 0,12 11^ 16**
7 ДМ после 4 мес. хранения при +40С 220* (64) 20* (36) 2 (25) 0,48 (75) Примечание. Значения МРП ЯМР фаз записаны сверху вниз в порядке возрастания скоростей (падения времен) релаксации. В скобках даются значения населенностей соот-ветствующих компонент в % (мольные доли протонов в составе протонных фаз относительно общего числа протонов в системе). * - неэкспоненциальный по форме (Гауссоподобный) спад свободной индукции, из которого Т2 определялось как время падения амплитуды сигнала ССИ в е раз; ** - значение зависит от влажности образца; *** - МРП тех же соединений или систем после ручного «сшивания» результатов измерений по двум методикам (ССИ и КП). л - минимальному (min) центрифугированию соответствует 15000 оборотов центрифуги [1]; лл - МРП меняются пропорционально числу оборотов центрифуги [1]. ллл - амилоза - линейный полисахарид (ПС), амилопектин - разветвленный ПС.
2мс (20) *** 0,48мс (44) 20*мкс (36)
8 ВД 2000 (0,12) 40*(0,88)
9 СДМ 88 (8) 40*(13) 20* (79)
10 СДБ 40*
11 ДСвд 60 (37) 20*(63)
12 дссдм 33 (46) 12*(54)
13 дссдм + дополнит. центрифугирование (10') 22
14 КС 20* [1, 2]
15 Манноза 41 (24) 12,5 (76)
16 Глюкоза 24
17 Сахароза 65 (68) 17 (32)
18 Целлюлоза 41 (8) 12* (92)
19 Белок казеиновый 71 (26) 20* (74)
20 Крахмал [амилоза + амилопектин] ллл 150*(70) 20* (30) 5,6 (30) 0,8 (70)
5,6мс (20) *** 0,8мс (50) 20*мкс (30)
Значения параметров, описывающих кинетическую кривую поперечной ядерной магнитной релаксации, качественно определяются двумя типами механизмов переноса ядерной
намагниченности [5]. Условно (по аналогии с
процессами переноса субстанций в химико-
технологических процессах [6]) их можно
обозначить как конвективные (структурно-
ориентированные или твердофазные) и диффузионные (случайно-ориентированные или жидкофазные). Они дают свой вклад в значения всех ЯМР параметров в рамках любых измерительных методик и при любых физических состояниях образцов. Однако параметры, получаемые из ССИ и при измерениях коэффициента диффузии Б особо чувствительны к процессам диффузии. И если в последнем случае это обстоятельство является достоинством соответствующей методики, то МРП жидкофазных систем значительно искажаются диффузией. В то же время измеренные по методике КП значения параметров поперечной релаксации (ТУ, Р2) в тех же образцах меняются незначительно благодаря предусмотренной в рамках этой методики компенсации потерь намагниченности,
обусловленных неупорядоченными микропотоками флюидов. В то же время при незначительной диффузии (в твердоподобных молекулярных системах) ССИ оказывается наиболее точным источником молекулярной структурно-
динамической информации.
С учетом всего вышеизложенного попробуем прокомментировать некоторые данные из таблицы. Здесь наиболее интересна группа образцов с номерами от № 6 до № 14, характеризующая эволюцию магнитно -резонансных параметров (МРП) стандартных дрожжей (дрожжевой массы (ДМ)), а также моделирующих их состав соединений и препаратов, в зависимости от условий наблюдения (хранения) или приготовления. Например, хранение ДМ при температуре ниже комнатной (образцы № 6 и № 7) практически не влияет на состояние твердофазных структур, но при этом закономерно снижается подвижность водосодержащих компонентов, постепенно теряющих влагу в естественных (атмосферных) условиях.
