CC BY
26
УДК 616.98:578.828HIV:576.367
M.V.Makarova
DIFFERENT SENSITIVITY OF PRODUCTIVELY HIV-1 INFECTED AND UNINFECTED CELLS TO APOPTOSIS
Republican Center on prevention and struggle against AIDS and infectious diseases
of Ministry of Health of Republic Tatarstan, Kazan
ABSTRACT
Susceptibility to apoptosis of CD4+-lymphocytes, producing HIV-1 and uninfected CD4+-lymphocytes, was investigated. An estimation of apoptosis of lymphocytes was carried out by flowing cytometry method through decrease of mitochondrial potential, phosphatidyl serine expression and DNA fragmentation. In PHA-activated lymphocytes culture the quantity of cells in apoptosis between productively infected and uninfected lymphocytes did not essentially differ from each other.
Key words: apoptosis, CD4+-lymphocytes populations, HIV-1, mitochondrial potential, phosphatidyl serine, DNA fragmentation.
М.В. Макарова
РАЗЛИЧНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПРОДУКТИВНО ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИЧ-1 И НЕ ИНФИЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК К АПОПТОЗУ
Республиканский Центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями
министерства здравоохранения Республики Татарстан, Казань
РЕЗЮМЕ
Проведено комплексное изучение восприимчивости к апоптозу СD4+-лимфоцитов (Лф), продуцирующих ВИЧ-1, и неинфицированных СD4+-Лф. Апоптоз Лф оценивали методом проточной цитометрии по снижению величины митохондриального потенциала, экспрессии фосфатидилсерина и фрагментации ДНК. В культуре ФГА-активированных Лф количество апоптозных клеток среди продуктивно инфицированных и неинфицированных Лф существенно не отличалось друг от друга.
Ключевые слова: апоптоз, популяции СD4+-Лф, ВИЧ-1, митохондриальный потенциал, экспрессия фосфатидилсерина, фрагментация ДНК.
ВВЕДЕНИЕ
Несмотря на то, что нарушения в регуляции апоп-тоза лимфоцитов (Лф) при ВИЧ-инфекции являются в настоящее время убедительно доказанными, механизмы апоптоза различных популяций СБ4+-Лф (продуктивно инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных) остаются до сих пор дискуссионными. С одной стороны, логичными выглядят результаты исследований, иллюстрирующих ослабление программы апоптоза в инфицированных ВИЧ-1 СБ4+-Лф и клеточных линиях, что, в свою очередь, является необходимым фактором, обеспечивающим создание предпосылок для репликации вируса и резервуаров ВИЧ-1 [3; 5]. С другой стороны, имеются многочисленные данные об
усилении гибели СD4+-Лф и клеточных линий, инфицированных ВИЧ-1 [6-8]. Данное противоречие может быть лишь отчасти объяснено различиями в лабораторных штаммах, использованных для инфицирования Лф in vitro [9]. В то же время анализ активности различных структурных, регуляторных и вспомогательных белков ВИЧ-1 доказывает правомочность существования 2, противоположных друг другу, точек зрения.
В связи с вышеизложенным представляло интерес комплексное изучение восприимчивости к апоптозу СD4+-Лф, продуцирующих ВИЧ-1 (далее именуемых как клетки-продуценты ВИЧ-1), и неинфицированных CD4+^.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве источника ВИЧ-1 использовали штамм NL4-3 (NIH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA) [2]. Титры ВИЧ-1 определяли традиционным методом лимитирующих разведений по Reed-Muench, инфекционную способность ВИЧ-1 оценивали с использованием индикаторных линий HeLa-CD4-Pgal и MAGI-CCR5 (NiH AIDS Research&Reference Reagents Program, USA). Для инфицирования были выбраны несколько экспериментальных моделей:
а) культура Лф, предварительно активированных ФГА;
б) клеточные линии CEMx174 и СЕМ-GFP;
в) Лф, активированные интерлейкином-7 (ИЛ-7).
