CC BY
6ИЗУЧЕНИЕ СОВРЕМЕННЫМ IN SILICO МЕТОДОМ УСИЛЕНИЯ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ 3,5-ДИНИТРОБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ ПРИ
КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИИ 1Авазбек Ибрагимов, 2Жамшид Ашуров, 3Алишер Ешимбетов
1,2,зИнститут биоорганической химии Академии наук РУз https://doi.org/10.5281/zenodo.8367862
Аннотация. В современной медицине и фармацевтике, в частности микробиологии, всё больше используются методы компьютерного моделирования, особенно in silico подходы (молекулярный докинг) для определения биологического действия активных фармацевтических ингредиентов (АФИ). Биологическая активность малоактивных АФИ может быть усилена с помощью получения их молекулярных и метал комплексов. Для демонстрации возможности этих двух подходов нами синтезированы 4 комплекса на основе 3,5-динитробензойной кислоты (органическая соль и 3 метал комплекса), прояляющей слабую антимикробную активность. Строение этих соединений определена методом рентгеноструктуурного анализа, которые необходимы для дальнейших in silico расчётов. Результаты исследования показали, что действительно антибактериальные активности (относительно E. coli) полученных соединений существенно усиливаются в синтезированных комплексах, причём биоактивность становится заметно больше по сравнению с таковой стандартного антибиотика цифпрофлоксацина.
Ключевые слова: 3,5-динитробензойная кислота, антимикробная активность, молекуляр-ное и кристаллическое строение, молекулярный докинг.
Abstract. In modern medicine and pharmacy, in particular microbiology, computer modeling methods, especially in silico approaches (molecular docking) to determine the biological action of active pharmaceutical ingredients (API) are widely used. The biological activity of low-active APIs can be enhanced by obtaining their molecular and metal complexes. To demonstrate the possibility of these two approaches, we synthesized 4 complexes (organic salt and 3 metal complexes) based on 3,5-dinitrobenzoic acid with weak antimicrobial activity. The structures of these compounds have been determined by X-ray crystallography, which are necessary for further in silico calculations. The results of the study showed that the antibacterial activity (relative to E. coli) of the obtained compounds is significantly enhanced in the synthesized complexes. Interestingly, that the bioactivity becomes noticeably greater compared to that of the standard antibiotic ciprofloxacin.
Key words: 3,5-dinitrobenzoic acid, antimicrobial activity, molecular and crystal structure, molecular docking.
Аннотация. Замонавий тиббиёт ва фармацевтикада, хусусан микробиологияда, компютер моделлаштириш усуллари, айницса in silico ёндашувлари (молекуляр docking) фаол фармацевтик ингредиентларнинг (ФФИ) биологик таъсирини аницлаш учун тобора купроц ишлатилмоцда. Фаоллиги кам ФФИларнинг биологик таъсирини уларнинг молекуляр ва металл комплексларини олиш орцали ошириш мумкин. Ушбу икки ёндашувнинг имкониятларини намойиш етиш учун биз микробларга царши заиф фаолликка эга булган 4-динитробензой кислотаси асосида 3 та комплексни (органик туз ва 3 та металл комплекс) синтез цилдик. Ушбу бирикмаларнинг кейинги in silico уисоб-китоблари учун зарур булган тузилиши рентген структура та^лили ёрдамида аницланди. Тадцицот натижалари шуни курсатдики, олинган бирикмаларнинг антибактериал фаоллиги (Е. coli га нисбатан)
1825
синтезланган комплексларда сезиларли даражада ошади. Кизицарли жщати шундаки, биофаоллик щтто стандарт антибиотик ципрофлоксациндагига нисбатан сезиларли даражада юцори булади.
Калит сузлар: 3.5-динитробензой кислотаси, микробларга царши фаоллик, молекуляр ва кристал тузилиш, молекуляр докинг.
1. Введение.
Моно пара-нитробензойная кислота проявляет очень низкую противомикробную активность в отношении бактерий и дрожжей. Её минимальная ингибирующая концентрация (МИК) по отношению к E. coli составляет 2 ммоль/л [1,2]. При внесении второй нитрогруппу в молекулу 3,5-динитробензойной кислоты (ДНБК) биологическая активность становится ещё меньше и МИК увеличивается до 3 ммоль/л в отношении той же бактерии [2].
