CC BY
72
медицинсшяи^унолошя^ Оригинальные статьи
© 2004, СПб РО РААКИ
РОЛЬ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИВИЧ-1 БЕЛКА Л/ЕНЗ ПАТОГЕНЕЗЕ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ: НОВЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ-1
Бойчук С.В., Мустафин И.Г.
Казанский государственный медицинский университет, Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и ИЗ М3 РТ, Россия
Резюме. Эндотелиальные клетки (ЭК) обладают способностью активировать С04+лимфоциты и индуцировать репликацию ВИЧ-1 в Т-лимфоцитах памяти (CD4+CD45RO+), но не наивных Т-лимфоцитах (CD4+ CD45RA+). Этот факт обусловлен антиген-презентирующей способностью ЭК и наличием ВИЧ-1 белка Nef.
Ключевые слова: эндотелиальные клетки, лимфоциты, антиген-презентирующие клетки ВИЧ -1, Nef, репликация. Boychuk S.V., Mustafin I.G.
THE ROLE OF ENDOTHELIAL CELLS AND HIV-1 NEF PROTEIN
IN PATHOGENESIS OF HIV-INFECTION: NEW MECHANISMS OF HIV-1 REPLICATION Abstract. Vascular endothelial cells (VECs) are capable to activate CD4+ T-lymphocytes thereby promoting HIV-1 replication in memory T-cells (CD4+CD45RO+), but not naive (CD4+CD45RA+) T-cells. This ability is closely related with antigen-presentating capacities of VECs and HIV-1 Nef protein. (Med. Immunol., 2004, vol.6, JV? 6, pp 499-506)
Введение
Установлено, что одним из пусковых механизмов репликации ВИЧ-1 является активация клеток, сопровождающаяся активацией клеточных факторов транскрипции (в частности, NF-k(3), связывающихся с промоторными участками как собственной ДНК, так и длинных концевых noBTopoB(LTR) провируса ВИЧ-1, интегрированного в геном клетки-хозяина. Это, в свою очередь, приводит к транскрипции вирусной РНК, являющейся начальным этапом активной сборки вирионов в инфицированных клетках.
Установлено, что пусковыми механизмами активации СБ4+-лимфоцитов (Лф), являющихся основными мишенями для ВИЧ-1, являются их взаимодействия с профессиональными антигенпрезентиру-ющими клетками (АПК), локализующимися, в основном, в лимфоидной ткани. Данный факт, являющийся убедительно доказанным и неоспоримым, тем не менее, не объясняет механизмов репликации ВИЧ-1 и выраженности виремии на стадиях про-
Адрес для переписки:
Бойчук Сергей Васильевич 420012, Казань, Бутлерова, 49, Казанский государственный медицинский университет, кафедра патофизиологии. Тел.: (8432)36-05-63, факс (8432)36-03-93. E-mail: boichuksergei@mail.ru
грессирования заболевания и развития СПИДа, сопровождающихся, как известно, деструктивными изменениями герминтативных центров лимфоидных органов.
В связи с этим, было высказано предположение о возможности активации Лф и индукции репликации ВИЧ-1 за пределами лимфоидной ткани, а именно, непосредственно в кровеносном русле. Предполагалось, что эндотелиальные клетки (ЭК) сосудов, известные как полупрофессиональные АПК [27, 29] и способные вызывать активацию Лф [20, 22], могут индуцировать репликацию ВИЧ-1. Учитывая низкий уровень виремии на протяжении длительного периода времени (даже в отсутствии проводимой антиретровирусной терапии) у группы пациентов, инфицированных ВИЧ-1, имеющим делецию генаМг/ПЗ, 14,17,19], также представляло интерес изучение роли данного белка ВИЧ-1 в механизмах вирусной репликации, индуцированной ЭК.
Материалы и методы
Плазмиды и клеточные линии. В качестве источника ВИЧ-1 использовали штамм NL4-3(NIH AIDS Research & Reference Reagents Program, USA), геном которого был представлен в виде 2 плазмид (р83-2 и р83-10), содержащих соответственно 5’- и 3’- после-
довательности генома ВИЧ-1 [2]. Плазмида р83-10, содержавшая делецию по гену nef, была любезно предоставлена д-ром Л. Александером (Yale University, USA). Плазмидную ДНК последовательно обрабатывали эндонуклеазой EcoR 1 и лигазой Т4 (New England Biolabs) и клонировали с использованием клеточной линии Ultracompetent-X10-Gold (Stratagene). Плазмидную ДНК выделяли с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Трансфекцию рекомбинантных плазмид в клеточную линию СЕМх174 (NIH AIDS Research& Reference Reagents Program, USA) осуществляли с использованием DEAE-декстрана (Sigma). Клетки CEMxl74 культивировали в среде RPMI 1640 (GIBCO BRL) общепринятым способом, супернатанты аликвотировали и хранили при -70°С. Титр ВИЧ-1 в супернатантах определяли методом ИФА (EIA р248"s Coulter). Полученный штамм ВИЧ-1 использовали для инфицирования Лф периферической крови доноров, серонегативных по ВИЧ-1. Лф, выделенные центрифугированием на градиенте плотности Ficoll-Hypaque (Pharmacia), инкубировали в течение 3 дней в полной среде RPMI 1640 с добавлением ФГА (GIBCO BRL) (4jxg/ml) и IL-2 (Sigma) (lOU/мл) с последующим внесением ВИЧ-1 (р24дак-100 ng/мл), полученного в результате трансфекции вирусного генома в СЕМх174. В ряде случаев проводили инфицирование неактивированных Лф с последующим внесением в культуру ФГА. Супернатанты аликвотировали, титр вируса определяли методом ИФА (EIA p24gaK, Coulter) и хранили при -70°С. Определение инфекционной активности ВИЧ-1 проводили с использованием клеточных линий HeLa/CD4-P-gal и MAGI-CCR-5 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA).
