CC BY
35
Карпова Г.В., Буракаева А.Д.
Оренбургский государственный университет Е-mail: [email protected]
ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ НУРОМУСЕБ ВДБЕЬШБ В СВЯЗИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В ПРАКТИКЕ
Разработаны методы выделения и изучены физико-химические характеристики компонентов клеточной стенки микофильного гриба Нуротусев говеПив - отхода получения красителя. Установлено, что основная часть приходится на полисахаридный хитин-глюкановый комплекс, который обладает сорбционными свойствами в отношении некоторых металлов. В клеточной стенке идентифицированы жирные кислоты, нафтахиноновые пигменты, углеводороды, воска, стерины, витамины группы В, и полноценные по аминокислотному составу белки.
Ключевые слова: микофильный гриб Нуротусев говеПив, хитин-глюкановый комплекс, хи-тозан, липиды, пигменты.
В общем объеме биотехнологической продукции значительная часть приходится на производство физиологически активных соединений, продуцируемых микроскопическими грибами. Вопросы утилизации грибного мицелия - отхода крупнотоннажных микробиологических производств остаются на сегодняшний день практически нерешенными. В то же время известно, что клеточные стенки большинства микроскопических грибов состоят из хитин-глюканового комплекса, содержат значительные количества белка, липидов, витаминов, разнообразные пигменты.
Микроскопический гриб НуротуЄЄ8 ГоБЄІІШ 94/77 известен как продуцент красителя [1].
Целью данной работы явилось выделение, очистка и изучение физико-химических свойств остаточных компонентов отработанной биомассы гриба Нуротуев8 говеІІш 94/77- отхода получения красителя, а также изучение сорбции ионов А1 3+ и Си 2+ отработанной биомассой и полисахаридным хитин-глюкановым комплексом клеточной стенки Нуротусев говеІІив.
Объект и методы исследований
В работе использовалась отработанная биомасса Нуротусев говеІІив 94/77, полученная по способу [1]. Выделение пигмента и липидных компонентов - согласно[2]. Определение физико-химических характеристик проводили с использованием спектральных методов анализа. ИК-спек-тры полученных соединений снимали на спектрофотометре ИК - Фурье ФСМ 1201 в области частот 500-4000 см-1 и ИК «Бресогі» М-80 спектр продукта снимали на ККБ-стекле в виде пленки, внутренний стандарт тетраметилсилан (ТМС). УФ-спектр снимали на спектрофотометре «8ресоЫ» М-40, используя растворители хлороформ и метанол. ВЭЖХ по разделению пигмента проводили на хроматографе РЗ 1050. Масс-спектры получены на спектрометре МХ-1320; хрома-
то-масс-спектры - с использованием системы хроматограф-масс-спектрометр - ЭВМ: хроматограф НР 5890 с масс-селективным детектором НР 5972А. ГЖХ-анализ на хроматографе «Chrom-5», колонка 1.2х3 мм 5% SE-30. ЯМР 4Н снимали на приборе «Tesla BS-487 В» (60 мГЦ) в раств. CDCL внутр. станд. ТМС. Элементный анализ органических соединений (С, Н, N) проводился на элементном анализаторе Karlo Erda модели 1106. Биомассу определяли весовым методом. Белок в мицелии согласно[3]. Аминокислотный состав белка - на автоматическом амино- анализаторе Т 339 М (Чехословакия). Гидролиз образцов проводили с 6 н. HCl при 105 0 С в течение 24 часов в запаянных под N2 стеклянных ампулах, количественное определение триптофана проводили, используя метод Хорна [3], редуцирующие сахара, витамины, сырой жир - согласно [4]. Степень адсорбции меди согласно [5], алюминия - по ГОСТ 18165-89 «Метод определения массовой концентрации алюминия». Получение полисахаридного хитин-глюканового комплекса по методу [6].