Лф периферической крови доноров, серонегативных
по ВИЧ-1, выделяли на градиенте плотности Фиколл-Пака и подвергали предварительной активации в течение 48-72 ч с помощью ФГА (2 мкг/мл) или в присутствии ИЛ-7. В дальнейшем в культуру преактивированных Лф вносили эквивалентные дозы ВИЧ-1 (M01=0,005). В контрольной серии экспериментов использовали неактивированные Лф. Количество клеток-продуцентов ВИЧ-1 определяли методом проточной цитометрии по внутриклеточному содержанию в них корового белка ВИЧ-1 р24вав. С этой целью клетки преинкубировали с моноклональными антителами к р24вав (Coulter). Аналогичная методика инфицирования и подсчета количества инфицированных клеток была использована при внесении ВИЧ-1 в культуру клеточной линии CEMx174. Подсчет количества продуктивно инфицированных клеток в линии СЕМ-GFP был основан на изменении интенсивности GFP, также определяемой методом проточной цитометрии.
Во всех случаях репликацию ВИЧ-1 оценивали по содержанию р24вав антигена ВИЧ-1 в супернатантах клеточных культур (EIA р24вав, Coulter).
Апоптоз Лф оценивали методом проточной цитометрии по следующим параметрам: снижение величины митохондриального потенциала (A^m), экспрессии фосфатидилсерина (ФС) и фрагментации ДНК. Для этого использовались соответствующие флюоро-хромы:
1) A^m- CMX-Ros (Molecular Probes) и DiOC6(3)(Sigma);
2) ФС - MC540 (Sigma) и Annexin V (PharMingen);
3) фрагментация ДНК - PI и 7-ADD (Sigma).
Для оценки апоптоза продуктивно инфицированных неинфицированных клеточных популяций проводили многоцветное окрашивание с использованием вышеуказанных флюорохромов и моноклональных АТ к р24вав антигену ВИЧ-1 (Coulter).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Внесение ВИЧ-1 в культуру покоящихся Лф (т.е. предварительно не активированных с помощью ФГА) не приводило к вирусной репликации, в то время, как инфицирование вирусом ФГА-преактивированных Лф инициировало данный процесс. Пик вирусной репли-
500
450 т
350 /
300 / \
250 / \
200 / \
150 У \
100 \
50 \
1 2 3 4 5 6
Рис. 1. Репликация ВИЧ-1, оцениваемая по содержанию корового белка ВИЧ-1 ^24^) в супернатантах неактивированных (штрих) и ФГА-активированных (сплошная линия) СD4+-Лф:
По оси абсцисс - продолжительность культивирования клеток (дни);
по оси ординат - содержание антигена р24gag в нг/мл.
кации в культуре ФГА-активированных Лф наблюдался на 4-5-е сут после внесения вируса в культуру Лф (рис. 1).
Внесение ВИЧ-1 в культуру СЕМх174 и СЕМ-GFP инициировало репликацию ВИЧ-1, пик которой наблюдался на 4-е и 6-е сут культивирования соответственно. Преинкубация покоящихся (т.е. не экспрессирующих маркеры активации) Лф с ИЛ-7 и последующее внесение ВИЧ-1 в культуру Лф инициировало в них вирусную репликацию, пик которой регистрировался на 7-е сут культивирования. Следует подчеркнуть, что уровень репликации ВИЧ-1 во всех экспериментальных моделях коррелировал с количеством продуктивно инфицированных клеток.
Изучение уровня апоптоза среди продуктивно инфицированных и неинфицированных клеток выявило следующие закономерности. В культуре ФГА-активированных Лф количество апоптозных клеток среди продуктивно инфицированных и не-инфицированных Лф существенно не отличалось друг от друга. Отсутствие различий было подтверждено при оценке всех использованных в настоящем исследовании маркеров апоптоза: снижению величины митохондриального потенциала, появлению молекул фосфатидилсерина на клеточной поверхности и фрагментации ДНК.
Изучение динамики событий, происходящих в СБ4+-Лф, гибнущих по механизму апоптоза, показало, что снижение величины митохондриального потенциала является самым ранним признаком их программированной клеточной гибели. За этим следовало повышение уровня экспрессии молекул фосфатидилсерина, регистрировавшееся исключительно на популяции клеток со сниженной величиной митохондриального потенциала (рис. 2). Конечным признаком апоптоза СБ4+-Лф являлась фрагментация их ДНК. Подобная закономерность прослеживалась как на неинфицированной популяции
Рис .2. Экспрессия фосфатидилсерина на поверхности СD4+-Лф, определяемая по интенсивности флюоресценции МС540, и величина митохондриального потенциала, определяемая по интенсивности флюоресценции DiOCб(3)
клеток, так и на популяции клеток, являвшихся продуцентами ВИЧ-1. Дискриминация данных популяций основывалась на внутриклеточном определении уровня р24ва® антигена ВИЧ-1.