Выделение и культивирование клеток. Эндотелиальные клетки (ЭК) выделяли из вены пуповины с использованием коллагеназы IV типа (Sigma) с последующим культивированием в покрытых желатином пластиковых планшетах (Falcon) в среде 199 (Sigma) с добавлением 20% ФБС (GIBCO), 2,5 тМ L-глутамина (Sigma), гепарина (Sigma) и фактора роста эндотелиальных клеток (BD). В ряде экспериментов ЭК фиксировали в течение 10 мин 1% раствором параформальдегида с последующим 5-кратным отмыванием с помощью ФСБ.
Мононуклеары периферической крови (МНПК) выделяли из периферической крови центрифугированием на градиенте плотности Ficoll-Hypaque (Pharmacia). С04+-Лф выделяли из МНПК методом иммуномагнитной селекции (Dynal). Т-клетки памяти (CD45RCT) и наивные Т-клетки (CD45RA+) выделяли методом позитивной иммуномагнитной селекции с использованием соответствующих мАТ. Чистоту популяций Лф (84-94%) определяли методом непрямой иммунофлюоресценции на проточном цитометре FACSCalibur (BD).
Культивирование ЭК с CD4*-JI<$. Для индукции экспрессии молекул МНС II класса, ЭК инкубировали в течение 3-4 дней с IFNy (1000U/ml) (Bio-Source) в 24-луночных плоскодонных пластиковых планшетах (Linbro). В лунки, содержащие ЭК (1х105), вносили Лф(1х106) в 1 мл среды RPMI1640 с добавлением 10% ФБС, L-глутамина и антибиотиков (GIBCO BRL). В это же время в культуру ЭК/Лф вносили эквивалентные дозы ВИЧ-1. Через 12 часов осуществляли полную замену среды RPMI 1640 с целью удаления не связавшегося ВИЧ-1. Клетки культивировали в течение 15 дней при 37°С и 5% С02. Замену половины среды RPMI 1640 осуществляли каждые 3 дня. Супернатанты клеточных культур хранили при -70°С. Определение уровня секреции IL-2, а также уровня репликации вируса ВИЧ-1 осуществляли методом ИФА с использованием соответствующих тест-систем (R&D Systems и Coulter, соответственно). Количество ВИЧ-инфи-цированных клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием p24gag мАТ (Coulter).
В ряде случаев культивирование Лф с ЭК осуществляли в присутствии анти-С02 mAT(TS2/ 18)(American Type Culture Collection (ATCC), USA), анти-С058 mAT(AICD58, Immiunotech), анти-ICAM-l mAT(MCA532, Serotec), анти-HLA-DR (L243)(ATCC) или изотопических (IgGl), не связывающихся мАТ (НВ64 или К16/16)(АТСС). В отдельных экспериментах осуществляли культивирование Лф, разделенных от ЭК посредством полупроницаемой мембраны (0.2(xm)(Nunc Life Technologies).
Результаты
Репликация ВИЧ-1 в CD4*-Лф:роль белка Nef
и ЭК. Для изучения роли Nef белка в процессах репликации ВИЧ-1 были проведены эксперименты с использованием штамма NL4-3 (Nef+) и его рекомбинантного производного, содержащего делецию гена nef (Nef-).
Уровень репликации Nef+ и Nef- в культуре ФГА-активированных Лф периферической крови был при-
nef+ nef-~|
Рис.1. Репликация ВИЧ-1 (nef+; nef-) вФГА-активированных лимфоцитах
мерно одинаковым, однако скорость репликации Ые£+ была выше по сравнению с Ые£- (рис. 1). Аналогичная динамика репликации и отсутствие различий в уровне репликации Nef+ и №£- наблюдались также при инфицировании клеток линии СЕМх174.
