Новый антифунгальный антибиотик, продуцируемый Hypomyces rosellus ВПКМ f 242 и фенотипически близкими штаммами Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

УДК 557.156:615.331:615:334.012.6

Буракаева А.Д., Карпова Г.В.

Оренбургский государственный университет Е-mail:aigulburakaeva@mail.ru

НОВЫЙ АНТИФУНГАЛЬНЫЙ АНТИБИОТИК, ПРОДУЦИРУЕМЫЙ НУРОМУОЕБ РЮвЕНив ВПКМ Р-242 И ФЕНОТИПИЧЕСКИ БЛИЗКИМИ ШТАММАМИ

Проведен анализ антигрибных метаболитов из разных штаммов Нуротуоев говвИив. С использованием методов препаративной тонкослойной хроматографии и спектральных анализа индивидуально выделено и идентифицировано соединение - 1-[[2-(2,4-дихлорфенил)-4-про-пил-1,3-диоксалан-2-ил]метил]-1Н-1,2,4-триазол, ингибирующее рост ряда патогенных грибов . Химический анализ других метаболитов показал, что они являются производными диокса-на и диоксалана.

Ключевые слова: микофильный гриб Нуротусеэ говеНив, антибиотик, диоксалан, триазол, дихлорфенил.

В последние годы все большее значение приобретает развитие биотехнологических способов защиты растений и пчел от болезней, вызванных патогенными грибами. Интенсивное использование химических препаратов привело к экологическим нарушениям, к возникновению более устойчивых штаммов патогенных микроорганизмов и к другим нежелательным последствиям. В связи с этим большого внимания заслуживают исследования по поиску и внедрению в практику антибиотиков немедицинского назначения, получаемых путем микробиологического синтеза.

Целью данной работы было разработать методы выделения и провести идентификацию антигрибных метаболитов из Нурошусе8 гоБеИш ВПКМ Б-242 и фенотипически близких штаммов.

Объект и методы исследований

В работе использовались 3 штамма мико-фильного гриба Нур0шусе8 Г08е11и8, условно обозначенных как штамм А -1 - получен нами отбором индуцированных мутантов и последующей селекцией с учетом продуктивности и эффективности, определяемой по отношению к возбудителям стеблевой ржавчины злаков Рисаша ^ашшБ; штамм А-2 - типовой штамм ВПКМ Б-242; штамм А-3 - выделен с природного субстрата с последующим отбором по признаку максимального антибиотикообразования. Способ культивирования продуцентов и состав питательных сред описаны нами ранее [1, 2]. Противогрибковые свойства штаммов оценивали общепринятыми методами [3]. Выделение и очистку антибиотика осуществляли из фильтрата культуральной жидкости препаративной тонкослойной хроматографией в системах растворителей, предложенных для хроматографирования антибиотиков[3]. Определение физико-химических характеристик проводили с использованием спектральных мето-

дов анализа. ИК-спектры полученных соединений снимали на спектрофотометре ИК - Фурье ФСМ 1201 в области частот 500-4000 см-1. Масс-спектры получены на спектрометре МХ-1320; хромато-масс-спектры - с использованием системы хроматограф-масс-спектрометр - ЭВМ: хроматограф HP 5890 с масс-селективным детектором HP 5972А. ГЖХ-анализ на хроматографе “Chrom-5”, колонка 1.2х3 мм 5% SE-30. ЯMP 1Н снимали на приборе «Tesla BS-487 В» (60 мГЦ) в раств. CDCL внутр. станд. ТМС. Элементный анализ органических соединений (С, Н, N) проводился на элементном анализаторе Karlo Erda модели 1106.

Результаты и их обсуждение

Проведенная работа по отбору штаммов-продуцентов антибиотиков выявила антагонистические свойства, а также фунгицидное и фун-гистатическое действие культуральной жидкости, полученной методом глубинного культивирования в отношении Puccinia graminis, Alternaria tenuis, Fusarium oxysporum Fusarium roseum, Helmintosporum sativum, Monilia fructigena, Rhisoctonia solani, Penicillium rugulosum, Ascosphera spp., Microsporium canis. Степень ингибирования роста зависела от штам-ма-продуцента и тест-культуры гриба. В результате проведенной работы по подбору экстрагента, времени и температуры экстракции, а также способа препаративного разделения и очистки из культуральной жидкости штаммов-продуцен-тов А-1, А-2 методами ГЖХ и хромато-масс-спектрометрии было идентифицировано соединение: 1-[[2-(2,4-дихлорфенил)-4-пропил-1,3-диоксалан-2-ил]метил]-1Н-1,2,4-триазол (рисунок 1). Брутто формула вещества соответствует ^H^O^C^ (М.м. 342,2). Наличие фрагментов полученной структуры нашли подтверждение данными, полученными методом ИК-спек-

Проблемы экологии Южного Урала

трометрии, УФ-спектрометрии, ЯМР 4И спектрометрии, элементного анализа.