Результаты и их обсуждение
Первоначально нами был исследован химический состав и биологическая ценность отработанной биомассы мицелия гриба. Определение суммарного белка показало, что его содержание не превышает 18-20%, причем основную часть составляет спирторастворимая фракция. На хроматограммах гидролизата белка мы получили все аминокислоты, как заменимые, так и незаменимые. Отмечалось наиболее высокое содержание аргинина, валина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и лизина. В мицелии были обнаружены такие витамины как тиамин в количестве 3 мг% и пиридоксин 4,9 мг%. На долю редуцирующих сахаров приходилось 30-32%.Содержание сырого жира составило 13-15% к весу сухой биомассы. С целью удаления остатков свободных и связанных с клеточной стенкой липи-
Проблемы экологии Южного Урала
ОН ОН
Н3СО
ОСН3
ОН
Он
Рисунок 1
дов, а также остаточного количества пигмента биомассу мицелия последовательно обрабатывали органическими растворителями: гексаном, смесью хлороформ-изопропанол (2:1), смесью этанол-серный эфир (2:1). В результате проведения аналитической тонкослойной хроматографии установили, что в состав нейтральных липидов входят следующие соединения с Я£ = 0.1-0,2-диглицериды; Я£ = 0,3-выс-шие алифатические спирты; Я£ = 0,6-триацилглице-риды; К£=0,93-углеводороды. В хлороформную фракцию уходило большое количество пигмента, об этом мы судили по обесцвечиванию мицелия и окраски экстракта. Для осаждения пигмента использовали диэтиловый эфир. Содержание полярных липидов в этой фракции не превышало 3-4% от сухой биомассы, также отмечались следовые количества нейтральных липидов с Я£ = 0,05 - (1-0-моноал-киловые эфиры глицерина); Я£ = 0,1 - (стерины); Я£ = 0,3 - (высшие алифатические спирты); Я£ = 0,6 -(триацилглицериды); Я£ = 0,93 - 0,96 - (углеводороды). Связанные с клеточной стенкой липиды экстрагировали в системе этанол- серный эфир (1:2). Установили, что их состав включает в себя следующие соединения: Я£ = 0,6-триацилглицериды; Я£ = 0,19-стерины; Я£ = 0,38-жирные кислоты; Я£ = 0,88 -воска, Я£ = 0,99. Исследован общий жирнокислотный состав связанных липидов и выявлено, что доминирующими являются пальмитиновая и олеиновая кислоты до 68% от суммы жирных кислот. Хро-мато-масс-спектр обнаружил в незначительных количествах 2 соединения стероидной структуры: 5-альфа-прегнан-3,15,20-трион и спироциклопропан-1,21 (11Н)-фенантрен-114(31 Н)-дион, 31, 71, 9 1. В со-
ставе гексановой и этанол-серноэфирных фракций, согласно данным хромато-масс-спектрометрии, находится смесь н-алканов С17, С21 и С35 в соотношении 2:6:9, а хлороформные и этанольно-серноэфир-ные фракции содержат смесь н-алканов С, С14,С17,С21,С26,С28,С35 в соотношении 2:7:4:8:6:1:6. Таким образом, связанные с клеточной стенкой липиды отличаются от внеклеточных липидов и эти различия касаются жирно-кислотного состава, состава углеводородов, наличия в клеточной стенке восков и стеринов.
Согласно данным ВЭЖХ, ЯМР 13 С, ЯМР 1 Н, ИК-, УФ-спектров и хромато-масс-спектров, по результатам элементного анализа связанный с клеточной стенкой пигмент имеет примерные структуры нафтахиноновых производных (рисунок 1).
На следующем этапе работы обезжиренную гомогенную массу мицелия подвергали последовательной обработке согласно [6] с целью получения полисахаридного хитин-глюканового комплекса, выход которого составил 44%. Согласно данным элементного анализа и ИК-спектроскопии можно сделать вывод, что полученный нами хитин весьма сходен с хитином, выделенным из панцирей ракообразных.
Нами был изучен процесс сорбции ионов А1 3+ и Си 2+. Показано, что биомасса - отход получения красителя - сорбировала из однокомпонентного раствора 55% алюминия и 77% меди. Полученный полисахаридный комплекс обладал наибольшей сорбционной способностью, степень извлечения ионов составила 89% алюминия и 96% меди соответственно.
--------------------------- 4.08.2011
Список литературы:
1. Буракаева А.Д. Способ получения красителя. Патент РФ №2065462, опубл.20.08.96, бюл.№23.
2. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. - М. - 1975. - 406с.
3. Методы экспериментальной микологии. Справочник.-Киев.- 1982. - С. 225-249.
4. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. - М. - 1982. - С.192-216, 277-278.
5. Лурье Ю.Ю.Химический анализ производственных сточных вод. - М. - 1974. - 464 с.
6.Терешина В.М., Меморская А.С., Феофилова Е.П. и др. Получение из мицелиальных грибов полисахаридных комплексов и определение степени их деацетилирования.//Микробиология. - 1997. - Т. 66. - №1. - С. 84-89.
Сведения об авторах: Буракаева Айгуль Дикатовна, к.б.н., доцент, индивидуальный предприниматель Карпова Галина Викторовна, д.б.н., доцент каф. общей биологии