Закономерности стимулированного
обезвоживания нативных (1пу1уо) МКО представлены образцами № 8 - № 10. Образец ВД (№ 8) - это консорциум стандартных (музейных и т. п.) дрожжей, обезвоженных без использования тепловой обработки, образец СДБ (№ 10) -аналогичный консорциум, обезвоженный до постоянного веса, а между ними - образец СДМ (№ 9), отличающийся от двух предыдущих образцов использованием стадии центрифугирования в процессе обезвоживания. При этом Т22(ВД) ~ Т2(СДБ), то есть времена релаксации твердых компонентов в исходных консорциумах МКО, обезвоженных различными по интенсивности способами (с применением и без тепловой обработки), совпадают. Отсюда можно предположить, что соответствующая менее подвижная фаза (Т22 и Р22) относится к содержимому клеток МКО, а фаза с параметрами Т21 и Р21 - это наиболее подвижная молекулярная среда, или локализованная вне микроорганизмов (то есть на их внешней поверхности), или(и) наиболее доступная для использованных методик сушки. Образец № 9 (СДМ) занимает промежуточное положение между образцами № 8 и № 9 по
жесткости внешнего воздействия на исходный МКО. Сравнение их МРП показывает, что обезвоживание с участием центрифуги и в более щадящем (по экспериментальным данным [1, 2]) режиме сушки, чем при получении СДБ, способствует росту структурно-динамического разрешения микробиологического объекта (увеличивается число различимых по строению и(или) подвижности компонент). В этом случае идентифицируется не только наиболее подвижная (водо- и(или) липидосодержащая) МСД-фаза (Т2\ Р21), но и из ранее обобщенной совокупности твердофазных структур (Т22, Р22) выделяется новая более жесткая компонента (Т23, Р23). Ее происхождение раскрывает следующая группа образцов - механические смеси компонентов тех же дрожжевых систем (МКО 1пу11го, образцы № 11 -13) и предполагаемого аналога клеточной стенки (образец № 14). Из их МРП следует, что механическая обработка в пределе приводит не только к насыщению образцов твердофазными компонентами, но и, по-видимому, к преобразованию клеточной стенки и(или) околоклеточного пространства вплоть до разрешения в клеточной структуре наиболее жесткоцепной компоненты целлюлозной природы (образцы № 12 и № 18). А группа модельных соединений (образцы № 5, № 15 - № 20) демонстрируют спектр минимально возможных твердофазных соединений в составе МКО и одновременно подтверждают их возможное наличие в исследуемых дрожжевых массах.
Для сравнения обратимся к некоторым литературным источникам. Например, по данным [7], ССИ дрожжей 8ассИаготусе8сегеушае представляет собой суперпозицию сигналов быстрозатухающей гауссоподобной функции с осцилляцией 8о и длинной (медленно затухающей) экспоненциальной компоненты 8ь:
8© = 8а + 8ь = 8^© + 8^© + 8р^© + 8ьч?©, где 8а = Б^ш© + 8^© + 8р^©,
то есть 80 представляет собой сумму трех гауссоподобных функций, из которых минимум одна - 85оЫ© - функция с осцилляцией, возникающей вследствие того, что частотный ЯМР спектр твердых полисахаридов дает дублет с расстоянием между максимумами около 30 кГц [8]. При этом 8ь = 81опё©, причем эта компонента приписывается низкомолекулярным соединениям (в основном молекулам воды). Кроме того, 8го4© относят к протонам более подвижных (вращающихся) функциональных групп в составе полисахаридов (ПС), а 8рго4© - к вкладу белковых молекул, и предполагается, что 8го4© ~ 85ощ©, «... поскольку количество вращающихся функциональных групп полисахаридов напрямую связано с содержанием их малоподвижной фазы».
Таким образом, по данным [7 - 9], в быстро релаксирующую (начальную) часть ССИ вносят свой вклад сигналы как от углеводов (ПС), так и от белков. Характеристические времена релаксации
предполагаемых компонент (по-видимому, без учета времени парализации приемо-передающего тракта, составляющего 7 мкс [7]):
Т2рго1 ~ 8 - 16 мкс [8] Т&ош ~ 11 - 17 мкс [9] Т2го ~ 50 - 70 мкс [9] Т21опб - не менее нескольких сотен микросекунд [7].
При этом исходят из того, что значения Т2 различных белков и полисахаридов в нативном твердом состоянии не превосходят 20 мкс [7 - 9].