В то же время, при внесении (на 5-й день) ФГА в культуру предварительно инфицированных Лф уровни репликации и Ые£- существенно различались (рис. 2). В неактивированных Лф репликация ВИЧ-1 методом ИФА не регистрировалась.
Культивирование СБ4+-Лф в присутствии ЭК способствовало репликации ВИЧ-1. Пик репликации №?+ регистрировался на 12 сутки культивирования клеток. Уровень репликации вируса ВИЧ-1 с фенотипом был в 100 раз выше по сравнению с его производным - Иеі- и в ряде экспериментов уровень репликации Кеґ- не превышал фоновых значений (табл. 1). Уровень репликации ВИЧ-1 коррелировал с количеством р24*а8-позитивных Лф в культурах ЭК/СБ4+-Лф, инфицированных №1+ и №1-. Культивирование двух типов клеток по отдельности не индуцировало репликацию ВИЧ-1 (табл. 1). Важно отметить, что в культуру ЭК вносили неактивированные СБ4+-Лф, о чем свидетельствовал анализ экспрессии активационных маркеров (НЬА-БІІ, С069, С025), определяемых после выделения клеток.
Было выявлено, что основным источником репликации в ЭК/СБ4+-Лф являются Т-клетки памяти (СБ45КО+). Уровень репликации Ке£- в
160 140 120
I 100
3 80
гд
II 60 40 20
0
Nef+ ( IFN) Nef-(IFN) * Nef+(TNF) Nef-(TNF)
Nef+ (СИТА) —Nef- (CIITA) h Nef+ — Nef-
Рис.З Влияние IFN, TNF и СИТА трансфекции на репликацию ВИЧ-1 (nef+, net-)
Табл.1. ВЛИЯНИЕ ЭК НА УРОВЕНЬ РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ-1 (NEF+; NEF-) В СМ+ЛФ
Показатель p24 нг/мл на различных сроках культивирования
1 день 3 дня 6 дней 9 дней 12 дней 15 дней
CD4+ (nef-) 0 0 0 0 0 0
CD4+ (nef+) 0 1,3+0,11 1,1 ±0,12 1,6±0,19 1,3±0,21 0
ЭК (nef+) 0 0 0 0 0 0
ЭК (nef-) 0 0 0 0 0 0
3K/CD4+(nef+) 0 5,1 ±0,47 15,2±1,4 70,4± 2,6 120,8± 9,6 90,2± 3,5
3K/CD4+(nef-) 0 0 0 2,0± 0,21 2,3±0,19 1 ±0,12
0 3 6 9 12 15
Дни культивирования
культуре ЭК/С04511А+-Лф был минимальным и достигал своего пика лишь на 15 сутки культивирования. Различий в репликации №1- между СВ451Ю+ и С04511А+ - популяциями не было выявлено.
Аналогичные закономерность и динамика репликации Ые?+ и №1- в культуре ЭК/С04+-Лф наблюдалась как для штамма N1,4-3, полученного в результате трансфекции генома ВИЧ-1 в СЕМх174 клетки, так и для этого же штамма вируса, продуцентами которого были ФГА-активированные Лф серонегативных доноров.
Дни культивирования
| ♦11 nef+ ♦.nef- 1
Рис.2. Репликация ВИЧ-1 (nef+; nef-) в лимфоцитах, активированных ФГА на 5-е сутки после инфицирования
Роль молекул МНС II класса в репликации
ВИЧ-1. Выраженная репликация ВИЧ-1 (120-150 p24gag ng/ml) наблюдалась только в случае культивирования С04*-Лф с ЭК, преактивированных с помощью IFNy. Преинкубация ЭК с TNFa оказывала значительно меньший эффект. В то же время, уровень репликации ВИЧ-1 в С04+-Лф, культивированных с неактивированными ЭК составил лишь 5-15 ng/ml на аналогичных сроках их совместной инкубации (рис. 3).
Анализ экспрессии поверхностных маркеров IFNY-активированных ЭК выявил существенное повышение уровня экспрессии молекул МНС II класса, а также молекул адгезии (например, ICAM-
1) по сравнению с неактивированными ЭК. Влияния TNFa на уровень экспрессии молекул МНС II класса на поверхности ЭК отмечено не было.
Трансфекция CIITA (class II trans activator) последовательностей в ЭК индуцировала экспрессию только молекул МНС молекул II класса на их поверхности. Инкубация СБ4+-Лф с данными ЭК индуцировала репликацию ВИЧ-1, сопоставимую по своим значениям с репликацией ВИЧ-1 в СЭ4+-Лф, культивированных с IFNy-активированными ЭК (рис. 3). Воздействие IFNy на ЭК, подвергшихся предварительной CIITA-трансфекции, не приводило к дальнейшему увеличению экспрессии молекул МНС II класса. Уровень репликации ВИЧ-1 в CD4+-Лф, культивированных с ЭК, подвергнутых «двойному» воздействию, также не превышал таковых значений в супернатантах С04+-Лф, культивиро-
ванных с 1Р^, активированными ЭК. Блокада молекул МНС II класса с помощью мАТ приводила к существенному снижению уровня репликации ВИЧ-1 в культуре ЭК/СБ4+-Лф (рис. 4).
