CC BY
24
Коксин В.П., Мустафин И.Г., Бойчук С.В.*, Цибулькин A.n.** ИЗУЧЕНИЕ CПEКTPA ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ В КУШЬTУPAЛЬHOЙ СРЕДЕ В ПЕРИОД РЕПРОДУКЦИИ NL4-3 0TAMMA ВИЧ-1 (NEF+, NEF-) В ПЕРВИЧНОЙ Ф^-AКTИBИPOBAHHOЙ КУЛЫ’УРЕ ЛИMФAПИTOB ЗДОРОВОГО ДОНОРА ИHФИП:ИPOBAHHOЙ IN VITRO ВИЧ Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями M3 Республики Татарстан, г. Казань, Казанский государственный медицинский университет, г. Казань *
ГОУВПО КазанскаяГМА Росздрава, г. Казань** Нами проведены исследования по изучению спектра вирусных белков продуцируемых в культуральную
среду лимфоцитами периферической крови здорового донора, синхронно инфицированных in vitro штаммами NLA-4 ВИЧ-1 (nef+, nef-).
Известно, что одним из пусковых механизмов репликации ВИЧ-1 является активация клеток, сопровождающаяся активацией клеточных факторов транскрипции, связывающихся с промоторными участками как собственной ДНК, так и длинных концевых повторов (LTR) провируса ВИЧ-1, интегрированного в геном клетки-хозяина. Это в свою очередь приводит к транскрипции вирусной РНК, являющейся начальным этапом активной сборки вирионов в инфицированных клетках. Поэтому лимфоциты периферической крови доноров, серонегатиных по ВИЧ-1, подвергали предварительной активации в течение 72 часов с помощью ФГА (2мкг/ мл). В дальнейшем в культуру преактивированных Лф вносили эквивалентные дозы ВИЧ-1 (MOI= 0.005). Репликацию ВИЧ-1 оценивали по следующим показателями) уровень р248а8 антигена ВИЧ-1, определяемого методом ИФА (EIA р248а8, Coulter) в супернатантах культур лимфоцитов; б) количество ВИЧ-инфицированных клеток, определяемое методом проточной цитометрии с использованием мАТ к р248а8 (Coulter).
Выделенные из плазмы крови здорового донора лимфоциты помещали в среду RPMI, содержащую 10% эмбриональной сыворотки крови крупного рогатого скота и гистамин, и активировали ФГА (4мг/ мл), интерлейкином 2 (10 Ед/мл) в течение 3-х дней , после чего добавляли инфицирующий материал в дозе р248а8 -100 нг/мл. Спектр антигенов ВИЧ в культуральной среде исследовали на 4-й, 9-й и 13й день после инфицирования первичной культуры лимфоцитов ВИЧ, т.к. срок жизни первичной культуры ограничен приблизительно 15-ю днями. Максимальный уровень репликации ВИЧ-1 (nef+) приходился на 6-й день после ифицирования, а ВИЧ-1 ( nef-) на 9 день культивирования. То есть, характер репродукции штаммов идентичен, но скорость репликации штамма nef+ была выше, чем nef-.
Аликвоты культуральной жидкости, взятые через равные промежутки времени (4, 9, 13 дней) осветляли центрифугированием при 3000 об/мин на центрифуге РС-6 в течение 15 минут и в объеме 40 мкл приливали к 80 мкл лизирующей смеси, которая в конечной концетрации содержит 0,125 М трис-НС1 рН 6,8, 5% SDS, 5% b-меркаптоэтанола, 10% глицерина и 0,0012% бромфенолового синего. Перед диск-электрофорезом пробы прогревали в течение 5 минут на кипящей водяной бане. Диск-электрофорез полученного материала проводили в 12,5% ПААГ по классическому методу Лемли (1970). После электрофореза проводили электроперенос фракциони-рованных белков с пластин геля (120х110х1 мм) на мембрану Immobilon-P (“Millipor”). Для расчета молекулярных масс фракций использовали набор маркеров LMW 94-14,4 kD, HMW 212-53 kD (“Pharmacia Biotech”). После блокирования
вакантных мест связывания на мембране с фракционированными пробами мембрану нарезали на стрипы шириной 3 мм для каждой пробы и инкубировали с мышиными моноклональными анти-р2 5. антителами (АТ) (Кардиологический научный центр М3 РФ) и контрольной положительной сывороткой для ВИЧ , содержащей антитела ко всем структурным белкам ВИЧ (“Bio-Rad”). При постановке иммунноблотинга использовали антивидовые конъюгаты с щелочной фосфотазой к человеческим ((R5 “Bio-Rad”) и мышинным иммуноглобулинам (“BD Biosciences”); хромоген для щелочной фосфотазы R6 (“Bio-Rad”).