Для оптимизации биофармацевтических свойств активных фармацевтических ингредиентов (АФИ) используют разнообразные современные подходы [3, 4]. Среди них особый интерес представляют неорганическая координация и солеобразование, которые можно рассматривать как частные случаи комплексообразования. Для реализации данной методики необходимо выбрать комплексообразующий агент, но он должен относиться к основаниям и проявлять тот же тип биологической активности. Кроме того, комплексообразователь должен координировать ионы металлов, т.е. служить вспомогательным лигандом. Моноэтаноламин (МЭА) является именно таким соединением с умеренной антимикробной активностью [5,6] и сильной хелатирующей способностью [7,8].
В последнее время исследователи для определения биоактивности АФИ всё часто применяют современные методы компьютерного моделирования вместо традиционного биохимическими подхода установления биологического действия препаратов. Для выяснения возможности данного метода нами были синтезированы 4 соединения на основе ДНБК - органическая соль ДНБК с МЭА, биядерный медный комплекс ДНБК, смешанно-лигандные метал комплексы ДНБК с участием МЭА и ЭДА (этилендиамина). В настоящей работе мы демонстрируем с помощью in silico подхода возможность усиления антимикробной активности АФИ на примере комплексов ДНБК.
2. Экспериментальная часть.
Для синтеза органической соли 0,212 г ДНБК (1 ммоль) был растворён в 4 мл этаноле и при постоянном перемешивании добавляли 62 мкл (1 ммоль) МЭА. Раствор оставляли для медленного выпаривания при температуре 30°C. Бесцветный кристаллический продукт в форме органической соли образовался после 6 дней. Действительно, для получения органических солей обычно требуется разница минимум в три значения pKa кислотного и основного компонентов, т.е. pKa (основание)-рКа (кислота) должно быть больше трёх (правило трёх). В нашем случае pKa (МЭА)-рКа (ДНБК) равно 9,50-2,82=6,68, что существенно больше 3. Следовательно, согласно "правилу трёх", комплекс между ДНБК и МЭА должен быть в форме органической соли.
Для получения метал комплексов соли соответствующих металлов и ДНБК были растворены отдельно в этаноле в нужном количестве, полученные растворы смешались, а в случае смешанно-лигандных комплексов к ним были добавлены МЭА или ЭДА. Растворы
1826
оставляли для медленного выпаривания при температуре 30°C. Кристаллические продукты образовались после 8-20 дней.
Экспериментальные данные для рентгеноструктурного анализа были собраны с помощью программы CrysAlisPro [9] на рентгеновском диффрактометре «Xcalibur R» (Великобритания) с использованием CuKa-излучения с Х=1.5418А. Поправка на поглощение была введена мульти-скан методом этой же программы. Структуры были расшифрованы прямым методом [10] и уточнена методом наименьших квадратов с помощью пакета программ SHELXS-97 [11]. Все неводородные атомы были уточнены анизотропно, а атомы водорода были размещены на расчётных позициях, их термические параметры были фиксированы и уточнены изотропно. С помощью программного комплекса MERCURY [12] были нарисованы молекулярные и кристаллические структуры. Кристаллографические данные, включающие координаты атомов, анизотропные термические параметры для неводородных атомов, межатомные расстояния и валентные углы структуры были депонированы в Кембриджскую базу структурных данных [13] и можно взять из данной базы данных.
Трехмерные геометрии всех четырёх комплексов были взяты из файлов cif соответствующих соединений. Молекулы МЭА, ЭДА, ДНБК, а также ципрофлоксацина также были включены в исследования молекулярного докинга для сравнения энергий связи комплексов. Трехмерная геометрия этих молекул была построена с использованием программного пакета Avogadro [14]. Были проведены исследования молекулярного докинга для определения антибактериальной активности тестируемых соединений при взаимодействии с гиразой B E.coli (PDB ID: 6F86). Структура белка 6F86 была взята из базы данных PDB [15] в виде файла pdb. Структура этого белка была очищена от дополнительных молекул с помощью программы Biovia DS visualizer [16] и она была использована для исследования молекулярного докинга с помощью сервера CB-Dock2 [17]. CB-Dock автоматически определяет места привязки. По умолчанию количество стыковочных полостей установлено равным 5. При анализе результатов стыковки основное внимание было уделено активному центру, в котором локализованы тестируемые соединения. Результаты молекулярного докинга были визуализированы с помощью программы Biovia DS visualizer [16].