Роль межклеточных взаимодействий в репликации ВИЧ-1. Внесение в культуру ЭК/С04+-Лф мАТ, блокирующих С058/ЬРА-3, С02/иА-2 взаимодействия индуцировала снижение репликации Максимальный блокирующий эффект, сопоставимый с эффектом анти-НЬА-ВИ мАТ, был отмечен при блокаде ЬРА-З молекул (рис. 4). Внесение анти-С028 мАТ в культуру ЭК/СБ4+-Лф повышало уровень репликации Nef+ (р<0.001), но не изменяло его динамику. Уровень репликации №1- в присутствии анти-СВ28 мАТ также повышался, но был ниже уровня репликации №£+ во всех экспериментальных условиях (даже в условиях отсутствия костимуляции, индуцированной анти-С028 мАТ) (Р<0,001).
Культивирование С04+-Лф, разделенных от ЭК полупроницаемой мембраной, приводило к значительному снижению уровня репликации ВИЧ-1, пик которой наблюдался лишь на 15 сутки культивирования.
Культивирование С04+-Лф с предварительно фиксированными параформальдегидом ЭК также индуцировало снижение репликации ВИЧ-1. Тем не менее, уровень репликации в этом случае был существенно выше по сравнению с экспериментами с «раздельным» культивированием клеток.
Активация СВ4*-Лф и репликация ВИЧ-1. Было показано, что репликация ВИЧ-1 в культуре
с;
5
те
<м
а
■ Nef+ —
Nef-(anti-HLA-DR) -Ж-
• Nef+ (anti-CD28) —©-
• Nef- (anti-CD2)
• Nef-
■ Nef+ (anti-LFA-3)
■ Nef- (anti-CD28)
■ Nef+(anti-HLA-DR) •Nef- (anti-LFA-3) •Nef+ (anti-CD2)
Рис.4. Влияние межклеточных взаимодействий на репликацию ВИЧ-1 (nef+, nef-)
ЭК/С04+-Лф, сопровождается активацией Лф, о чем свидетельствовало повышение уровня секреции IL-2. Пик секреции IL-2 регистрировался на 3 сутки культивирования. Снижение уровня репликации ВИЧ-1, наблюдавшееся в результате нарушения межклеточных контактов (использование блокирующих мАТ, «раздельное» культивирование ЭК и СБ4+-Лф) также коррелировало со снижением уровня IL-2 в супернатантах тестируемых образцов.
Тем не менее, следует отметить высокий уровень секреции IL-2 в культурах ЭК/СБ4+-Лф, инфицированных вирусом ВИЧ-1 с фенотипом Nef-. Более того, уровень секреции IL-2 в неинфицированных культурах ЭК/СБ4+-Лф не отличался от уровня секреции IL-2 в культурах ЭК/С04+-Лф, инфицированных Nef+ и Nef-.
Обсуждение
Экспериментальной моделью, использованной для изучения механизмов репликации ВИЧ-1, явилось культивирование IFNy-преактивированных аллогенных ЭК с СБ4+Лф. Выбор данной модели был обусловлен следующими факторами.
1)1Р^-опосредованная активация ЭК индуцирует экспрессию молекул МНС II класса. Кроме того, резонным является предположение о том, что аллогенные молекулы МНС II класса моделируют сигналы, воспринимаемые in vivo при распознавании чужеродного пептида в комплексе с собственными молекулами МНС II класса, что объясняет активацию СБ4+Лф и СЭ8+Лф с помощью аллогенных ЭК [9, 11, 26, 28]. Следовательно, культивирование аллогенных клеток позволяет моделировать in vitro ситуацию, происходящую in vivo, и, более того, устраняет необходимость предварительной антигенной нагрузки АПК для их последующего использования in vitro. Кроме того, является очевидным, что количество клеток, распознающих аллогенные молекулы МНС II класса, а также вероятность их восприятия значительно выше по сравнению с распознаванием чужеродного пептида, встроенного в собственные молекулы МНС II класса.
2) Повышенный уровень IFNy в периферической крови и лимфоидных тканях у ВИЧ-инфицированных пациентов [5, 8, 12], что является свидетельством высокой вероятности контакта инфицированных СЭ4+Лф с HLA-DR" ЭК.
3) Наличие различных оппортунистических инфекций при ВИЧ-инфекции способствует экспрессии фрагментов чужеродных пептидов на ЭК и других типах АПК, что также подтверждает высокую вероятность активации инфицированных СБ4+Лф с помощью ЭК.