Таким образом, параметры ЯМР различных твердофазных компонентов микробиологических структур в таблице количественно хорошо коррелируют с литературными источниками (хотя окончательная интерпретация и тех, и других допускает различные толкования) и могут служить опорными точками при первичном анализе структурно-динамического состояния
микробиологических систем. Дополнительная информация о МСД состояниях образцов содержится в форме линий ЯМР. Для примера на рисунке представлена эволюцию ССИ одного и того же биообъекта (дрожжевой массы) в различных состояниях.
20 40 60 80 I, мкс
Рис. 1 - Спады свободной индукции модельных дрожжевых смесей (ДС): 1 - ДСВД (образец № 11 в табл. 1), 2 - ДСсдм (№ 12), 3ц - ДСсдм после дополнительного центрифугирования (№ 13)
Таким образом, анализ литературных данных [3, 7 - 10] и МРП модельных образцов в таблице и на рисунке показывает, что две начальные (относительно короткие), (не)экспоненциальные по форме, компоненты наблюдаемых ССИ микроорганизмов с временами поперечной релаксации порядка 20 и 40 мкс, описывают широкий спектр поли-(ПС) и олигосахаридов (ОС), а также белковых (Б) молекул, в структуре как клеточных стенок, так и около- и внутриклеточного пространства (ВКП) дрожжей. Оставшаяся завершающая (наиболее длинная) компонента ССИ характеризует состояние относительно подвижных компонентов МКО олигомерной (фосфолипиды (ФЛ) и т.п.) или низкомолекулярной (вода и т.п.) природы. При этом одни и те же компоненты МКО
1пу1уо и 1пу11го закономерно различаются по своим МСД параметрам, а следовательно, и по взаимной упаковке. Это может быть связано не только с внешним воздействием на МКО (разрушением непрерывного контура КС 1пу11го), но и с характером локализации и функцией молекул воды на поверхности и во внутриклеточном пространстве МКО (особенно 1пу1уо).
На основании имеющихся данных также можно высказать несколько общих соображений. Судя по пропорциональному изменению времен релаксации и формы ССИ при уменьшении влагосодержания в дрожжах (таблица, рисунок), можно предположить, что вода сравнительно равномерно распределена по объему дрожжевой клетки и, в том числе, сорбируется на поверхности ее полимерных компонентов, которые почти все (за исключением гидрофобных фрагментов («хвостов») фосфолипидов) обладают гидрофильными свойствами. Поэтому процессы поперечной ядерной магнитной релаксации во внутриклеточной воде в составе дрожжей способны протекать совместно и аналогично процессам в соответствующих полимерных «носителях» - как это наблюдается, например, в увлажненных нитратах целлюлозы [3]. Отсюда следует, что наблюдаемые экспериментальные параметры поперечной релаксации не содержат независимой информации о структурно-динамическом поведении только связанной воды (чего нельзя априори констатировать для процессов продольной релаксации), и отражают особенности конфигурации и конформации (упаковки) водоконтролируемого (вододоступного)
пространства. Отсюда, сравнивая значения МРП исследуемых и модельных образцов дрожжевых систем, можно по крайней мере на качественном уровне оценить относительные изменения, происходящие в структуре всего биообъекта.
Но предварительно определимся с рабочей структурно-динамической моделью дрожжевой клетки (ДК), которая схематически может быть описана следующими общими соотношениями, основанными на ее морфологии [4]. При дальнейшем анализе будем исходить из того, что наблюдаемая эволюция МРП отражает изменение в составе и(или) упаковке следующих основных компонентов:
ДК = КС + ВКП = ПС + ОС + Б + ФЛ + Н2О
Например, исходя из данных таблицы можно предположить, что образец ДСсдм (№ 12) представляет собой ДК без низкомолекулярных (наиболее подвижных) компонентов, а его ССИ представляет собой суперпозицию сигналов от ПС (12 мкс) и белка (33 мкс - эта величина формируется как усредненное значение Т2 двухкомпонентного ССИ свободного белка (образец № 19)), а ССИ того же модельного образца после дополнительного центрифугирования (№ 13) можно интерпретировать как общий (усредненный) сигнал (а не простую суперпозицию сигналов) молекул
белка и ПС (22 мкс), которые в составе КС (образец № 14) формируют уже неэкспоненциальный сигнал с приблизительно тем же (20* мкс) временем релаксации. Однако различие в форме линии ССИ свидетельствует о более плотной упаковке белково-полисахаридного комплекса в составе клеточной стенки МКО как 1пу1уо (образец № 6), так и шуЦго (образец № 14). При этом в составе белка и ПС в исследованных дрожжевых клетках содержится почти одинаковое количество протонов (в соотношении 46 : 54 - образец № 12).