3. Строение полученных комплексов. Строение синтезированных комплексов были установлены с помощью ИК-спектрометрии, элементного анализа и методом рентгеноструктурного анализа. Для применения последнего метода предварительно были получены комплексы в виде монокристаллов. Молекулярные и кристаллические структуры определялись на основе экспериментальных данных, полученных на современных многоканальных рентгеновских дифрактометрах.
3.1. Строение органической соли. Структура данной соли показана на рис.1, слева. В асимметричной части элементарной ячейки находятся одна молекула ДНБК- и одна молекула МЭА+. Они связаны двумя Н-связями N(3)-H(3C)"O(1) и O(7)-H(7)"O(6) в 13-членные циклы с граф-сетью R22(13). Пара Н-связей N(3)-H(3B)"O(1) и N(3)- H(3A)"O(2) замыкает 12-членные центросимметричные кольца с граф-сетью R44(12). Центросимметричные фрагменты, состоящие из двух 13-членных и одного 12-членного Н-связанных колец, объединены в колонки, идущие в направлении оси b. Далее эти колонки ассоциированы Н-связью O(7)-H(7)"O(7) в двумерную сеть, параллельную плоскости
1827
(101). Эти двумерные сети упакованы в кристаллическую структуру за счет ван-дер-Ваальсовых взаимодействий (рис. 1, справа).
Рис. 1. Молекулярная (слева) и кристаллическая (справа) структура органической соли между ДНБК и МЭА. Эллипсоиды тепловых колебаний неводородных атомов нарисованы с вероятностью 50%. Межмолекулярные Н-связи показаны пунктирными линиями. Коды симметрии: (1) х,-1+у,7; (п) 1-х,1-у,1-7; (ш) 3/2-х,-1/2+у,3/2-7.
3.2. Строение биядерного медного комплекса.
Производные бензойной кислоты демонстрируют различные способы связывания с ионами меди (II) через карбоксилатную группу. Наиболее часто наблюдаемыми способами являются моно- и бидентатная координация. Эти способы могут приводить к образованию дискретных и полимерных структур. Наш комплекс диаква-бис [ц-(3,5-динитробензоато)]-бис[ц-(3,5-динитробензоато)]-ди-медь характеризуется нейтральной центросимметричной димерной молекулой в форме "китайского фонаря" и имеет формулу [Сщ(ДНВК)4(Н20)2] (рис. 2, слева). В нем четыре карбоксилатных аниона соединены с двумя атомами меди бидентатным способом, образуя квадратное основание из четырех атомов кислорода вокруг каждого иона Си(П). Апикальные положения ионов меди заняты молекулами воды. Координационный многогранник ионов металлов представляет собой квадратную пирамиду. Расстояние Си---Си составляет 2,631(4)А. Двугранный угол между двумя плоскостями, проходящими через атомы меди и четыре симметрично связанные карбоксилатные группы, составляет 89,95°, т.е. координационные плоскости взаимно перпендикулярны.
03
1828
Рис. 2. Молекулярная (слева) и кристаллическая (справа) структура биядерного медного комплекса ДНБК.
Симметрично связанные ароматические кольца также лежат в этих координационных плоскостях, поскольку двугранные углы между ароматическим кольцом и соответствующей карбоксилатной группой близки к нулю (около 1,5°). Нитрогруппы копланарны с соответствующими бензольными кольцами, за исключением группы №03'04' с углом наклона 27,75°. Длины экваториальных связей ионов меди находятся в диапазоне 1,962(2)-1,970(2) А, в то время как длина апикальной связи составляет 2.111(2) А из-за эффекта Яна-Теллера. Углы ортогональной связи ионов меди варьируются от 88,01(10) до 97,24(9)°. Следует отметить, что геометрические параметры валентных связей ионов металлов в двухъядерных комплексах Си производных бензойной кислоты в форме конформации "китайский фонарь" очень близки друг к другу. В кристалле имеются 3 относительно слабые межмолекулярные Н-связи. Центросимметричные связи O1W-H1WB...O2' объединять сложные молекулы в столбцы в направлении оси а, при этом образуются довольно прочные Н-связи типа С-Н...0 длиной 3,321(7) А , которые связывают столбцы в направлении оси Ь в двумерную сеть (рис. 2, справа).