4) На стадиях прогрессирования ВИЧ-инфекции и развитии СПИДа регистрируется существенное повышение концентрации ВИЧ-1 в крови, именуе-
мое как вирусная нагрузка. В то же время, предпосылки для активации инфицированных СБ4+Лф с помощью профессиональных АПК отсутствуют (см. введение). В связи с этим, было высказано предположение, что репликация ВИЧ-1 на стадиях прогрессирования заболевания может являться следствием активации Лф за пределами лимфоидной ткани, а именно, в периферической крови [4].
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о репликации ВИЧ-1 в культуре ЭК/ С04+ Лф. Фактором, определяющим репликацию ВИЧ-1, в данном случае, является присутствие в культуре ЭК, так как культивирование СЭ4+ Лф без ЭК не приводит к репликации ВИЧ-1. Вопрос о возможности инфицирования и репликации ВИЧ-1 в ЭК остается до настоящего времени открытым. Ряду исследователей удалось обнаружить вирусную мРНК и провирусную ДНК в различных типах ЭК и клеточных линиях на начальных сроках после их инфицирования. Тем не менее, при дальнейшем культивировании ЭК, наличие в них вирусной ДНК, а также продукцию ВИЧ-1 выявить не удалось [30]. Механизм инфицирования ЭК окончательно не выяснен. Предполагается, что несмотря на отсутствие С04 рецептора, ВИЧ-инфицирование ЭК возможно через СХС114 и СС115, экспрессирующиеся на некоторых разновидностях ЭК [13]. Таким образом, в настоящее время существует мнение о том, что ЭК могут являться резервуаром, но не источником репликации ВИЧ-1 [1, 6]. Негативные результаты по детекции р248а®в супернатантах ЭК, культивированных без СБ4+ Лф (см. результаты исследования), подтверждают данную точку зрения. Все вышеизложенное свидетельствует о том, что источником репликации ВИЧ-1 в данной экспериментальной модели являлись только СЭ4+Лф.
Было установлено, что ЭК способны индуцировать репликацию вируса ВИЧ-1 только в Т-клетках памяти (СБ45КО+), но не в наивных (С04511А+) Т-Лф. Этот факт коррелирует с данными об ЭК-опос-редованной пролиферации исключительно Т-клеток памяти [21].
Известно, что одним из факторов, необходимых для репликации ВИЧ-1 в Лф, является их активация. Этот факт подтверждается репликацией ВИЧ-1 только в ФГА-стимулированных СЭ4+-Лф (см. рис.1 и 2). Учитывая тот факт, что в культуру ЭК вносили неактивированные СБ4+Лф, логично предположить, что пусковым моментом для репликации ВИЧ-1 в культуре ЭК/С04+-Лф являлась ЭК-опос-редованная активация СБ4+-Лф.
Известно как минимум 2 пути межклеточных взаимодействий, посредством которых ЭК способны активировать СБ4+-Лф. Первый - обусловлен лиганд-рецепторными взаимодействиями. Второй -связан с продукцией ЭК и последующей секрецией растворимых факторов (например, цитокинов).
При культивировании ЭК с СБ4+-Лф, разделенными друг от друга полупроницаемой мембраной (исключающей возможность их контактного взаимодействия), уровень репликации вируса ВИЧ-1 на 9 и 12 сутки не превышал пороговых значений, и имел тенденцию к незначительному росту лишь на 15 сутки культивирования. В то же время, культивирование СБ4+-Лф с фиксированными ЭК (исключающее секрецию растворимых факторов) индуцировало репликацию ВИЧ-1. Тем не менее, следует отметить, что уровень репликации был ниже по сравнению с контролем (эксперименты с «нефиксированными» ЭК).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в репликации ВИЧ-1 ведущая роль отводится лиганд-рецепторным взаимодействиям между ЭК и СБ4+-Лф.
Базируясь на представлениях об ЭК, как о полупрофессиональных АПК, было выдвинуто предположение о том, что репликация вируса ВИЧ-1 в культуре ЭК/СЭ4+-Лф может быть обусловлена их антиген-презентирующей способностью. Основанием для этого предположения также явились существенные различия в репликации ВИЧ-1 в культурах СВ4+-Лф, культивированных с 1РКу-активиро-ванными ЭК (НЬА-Б11+) и неактивированными ЭК (НЬА-ВИ) (см. рис.З).
Установлено, что блокада молекул, участвующих в презентации антигена и проведении костимули-рующих сигналов приводит к снижению репликации ВИЧ-1 в культуре ЭК/С04+-Лф (см. рис.4), что коррелирует с уровнем активации С04+-Лф, определяемому по уровню секреции 1Ь-2 и экспрессии активационных маркеров. Максимальный ингибирующий эффект был отмечен при блокаде молекул МНС II класса. Также было выявлено, что дополнительная стимуляция СБ4+-Лф с помощью анти-С028 мАТ приводит к повышению репликации ВИЧ-1 в культуре ЭК/СБ4+-Лф.