Важно подчеркнуть, что подавляющее количество клеток, являющихся продуцентами ВИЧ-1, в культуре ФГА-активированных Лф было представлено пролиферирующими клетками. Исследование экспрессии активационных маркеров в культуре ФГА-
активированных Лф показало, что пул клеток-продуцентов ВИЧ-1 был представлен преимущественно активированной популяцией клеток, экспресси-
Рис. 3. Экспрессия СD25 на поверхности продуктивно инфицированных (р24gag -позитивных) и неинфицированных (р24gag -негативных) Лф в культуре ФГА-активированных Лф:
По оси абсцисс - интенсивность флюоресценции мАТ к СБ25, конъюгированных с FITC;
по оси ординат - интенсивность флюоресценции мАТ к p24gag конъюгированных с РЕ.
рующей различные маркеры активации (например, СБ25) (рис. 3). Аналогичная закономерность была выявлена и при исследовании других активационных маркеров (СБ69, 71, БЯ).
Такая же закономерность, иллюстрировавшая одинаковую подверженность к гибели по механизму апоптоза, была выявлена при подсчете количества апоптозных клеток среди инфицированных и неинфи-цированных клеток линий СEM-GFP и СЕМх174. Данная закономерность была наиболее выраженной на пике вирусной репликации, оцениваемой по количеству корового белка ВИЧ-1 р24вав в супернатантах клеточных культур.
В то же время внесение ВИЧ-1 в культуру ИЛ-7-активированных Лф существенным образом отличалось от выявленной ранее закономерности. Было показано, что преактивация Лф данным цитокином способствует развитию резистентности к апоптозу у продуктивно инфицированных клеток (по сравнению с неинфицированной популяцией клеток) (рис. 4). Кроме того, было обнаружено, что продуктивно инфицированные Лф, культивированные в присутствии ИЛ-7, были представлены гетерогенным пулом клеток. В отличие от всех ранее использованных нами экспериментальных моделей в культуре ИЛ-7-активированных Лф пул клеток-продуцентов ВИЧ-1 был представлен в основном минимально активированными и непролиферирующими клетками.
Таким образом, изучение механизмов апоптоза продуктивно инфицированных и неинфицированных клеток с использованием различных моделей подтверждает противоречивость ранее полученных и опубликованных результатов исследований, посвященных сравнительному анализу восприимчивости к апоптозу инфицированных и неинфицированных популяций СБ4+-Лф.
Рис. 4. Апоптоз Лф, оцениваемый по экспрессии фосфатидилсерина (Аппехіп У-РІТС - верхние квадраты в режиме ^і-ріоі), у продуктивно инфицированных Лф (р248а8-позитивных: правые квадраты в режиме ^і-ріоі) и неинфицированных Лф (р248а8 -негативных: левые квадраты в режиме ^^рШ)
Важно отметить, что результаты исследований, получаемых с использованием модели ФГА-активированных Лф, а также клеточных линий, не являются точным прототипом механизмов вирусной репликации, происходящей in vivo. Действительно, уровень активации и пролиферации в культуре ФГА-активированных клеток чрезвычайно высок, а клеточные линии имеют изначально высокий пролиферативный потенциал (один из необходимых критериев, предъявляемых к клеточным линиям). В то же время количество пролиферирующих клеток in vivo, а также уровень экспрессии на их поверхности активационных маркеров (особенно у продуктивно инфицированных Лф) существенно ниже.
В то же время использованная нами модель активации Лф с помощью ИЛ-7 наиболее реально отражает ситуацию in vivo, при которой подавляющее число CD4+-Лф, которые могут быть потенциально инфицированы ВИЧ-1, представлено пулом неактивированных клеток. Литературные данные, иллюстрирующие способность ИЛ-7 индуцировать репликацию ВИЧ-1 в Лф, а также статус продуктивно инфицированных Лф являются до настоящего времени предметом дискуссий [1; 4; 10-12].