Качественный состав вирусных белков используемых штаммов ВИЧ-1 (nef+, nef-) в культуральной среде был идентичен и отличался большей концентрацией в случае штамма ВИЧ-1 nef+.
Результаты иммуноблотинга по детекции белков ВИЧ в культуральной среде в процессе репродукции вируса в первичной культуре лимфоцитов с контрольной положительной по ВИЧ сывороткой (“BioRad”) показали, что на четвертый день выявлялась двойная фракция с мМ 58-55 кД предшественника структурных белков кора ВИЧ. На девятый день инкубирования отмечалось дополнительное появление на иммуноблотграмме структурных белков кора ВИЧ - р24/25, р18, где основной серодоминантной фракцией являлся р55 (47,8% относительной серологической активности в иммуноблоте). К 13-му дню инкубации инфицированных лимфоцитов в культуральной среде уже отмечалось наличие 4-х белков гена gag ВИЧ, дополнительно за счет второго предшественника структурных белков кора ВИЧ: р 55, р40, р24/25, р18. Главной серодоминантной фракцией в иммунноблотинге был основной структурный белок кора ВИЧ р24/25 (35,2%). Отмечалось увеличение числа сероактивных фракций, которые, по-видимому, являются продуктами клеточного катаболизма отмерших клеток, имеющих перекрестно реагирующие в иммуноблотинге эпитопы: 166кД, 137кД, 93 кД, 36 кД, 30 кД.
Постановка иммуноблотинга с мышиными моноклональными антителами к р24/25, реагирующими в серологических реакциях со всеми основными белками гена gag показало сходный характер наличия белков гена gag в культуральной среде Так, на 4-й день инкубации инфицированных ВИЧ лимфоцитов в культуральной среде иммуноблотингом выявляется предшественник (р55) структурных белков кора ВИЧ в виде тройной фракции с мМ 58-55 кД. На 9й день дополнительно выявлялись второй предшественник структурных белков кора ВИЧ р40 и основной структурный белок кора р24/25. К 13 -му дню в культуральной среде дополнительно детектировался структурный белок кора ВИЧ р 18. Основной серодоминантной фракцией как и в первом случае
являлся полипептид р24/25 (38,29%).
Таким образом, результатами экспериментов по инфицированию первичной культуры нормальных лимфоцитов ВИЧ in vitro показано, что в течение 13 дней репродукции вируса отмечается наличие в культуральной среде как неструктурных, так и структурных белков гена gag ВИЧ, спектр и количественное содержание которых меняется во времени, что,по-видимому, обусловлено накоплением в культуральной среде протеолитических ферментов, расщепляющих белки-предшественники до структурных белков кора ВИЧ. Результаты исследований подтверждаются ранее полученными данными по изучению формирования гуморального иммунного ответа организма на ВИЧ-инфекцию (Рязанова Г.А. и др. 2005 ), где имела место дифференциальная регуляция иммунного ответа хозяина вирусом. Вначале развития ВИЧ-инфекции общий пул анти-ВИЧ АТ представляют антитела к предшественнику структурных белков гена gag р55 и основному структурному белку р25, а далее, при нарастании титра общих анти-ВИЧ АТ в ИФА появляются антитела к гликопротеинам ВИЧ (gp160, gp120) и белкам гена pol соответственно.
Поступление клеточных протеаз в культуральную среду может быть связано с гибелью и лизисом неинфицированных лимфоцитов, несущих активационный маркер CD4+ в результате апоптоза, начинающегося к 6 часам после инфицирования ВИЧ первичной культуры лимфацитов согласно данным проточной цитофлюорометрии. по определению митохондриального потенциала, экспрессии фосфадилсерина, фрагментации ДНК клеток на техже экспериментальных моделях, которые свидетельствовали о массовой гибели неинфицированных клеток по механизму апоптоза как в случае ВИЧ-1 nef+, так и ВИЧ-1 nef- Однако, в условиях in vitro в первичной культуре лимфоцитов не представляется возможным изучение более длительных сроков развития инфекции, что связано с естественной гибелью лимфоцитов.
На основании данных проточной цитофлюорометрии и результатов по наличию антигенемии в культуральной среде инфицированной первичной культуры ФГА-активированных лимфоцитов можно предположить, что белки гена gag ВИЧ-1, появляющиеся первыми в культуральной жидкости инфицированной первичной культуры лимфоцитов, могут быть факторами, запускающими механизмы апоптоза неинфицированных лимфоцитов, что может являться частью стратегии вируса в борьбе с иммунной системой хозяина посредством “вирусного эндотоксина”, продуцируемого инфицированными ВИЧ лимфоцитами.