Известно, что помимо индукции экспрессии молекул МНС II класса на поверхности ЭК, 1БКу способен вызывать усиление экспрессии ряда других молекул, например, молекул адгезии - 1САМ-1 [10], УСАМ-1 [23], участвующих в межклеточных взаимодействиях и способных, тем самым, повлиять на репликацию ВИЧ-1 в культуре ЭК/С04+-Лф.
Для выяснения роли вышеуказанных молекул в репликации ВИЧ-1 была проведена серия экспериментов с использованием ЭК, подвергнутых предварительной трансфекции СИТА последовательностей, индуцировавшей экспрессию только молекул МНС II класса. Сравнительный анализ уровня репликации ВИЧ-1 в культуре ЭК/С04+-Лф с использованием ЭК(СПТА+)и ЭК0™'1^ не выявил между ними существенных различий. Этот факт также свидетельствовал о ведущей роли антиген-презентирую-щей функции ЭК в репликации ВИЧ-1.
Известно, что при отпочковывании из инфицированных клеток вновь образующихся вирионов, в их мембрану встраивается ряд молекул, экспрессирующихся на мембране клеток хозяина. Данный процесс носит избирательный характер и не зависит от концентрации этих молекул на поверхности инфицированных клеток [3]. Роль этого феномена до конца не изучена, хотя высказывается предположение о том, что активное встраивание определенных молекул является компонентом, способствующим усилению инфекционной активности ВИЧ-1 [7].
Следовательно, снижение уровня репликации ВИЧ-1 в культуре ЭК/СБ4+-Лф в присутствии блокирующих мАТ могло быть обусловлено как нарушением межклеточных взаимодействий, связанных с антиген-презентирующей способностью ЭК, так и снижением инфекционной способности ВИЧ-1.
Для определения ведущего механизма, обуславливающего снижение репликации вируса ВИЧ-1 в нашей экспериментальной модели, были проведены эксперименты на клеточных линиях HeLa-CD4-LTR-(3-gal и MAGI-CCR-5, являющиеся эталоном для оценки инфекционной активности вируса ВИЧ-
1 в специфическом тесте именуемым как «singleround infectivity assay» [16].
Было установлено, что внесение ВИЧ-1 в культуру этих клеточных линий в присутствии блокирующих мАТ не приводило к снижению числа инфицированных клеток. Следовательно, снижение репликации вируса ВИЧ-1 в культуре ЭК/СБ4+-Лф в присутствии блокирующих мАТ, не связано со снижением инфекционной активности ВИЧ-1, а является следствием угнетения межклеточных взаимодействий данных типов клеток.
Известно, что межклеточные взаимодействия между ЭК и С04+-Лф носят двусторонний характер. СБ4+-Лф, активированные с помощью ЭК, могут, в свою очередь, индуцировать активацию ЭК [25, 31]. Возможно это является предпосылкой для дополнительной стимуляции Лф активированными ЭК.
Для определения очередности событий, индуцирующих репликацию ВИЧ-1 в нашей экспериментальной модели, были проведены эксперименты по культивированию инфицированных СБ4+-Лф с предварительно фиксированными ЭК. Данный экспериментальный подход позволял исключить: а) активацию ЭК под влиянием активированных Лф; б) влияние растворимых факторов, продуцируемых ЭК. Таким образом, уровень репликации вируса ВИЧ-1 в данной экспериментальной модели зависел исключительно от лиганд-рецепторных взаимодействий, носящих, кроме того, однонаправленный характер (ЭК—>СБ4+-Лф).
Было показано, что уровень репликации ВИЧ-1 в экспериментах с фиксированными ЭК был суще-
ственно ниже по сравнению с контролем (нефиксированные ЭК/СБ4+-Лф). Тем не менее, репликация ВИЧ-1 имела аналогичную динамику, достигая пика на 12 сутки культивирования. Следовательно, межклеточные взаимодействия, индуцирующие репликацию ВИЧ-1 в культуре ЭК/С04+-Лф, носят двусторонний характер, что подразумевает дополнительную стимуляцию С04+-Лф со стороны активированных ЭК после первичного взаимодействия последних с С04+-Лф.
Важно подчеркнуть, что во всех экспериментальных подходах, использованных в настоящем исследовании, способность ЭК индуцировать репликацию ВИЧ-1 в CD4+ Лф наблюдалась только в случае инфицирования культуры ВИЧ-1, не содержавшим делецию гена nef (Nef+). Уровень репликации ВИЧ-1, имевшим делецию гена nef (Nef-), во всех случаях культивирования ЭК с CD4+ Лф был крайне незначительным и в ряде случаев находился вне порога чувствительности тест-систем. В то же время, уровень репликации Nef+ и Nef- в предварительно ФГА- активированных Лф практически не отличался, хотя и имелись небольшие различия в скорости репликации Nef+ и Nef- (см. рис.1).