Выявленный феномен репликации ВИЧ-1 в покоящихся CD4+-Лф под влиянием ИЛ-7 и развития их последующей резистентности к апоптозу открывает несколько новых механизмов патогенеза ВИЧ-инфекции, принципиально отличающихся от существовавших ранее. Во-первых, отсутствие признаков активации и пролиферации указывает на возможность существования принципиально новых механизмов репликации ВИЧ-1 в Лф под действием ИЛ-7. Во-вторых, ИЛ-7 может вызывать минимальную активацию Лф, не сопровождающуюся появлением ее классических признаков, но в то же время достаточную для репликации ВИЧ-1. Аналогичная возможность индукции репликации ВИЧ-1 в Лф без существенных изменений их активационного и пролиферативного статусов была ранее нами показана на модели культивирования Лф с эндотелиальными клетками (ЭК), являющимися, как известно, полупрофессиональными антиген-
презентирующими клетками [13]. Слабый активационный сигнал вследствие отсутствия экспрессии ко-стимулирующих молекул на поверхности ЭК тем не менее являлся достаточным для инициирования процессов вирусной репликации в инфицированных клетках. В-третьих, чувствительность Лф к апоптозу может быть обусловлена именно особенностями их активационного статуса (так как известно, что активированные клетки более чувствительны к гибели по механизму апоптоза по сравнению с неактивированными).
ВЫВОДЫ
1. Клетки-продуценты ВИЧ-1 в культурах ФГА- и ИЛ-7-активированных лимфоцитов, а также клеточных линий обладают различной чувствительностью к апоптозу.
2. Только ИЛ-7 способствует развитию устойчивости к программированной клеточной гибели
у продуктивно инфицированных, но не у неин-фицированных Лф.
3. Пул клеток-продуцентов ВИЧ-1 в культуре Лф, культивированных в присутствии ИЛ-7, представлен минимально активированными и непролиферирующими клетками, что может являться прототипом ситуации in vivo.
4. Устойчивость к апоптозу у клеток-продуцентов ВИЧ-1, культивированных в присутствии ИЛ-7, обусловлена особенностями их активационного статуса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бойчук С.В., Мустафин И.Г. Новые аспекты репликации ВИЧ-1: роль эндотелиальных клеток и ВИЧ-1 белка Nef // Медицинская Иммунология. -2004. - № 6. - C. 499-506.
2. Antoni B., Sabbatini P., Rabson A., White E. Inhibition of apoptosis in human immunodeficiency virus-infected cells enhances virus production and facilitates persistent
3. Adachi A., Gendelman H.E., Koenig S. et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone // J Virol. -1986. - 59. - P. 284-91.infection // J. Virol. -1995. - 69. - P. 2384-92.
4. Bahbouhi B., Landay A., Al-Harthi L. Dynamics of cytokine expression in HIV productively infected primary CD4+ T cells // Blood. - 2004. - 103. - P. 4581-7.
5. Herbein G., van Lint, Lovett J., Verdin E. Distinct mechanisms trigger apoptosis in human immunode-feciency virus type 1-infected and uninfected bystander T lymphocytes // J. Virol. - 1998. - 72. - P. 660-70
6. Jaleco S., Kinet S., Hassan J. et al. IL-7 and CD4+ T-cell proliferation // Blood. - 2002. - 100(13). - P. 4676-7.
7. Pett S.L., Kelleher A.D. Cytokine therapies in HIV-1 infection: present and future // Expert Rev Anti Infect Ther. - 2003. - 1(1). - P. 83-96.
8. Rapaport E., Casella C., Ikle D. et al. Mapping of HIV-1 determinants of apoptosis in infected T cells // Virology. - 1998. - 252. - P. 407-17.
9. Scripture-Adams D.D., Brooks D.G., Korin Y.D., Zack JA. Interleukin-7 induces expression of latent human immunodeficiency virus type 1 with minimal effects on T-cell phenotype // J Virol. - 2002. - 76(24). - P. 13077-82.
10. Smithgall M.D., Wong J.G., Critchett K.E., Haf-far O.K. IL-7 up-regulates HIV-1 replication in naturally infected peripheral blood mononuclear cells // J Immunol. - 1996. - 156(6). - P. 2324-30.
11. Steffens C.M., Managlia E., Landay A., Al-Harthi L. Interluikin-7-treated naive T-cells can be productively infected by T-cell adapted and primary isolates of human immunodeficiency virus 1 // Blood. - 2001. - 99(9). - P. 3310-8.
12. Unutmaz D., KewalRamani V.N., Marmon S., Littman D.R. Cytokine signals are sufficient for HIV-1 infection of resting human T lymphocytes // J Exp Med. -1999. - 189(11). - P. 1735-46.
Поступила 02.08.2007.