3.3. Строение смешанно-лигандного комплекса меди с ДНБК и МЭА.
Изоструктурные комплексы металлов с формулой [M(ДНБК)2(MЭA)2] были получены из реакционных сред, содержащих в водно-этанольном растворе одну из солей ^(П)-, №(П)- или ^ (II), ДНБК и МЭА. Комплексные молекулы расположены в инверсионных центрах кристаллов с пространственной группой P2l/n. Ионы металлов хелатируются атомами кислорода и азота двух молекул МЭА, которые находятся в нейтральном состоянии (рис. 3,а). Две молекулы ДНБК координированы центральным ионом монодентатным способом через атом кислорода карбоксильной группы, которые находятся в карбоксилатной форме для компенсации положительного заряда иона металла. Координационные многогранники ионов металла представляют собой искаженные октаэдры. Это особенно верно для ^-комплекса, где атом O1 монодентатного аниона ДНБК и атом N3 бидентатной молекулы MЭA занимают экваториальные положения искажённого октаэдра (т.е. бипирамиды), а атом O7 MЭA находится в апикальных положениях.
1829
Рис. 3. Молекулярная (а) и кристаллическая (б) структура изоструктурных метал комплексов ДНБК с МЭА [М(ДНБК)2(МЭА)2], где М=Си(11), N1(11) и Со(11). На рисунке а атомы асимметричной части элементарной ячейки пронумерованы. Эллипсоиды неводородных атомов показаны с 50%-ной вероятностью тепловых колебаний. В комплексах симметричные половины комплексной молекулы связаны кодами симметрии 2-х,-у,1-7; 2-х,-у, 2-7 и 1-х, 2-у,1-7.
Координация такого типа бидентатных лигандов встречается крайне редко, поскольку обычно оба донорных атома бидентатных лигандов занимают экваториальные положения бипирамиды. Апикальное расстояние Си-07 (2,433(3) А) намного больше, чем экваториальные расстояния Си-0 (1,978(2) А) и Си-№ (2,004(3) А). Очевидно, что это различие объясняется эффектом Яна-Теллера. В аналогах Со и № изоструктурных комплексов координационные октаэдры атомов Со и № более правильные, а связи М-0 и М-№ имеют одинаковые расстояния. В Си-комплексе существует достаточно прочная внутримолекулярная водородная связь длиной 2,752(3) А и углом 151,00° между нескоординированным атомом кислорода карбоксилатной группы и координированной гидроксильной группой МЭА. Эта Н-связь прочнее в №- и Со-комплексах, поскольку ее длина и угол наклона составляют около 2,656(5) А и 153°. Кристаллические структуры стабилизируются Н-связью с обозначением набора графиков R1 1(6) [18 29]. Карбоксилатная группа молекулы ДНБК наклонена относительно ароматического кольца на 8,83(7)°. Двугранный угол между первой нитрогруппой и ароматическим кольцом
1830
составляет 6,77(7)°, в то время как вторая нитрогруппа почти копланарна бензольному кольцу под углом 1,76(7)°. Относительно слабая Н-связь ^3)-Н(3А)***0(7) Си-комплекса длиной 2,997(4) А и углом 164° объединяет молекулы комплекса в столбики в направлении оси Ь. В двух других комплексах эта связь длиннее примерно на 0,1 А. Достаточно прочная Н-связь С(8)-Н(8А)***0(4) длиной 3,208(4)А связывает столбцы в двумерные сети, параллельные плоскости (-101). В дальнейшем двумерные сети объединяются в кристаллическую структуру ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями (рис. 3, б).
3.4. Строение смешанно-лигандного комплекса никеля с ДНБК и ЭДА.