Таким образом, нами установлена возможность индукции репликации ВИЧ-1 в С04+-Лф за пределами лимфоидной ткани, а именно, в периферической крови. Индукторами репликации ВИЧ-1 являются ЭК, активирующие СБ4+-Лф как полупрофессиональные АПК. В свою очередь, белок Nef является фактором, критичным для выявленной нами активности ЭК. Следует предположить, что данный белок ВИЧ-1 обладает способностью изменять порог чувствительности клеток к активационным сигналам, исходящим со стороны АПК, индуцируя, тем самым, репликацию ВИЧ-1. Это также подтверждается результатами исследований с предварительным инфицированием Лф и их последующей активацией (см. рис.2). В то же время, следует отметить, что определение уровня секретируемого IL-2 является недостаточно информативным критерием, отражающим активацию CD4+ Лф.
Список литературы
1. Abbate I., F. Dianzani, F. Bianchi, G. Mosiello, F. Carletti, D. Fiumara, M.R. Capobianchi. RANTES stimulates cell-mediated transmission of HIV-1 infection //J Interfer. Cytokine Res. - 1999. - Vol. 19. - P. 345-350.
2. Adachi, A., H. E. Gendelman, S. Koenig, T. Folks, R. Willey, A. Rabson, M. A. Martin. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone // J Virol. -1986. - Vol. 59- P. 284-291.
3. Arthur L.O., Bess R.P., Sowder R.C., Benveniste R.E., Mann D.L., Chermann J.C., Henderson L.E. Cel-
lular proteins bound to immunodeficiency viruses: implications for pathogenesis and vaccines // Science. -1992.-Vol. 258- P. 7941-7945.
4. Boichuk S., Choi J., Walker J, Pober J., Alexander L. Vascular endothelial cells (VECs) form the surface of blood vessels therefore are in frequent contacts with HIV-infected T-cells. The Abstr. of Cold Spring Harbor Conference “Retroviruses”, New-York, 2003, p. 38-39.
5. Boyle, M. J., M. F. Berger, M. Tschuchnigg, J. E. Valentine, B. G. Kennedy, M. Divjak, D. A. Cooper, J. J. Turner, R. Penny, W. A. Sewell Increased expression of interferon-gamma in hyperplastic lymph nodes from HIV-infected patients // Clin Exp Immunol. - 1993.-Vol. 92. P.- 100-105.
6. Bussolino F., Mitola S., Serini G., Barillari G., Ensoli B. Interactions between endothelial cells and HIV-1. //J. Biochem. Cell Biol. - 2001.- Vol. 33. - P. 371-390.
7. Cantin, R., J. F. Fortin, G. Lamontagne, M. Tremblay The presence of host-derived HLA-DR1 on human immunodeficiency virus type 1 increases viral infectivity //J Virol. - 1997,- Vol. 71- P. 1922-1930.
8. Cohen, O. J., A. Kinter, A. S. Fauci Host factors in the pathogenesis of HIV disease // Immunol Rev.
1997,-Vol. 159. - P.31-48.
9. DeBruyene L.A., Ensley R.D., Olsen S.L., Taylor D.O., Carpenter B.M., Holland C., Swanson S., Jones K.W., Karwande S.V., Renlund D.G. Increased frequency of alloantigen-reactive helper T lymphocytes is associated with human cardiac allograft rejection. // Transplantation - 1993.- Vol. 56 - P. 722-727.
10. Dianzani F., O. Scheglovitova, M. Gentile, V. Scanio, C. Barresi, B. Ficociello, F. Bianchi, D. Fiumara, M.R. Capobianchi. Interferon-gamma stimulated cell-mediated transmission of HIV type 1 from abortively infected endothelial cells. // Clin. Immunol. -1996.-Vol. 12-P. 621-627.
11. Epperson D. E., J.S. Pober. Antigen-presenting function of human endothelial cells: direct activation of resting CD8+ T cells. // J.Immunol. - 1994. - Vol. 153.-P. 5402-5410.
12. Fauci, A. S. Host factors and the pathogenesis of HIV-induced disease // Nature. - 1996.- Vol. 384. -P. 529-534.
13. Gupta S.K., P.G. Lysko, K. Pillarisatti, E. Ohl-stein, J.M.Stadel. Chemokine receptors in human endothelial cells. Functional expression of CXCR4 and its transcriptional regulation by inflammatiry cytokines. //J Biol Chem. - 1998,- Vol. 273- P. 4282-4287.
14. Huang Y., Zhang L., Ho DD. Characterization of nef sequences in a long-term survivors of human immunodeficiency virus type linfection //I. Virol.- 1995. - Vol. 69. - P. 93-100.