Таким образом, наблюдаемые по таблице и на рисунке закономерности эволюции МРП модельных дрожжевых систем по мере ужесточения действующих на них внешних факторов в целом хорошо коррелируют с ранее полученными экспериментальными данными для
соответствующих нативных дрожжевых препаратов [1, 2].
Литература
1. Суханов, П.П. Изучение структурно-динамического состояния дрожжевого препарата методом ЯМР релаксометрии. Сообщение 1. Влияние процесса центрифугирования / П.П. Суханов, А.Ю. Крыницкая, Е.В. Петухова, П.П. Крыницкий // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2013. - № 8.- С.239-245.
2. Суханов, П.П. Изучение структурно-динамического состояния дрожжевого препарата методом ЯМР релаксометрии. Сообщение 2. Влияние процесса сушки. / П.П. Суханов, А.Ю. Крыницкая, Е.В.
Петухова, П.П. Крыницкий // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2013. - № 8.- С.245-251.
3. Суханов, П.П. Изучение структурно-динамического состояния дрожжевого препарата методом ЯМР релаксометрии. Сообщение 3. Массоперенос во внутреннем пространстве нитратцеллюлозного аналога клеточной стенки. / П.П. Суханов, А.Ю. Крыницкая, Е.В. Петухова, П.П. Крыницкий // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2013. - В печати.
4. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. / Б. Глик, Дж. Пас-тернак. - М.: Мир, 2002. - 589 с.
5. Фаррар, Т. Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР: пер. с англ. под ред. Э.И. Фе-дина. / Т. Фаррар, Э. Беккер. - М.: Мир, 1973.- 164 с.
6. Разинов, А.И. Явления переноса. - Учебное пособие. / А.И. Разинов, Г.С. Дьяконов. - Казань, изд-во КГТУ, 2002. - 136 с.
7. Грунин, Л.Ю. Экспресс-метод определения белка в дрожжах и дрожжевых продуктах при помощи ЯМР релаксометра / Л.Ю. Грунин, А.В. Канарский, И.Н. Сочкова, З.А. Канарская, Р.А. Ахмадышин // Ж. Завод. лабор. Диагн. матер.- 2008. Т. 74.- № 1.-С.13-15.
8. Крушельницкий, А.Г. Молекулярная динамика белков и полипептидов. Исследование методом релаксационной и обменной ЯМР спектроскопии. / Дис. докт. физ.-мат. наук. - Казань, 2006. - 247 с.
9. Грунин, Л.Ю. Протонная магнитная релаксационная спектроскопия природных полимеров. / Дис. канд. хим. наук. - Йошкар-Ола, 1998. - 129 с.
10. Филиппов, А.В. Латеральная диффузия в липидных мембранах в присутствии холестерина. / А.В. Филиппов, В.Д. Скирда, М.А. Рудакова. - Казань: изд-во КФУ, 2010. - 221 с.
© П. П. Суханов - д-р хим. наук, профессор, КНИТУ, Paulpost3@yandex.ru; П .П. Крыницкий - аспирант, КНИТУ, Pavel211@yandex.ru; А. Ю. Крыницкая - канд. биол. наук, доцент, КНИТУ, Paulalla@yandex.ru; Г. А. Морозов - д-р техн. наук, профессор, КНИТУ, gmorozov@mail.ru; Е. В. Петухова - канд. биол. наук; доцент, КНИТУ, Petel07@yandex.ru.
© P. P. Sukhanov - Doctor of Chemical sciences, professor, KNRTU, Paulpost3@yandex.ru; P. P. Krynitskiy - post graduate student; KNRTU, Pavel211@y andex.ru; A. Y. Krynitskaya - PhD; associate professor, KNRTU, Paulalla@yandex.ru; G. A. Morozov - Doctor of Technical sciences, professor, KNRTU, gmorozov@mail.ru; E. V. Petukhova - PhD. associate professor; KNRTU, Petel07@yandex.ru.