В кристаллах данного комплекса никеля с формулой №(ДНБК)2(ЭДА)2] комплексные молекулы располагаются на центрах инверсии триклинного центросимметричного кристалла. Две молекулы ДНБК монодентатно скоординированы ионами №(П) через атомы кислорода карбоксилатной группы за счет перехода карбоксильной группы в карбоксилатную форму для компенсации положительного заряда центрального иона. Как обычно, две молекулы ЭДА хелатно координируются с помощью аминогрупп (Рис.4,а). Длины связи №—O1, №—N3 и №—N4 почти одинаковы и составляют 2,0982 (15), 2,087(2) и 2,0829 (19) А, в то время как максимальные отклонения валентных углов от идеального значения 90 градуса равны 7°, т.е. углы находятся в диапазоне от 83,38 (9) до 96,63 (9)°. Следовательно, многогранник центрального иона представляет собой почти идеальный октаэдр. Конформация комплексной молекулы стабилизирована за счет наличия слабой внутримолекулярной Н-связи (3,073 (4) А и 138 (3)°) между донором N4—Н4А и акцептором 02. Наиболее копланарна ароматическому кольцу нитрогруппа N10304 (4,25°), а наименее копланарна карбоксилатная группа (13,33°). Копланарность нитрогруппы N20506 является промежуточной и соответствующий двугранный угол равен 9,18°.
а
1831
б
Рис.4. Молекулярная (а) и кристаллическая (б) структура никель комплекса ДНБК с ЭДА с формулой [№(ДНБК)2(ЭДА)2]. На рисунке а атомы асимметричной части элементарной ячейки пронумерованы. Эллипсоиды неводородных атомов показаны с 30%-ной вероятностью тепловых колебаний. Водородные связи показаны пунктирными линиями.
В кристаллической структуре имеются три относительно слабые Н-связи. Внутримолекулярная Н-связь N4—H4A*"O2 замыкает шестичленный цикл с граф-сетью S11 (6) [18]. Межмолекулярные Н-связи N4—H4A*"O4i и N4—H4B"*O4ii замыкают кольца с граф-сетью R24(8), которые, в свою очередь, соединяются в молекулярную цепь вдоль направления [111]. Н-связи с участием атома кислорода О5 очень слабые. Далее цепи соединены в двумерную сетку, параллельную плоскости (0-11) (Рис. 4, б). Кроме того, кристаллическая структура стабилизируется л-л-стэкинг взаимодействием (Cg1"*Cg1 = 3,715 (3) Ä бензольного (C1—C6).
4. In silico исследования антимикробной активности комплексов или молекулярный докинг.
Исследования молекулярного докинга наших четырёх комплексов на основе ДНБК были проведены сервером CB-Dock2 на предмет их антимикробной активности против белка 6F86 бактерии Esherica coli. Для оценки усиления биологической активности были рассчитаны энергии связывания (ЭС) свободных лигандов ДНБК, МЭА и ЭДА, а также стандартного антибиотика ципрофлоксацина (табл. 1). Заметное повышение активности исходных соединений происходит в результате образования оргметаллокомплексов. Максимальное повышение при значении ЭС=-10,2 наблюдается для комплекса [Си(ДНБК)2(МЭА)2], который более чем на 30 процентов превосходит биологическую активность стандартного препарата ципрофлоксацина. Контактирующие аминокислотные остатки активного центра белка 6F86 с данной комплексной молекулой приведены на рис. 5, а список аминокислот, образующих водородные связи с комплексной молекулой в табл.1, т.е. соединение [Си(ДНБК)2(МЭА)2] взаимодействует со следующими аминокислотными остатками: ASN46, GLY77, VAL120, SER121,THR165. В дополнение к этому, существует взаимодействие притягивающего заряда с остатком аспарагиновой кислоты ASP49.
1832
Таблица 1. Энергии связывания тестируемых соединений с белком 6Б86 бактерии
Esherica coli gyrase B.