15. Kestler, H. W., D. J. Ringler, K. Mori, D. L. Pan-icali, P. K. Sehgal, M. D. Daniel, R. C. Desrosiers Im-
portance of the nef gene for maintenance of high virus loads and for development of AIDS. // 1991. - Vol. 65,- P. 651-662.
16. Kimpton, J., M. Emerman Detection of replica-tion-competent and pseudotyped human immunodeficiency virus with a sensitive cell line on the basis of activation of an integrated beta-galactosidase gene // J Virol. 1992,- Vol. 66- P. 2232-2239.
17. Kirchhoff, F., T. C. Greenough, D. B. Brettler, J. L. Sullivan, R. C. Desrosiers Brief report: absence of intact nef sequences in a long-term survivor with nonprogressive HIV-1 infection //N EnglJ Med.- 1995.-Vol. 332. - P. 228-232.
18. Lafon M.E, J.L. Gendrault, C. Royer, D. Jaeck, A.Kirn, A.V. Steffan. Human endothelial cells isolated from hepatic sinusoids and umbilical vein display a different permissiveness for HIV-1.// Res Virol.- 1993.-Vol. 144- P. 99-104.
19. Learmont, J. C., A. F. Geczy, J. Mills, L. J. Ashton, C. H. Raynes-Greenow, R. J. Garsia, W. B. Dyer, L. McIntyre, R. B. Oelrichs, D. I. Rhodes, N.J. Deacon, J. S. Sullivan Immunologic and virologic status after 14 to 18 years of infection with an attenuated strain of HIV-1. // A report from the Sydney Blood Bank Cohort - 1999,- N Engl J Med. -Vol. 340. P.1715-1722.
20. Ma W., J. S. Pober. Human endothelial cells effectively co-stimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells // J Immunol.-
1998.-Vol. 161-P. 2158-67.
21. Marelli-Berg, F. M., R. E. Hargreaves, P. Carmichael, A. Dorling, G. Lombardi, R. I. Lechler. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells //J Exp Med.- 1996,- Vol. 183- P. 1603-1612.
22. Mestas J., Hughes C. Endothelial cell costimulation of T cell activation through CD58-CD2 interactions involves lipid raft aggregation // J Immunol. -Vol. 167. - P. 4378-4385.
23. Mirakami S., Morioka T., Nakagawa Y„ Suzuki Y., Arakawa M., Oite T. Expression of adhesion mole-
cules by cultured human glomerular endothelial cells in response to cytokines: comparison to human umbilical vein and dermal microvascular endothelial cells // Microvasc Res. - 2001. - Vol. 62(3). P. 383-391.
24. Molino М., M.J. Woolkalis, N. Prevost, D. Prati-co, E.S. Barnathan, G. Taraboletti, B.S. Haggarty, J. Hesselgesser, R. Horuk, J.A. Hoxie, L.F. Brass. CXCR4 on human endothelial cells can serve as both a mediator of biological responses and as a receptor for HIV-2 // Biochim Biophys Acta. 2000 - Vol. 1500- P. 227-240.
25. Monaco C., Andreakos E., Yuong S., Feldmann М., Paleolog E. T cell-mediated signaling to vascular endothelium: induction of cytokines< chemokined and tissue factor.//J Leukoc Biol.- 2002- Vol. 71(4)- P. 659-668.
26. Murray A.G., Libby P., Pober J.S. Human vascular smooth muscle cells poorly со-stimulate and actively inhibit allogeneic CD4+ T cell proliferation in vitro //J Immunol. - 1995- Vol. 154- P. 151-161.
27. Pober J. S. Immunobiology of human vascular endothelium // Immunol Res. - 1999,- Vol. 19- P. 225-232.
28. Pober J.S., Ma W., Biedermann B., Libby P. Vascular cells have limited capacities to activate and differentiate T-cells: implications fro transplant vascular sclerosis //Transplant Immunology - 1997- Vol. 5. -P. 251-254.
29. Rose M.L. Endothelial cells as antigen-present -ing cells: role in human transplant rejection // Cell Mol. Life Sci. - 1998 - P. 965-978.
30. Scheglovitova O., M.R. Capobianchi, G. An-tonelli, D. Guanmu, F. Dianzani. CD4-positive lymphoid cells rescue HIV-1 replication from abortively infected human primary endothelial cells. // Arch. Vi-rol.- 1993. - Vol. 132,- P. 267-280.
31. Yarwood H., J.C. Mason, D. Mahiouz, K. Sugars, D.O. Haskard. Resting and activated T cells induce expression of E-selectin and VCAM-1 by vascular endothelial cells through a contact-dependent but CD40 ligand-independent mechanism // J. Leukoc Biol.-2000. - Vol. 68- P. 233-242.
поступила в редакцию 27.09.2004 отправлена на доработку 30.09.2004 принята к печати 02.10.2004