Структура полученного соединения состоит из трех частей - дихлорфенила, диоксалана и три-азола. Отдельные части полученной нами молекулы встречаются в литературе среди антибиотиков, получаемых микробиологическим путем [3].

Данные, полученные с помощью хромато-масс-спектров, были рассмотрены как по интенсивности сигналов, так и по количественному соотношению между собой (рисунок 2,3). У штамма А-1 антибиотику соответствовало всего лишь одно вещество - 1-[[2-(2,4-дихлорфенил)-4-пропил-1,3-диоксалан-2-ил]метил]-1Н-1,2,4-триазол. У типового штамма А-2 сигнал данного соединения был менее интенсивен. У штамма А-2 отмечалось два основных сигнала, соответствующие веществам с брутто формулами С7Н16О3 (М.м.146) и С18Н24О5 (М.м. 321), представляющие собой диоксан и близкое к нему соединение (рисунок 2).

Дальнейший анализ показал, что соединения, преобладающие у штаммов А-1 и А-2 практически отсутствуют у штамма А-3. В то же время у штамма А-3 обнаруживаются соединения близкого строения, в качестве основы у которых также выступает диоксан и диоксалан. Это вещества с брутто формулами С26Н40О5 (М.м. 433), С13Н16О4 (М.м. 237) и С15Н20О4 (Мм. 265).

Таким образом, на основании полученных спектральных данных можно сделать вывод, что в составе антигрибных антибиотиков у всех штаммов микофильного гриба в качестве связующего звена могут выступать 4-пропил-1,3-диоксалан и 1,3-диоксан-5-метанол, 4,5-диметил и на них в процессе микробиологического синтеза идет присоединение дихлорфенильной группы и триазола. Авторы выражают признательность за помощь в интерпретации спектральных данных профессору Башгосуниверситета Ахметовой Венере Рахимовне.

28.07.2011

СНз

Рисунок 1. Примерная формула антибиотика

ЕЗ С7Н1407 ■ С1 5Н1702ШСІ2

] С18Н2405 а С26Н4005

1С15Н2004 і С13Н1604

Рисунок 2. Диаграмма интенсивности сигналов

80 70 60 50 % 40 30 20 10

/ /

/

/

/

/

/

/ / Л.

( /

нР=

іЬ/1

А1С

0С7Н14О7 ■ С15Н1702^С12

А2С

] С18Н24О5 8 С26Н4005

А3С

1 С15Н2004 І С13Н1604

Рисунок 3. Диаграмма количественного отношения продуктов между собой

Список литературы:

1. Торопова Е.Г., Максимов В.Н., Береснева Г.Г., Егоров Н.С., Буракаева А.Д. Оптимизация состава среды для биосинтеза антибиотика, протеаз и пигментов микофильным грибом Ыурошусев говеїіш с помощью метода математического планирования эксперимента //Антибиотики и медицинская биотехнология.- 1986.- № 6.- С.408-411.

2. Торопова Е.Г., Мардамшина А.Д. (Буракаева), Писункова Н.Ф. Подбор посевных сред, возраста и количества мицелия, обеспечивающих одновременный биосинтез антибиотика и пигмента у гриба Ыурошусе8 го8е11и8//Антибиотики и химиотерапия - 1988.- Т.ХХХІІІ. - № 2.- С.96 - 99.

3. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках -М.-2005.-43,155-160, 340-523.

Сведения об авторах: Буракаева Айгуль Дикатовна, доцент, кандидат биологических наук,

индивидуальный предприниматель Карпова Галина Викторовна, доцент кафедры общей биологии Оренбургского государственного университета, доктор биологических наук 460018, г. Оренбург, пр-т Победы, 13