Соединение Энергия связывания, ккал/моль Аминокислотные остатки, образующие Н-связи
ДНБК -6.6 ASN46, GLU50, GLU77, THR165
МЭА -3.2 ASP73, THR165
ЭДА -3.1 THR165
Органическая соль -8.0 ASP73, ARG76, VAL120
между ДНБК и МЭА
[Си2(ДНБК)4(Н2О)2] -8.2 ASN46, ARG76, GLY77, VAL120, ARG136, THR165
[Си(ДНБК)2(МЭА)2] -10.2 ASN46, GLY77, VAL120, SER121, THR165
[№(ДНБК)2(ЭДА)2] -8.6 ASN46, ARG76, GLY77, VAL120, SER121, THR165
Ципрофлоксацин -7.1 ARG76, THR165
Полярные аминокислоты ASP46, SER121, THR165 и неполярные аминокислоты
GLY77, VAL120 образуют Н-связи в случае всех трёх координационных соединений. Основной аминокислотный остаток ARG76 образует Н-связь с [Сщ(ДНБК)4(Н20)2] и [№(ДНБК)2(ЭДА)2] (табл. 1).
Рис. 5. Взаимодействие комплекса [Си(ДНБК)2(МЭА)2] с аминокислотами активного участка белка 6F86 бактерии Esherica coli gyrase B.
Таким образом, по антимикробной активности все 4 соединения, полученные нами, проявляют большую антибактериальную активность по сравнению с хорошо известным антибиотиком ципрофлоксацином.
1833
5. Заключение. Результаты настоящего исследования показывают, что биологическое действие малоактивных АФИ может быть усилено путём получения супрамолекулярных соединений, а именно молекулярных и метал комплексов. Определение биологической активности АФИ вместо традиционных in vitro и in vivo методов современным in silico подходом позволяет сэкономить средства и время экспериментатора. Однако, для окончательного установления факта биофармацевтической оптимизации АФИ необходимо провести классические биологические исследования, что и находится в нашей повестке дня.
REFERENCES
1. Vaskova Z, Stachova P, Krupkova L, Hudecova D, Valigura D (2009) Acta Chim. Slovaca 2:77
2. Handbook of Aqueous Solubility Data. CRC Press, Boca Raton, FL (2003)
3. Shah P, Goodyear B, Michniak-Kohn B B (2017) Adv. Pharm. Journal 2:161
4. Bharti V P, Attal V R, Munde A V, Birajdar A S (2015) S. Bais. J. Innov. Pharm. Biol. Sci. 2:482
5. Zardini H Z, Davarpanah M, Shanbedi M, Amiri A, Maghrebi M, Ebrahimi L J (2014) Biomed Mater Res A. 102:1774
6. Bakalova S, Mincheva V, Doycheva A, Groudeva V, Dimkov R (2008) Biotechnol. Biotechnol. Eq. 22:716
7. Ibragimov A B, Ashurov J M, Ibragimov B T (2018) Int. J. Chem. Sci. 2:45
8. Ibragimov A B, Ashurov Zh M, Zakirov B S (2017) J. Str. Chem. 58:588
9. Rigaku Oxford Diffraction (2015). CrysAlis PRO, Rigaku Corporation, Tokyo, Japan.
10. Sheldrick, G. M. (2015a). Acta Cryst. A71:3
11. Sheldrick, G. M. (2015b). Acta Cryst. C71:3
12. Macrae, C. F., Bruno, I. J., Chisholm, J. A., Edgington, P. R., McCabe, P., Pidcock, E., Rodriguez-Monge, L., Taylor, R., van de Streek, J. & Wood, P. A. (2008). J. Appl. Cryst.41:466
13. Groom, C. R. & Allen, F. H. (2014). Angew. Chem. Int. Ed. 53:662
14. M.D. Hanwell, D.E. Curtis, D.C. Lonie, T. Vandermeersch, E. Zurek, G.R. Hutchison,
15. J. Cheminform. 4 (2012) 17, https://doi.org/10.1186/1758-2946-4-17.
16. H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne, (2000) Nucleic Acids Res. 28:235
17. BIOVIA, Dassault Sysfemes, San Diego, CA, 2021
18. Y. Liu, X. Yang, J. Gan, S. Chen, Z.X. Xiao, Y. Cao, (2022) Nucleic Acids Res. 50 (W1) W159-W164, https://doi.org/10.1093/nar/gkac394
19. Etter, M. C. (1990). Acc. Chem. Res. 23:120.
1834
