CC BY
142
УДК 547.541.64.995.12
Ф. Ф. Шарнина F. F. Sharnina
Марийский государственный университет, г. Йошкар-Ола Mari State University, Yoshkar-Ola
Хитин подмора пчел и хитин-глюкановый комплекс высших грибов,
ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В РЕСПУБЛИКЕ МАРИЙ ЭЛ —
КАК ВОЗМОЖНЫЙ ИСТОЧНИК ПОЛУЧЕНИЯ й(+)-ГЛЮКОЗАМИНА ГИДРОХЛОРИДА
Dead bee chitin and chitin-glucan complex of higher fungi growing IN Mar El as the possible source of D(+) glucosamine hydrochloride
Изучены особенности кислотного гидролиза хитин-глюкановых комплексов высших грибов и под -мора пчел. Разработана технология выделения и очистки из гидролизата .0(+)-глюкозамина гидрохлорида высокого качества. Состав, свойства и чистота продукта проанализированы с использованием комплекса физико-химических методов. Выход конечного продукта составил 20-60 % в зависимости от содержания хитина в образцах ХГК. Полученный аминосахар представлял собой белый кристаллический порошок без запаха, легко растворимый в воде, малорастворимый в спирте и нерастворимый в хлороформе и в других органических растворителях и по основным показателям соответствовал качеству стандартного .0(+)-глюкозамина гидрохлорида.
Acid hydrolysis peculiarities of chitin-glucan complexes of higher fungi and dead bee chitin have been studied. The technology of extraction and purification of high quality D (+)-Glucosamine hydrochloride from hydrolyzate was developed. The composition, properties, and purity of the product were analyzed using a complex of physical and chemical methods. The yield of final purified product was 20-60 % depending on the content of chitin in the samples of CGC. As a result we had amino sugar which was white crystalline powder, odorless, readily soluble in water, slightly soluble in alcohol and insoluble in chloroform and in other types of organic solvents, which corresponds to the quality of standard D (+)-Glucosamine hydrochloride.
Ключевые слова: грибы, подмор пчел, хитин, хитин-глюкановый комплекс, глюкозамин.
Key words: higher fungi, dead bees, chitin, chitin-glucan complex, Glucosamine.
Аминосахар Д-глюкозамин (ДГА) является строительным материалом практически всех суставных смазок и тканей амортизаторов человека, которые известны как гликозаминогликаны, включающие гиалу-роновые кислоты, хондроитин сульфаты и др., и про-теогликаны, образующиеся из них. Поскольку ДГА при хранении на воздухе и даже в плотно закрытом сосуде быстро окисляется и разлагается, на практике обычно используют его хлоргидрат, 2-дезокси-2-амино-Р-Б-глюкоза гидрохлорид [6; 7].
Солянокислый Д-глюкозамин (ДГА • НС1) является основной субстанцией ценных лекарственных препаратов, используется для лечения артритов, артрозов, инфекционных и онкологических заболеваний, применяется в качестве иммунностимуляторов и компонентов пищевых добавок. Поэтому на сегодняшний день актуальными задачами являются как поиск новых источников получения ДГА, так и совершенствование способов выделения ДГА*НС1.
Технология препаративного выделения Д(+)-глю-козамина гидрохлорида основана на полном кислотном гидролизе природного полисахарида хитина в концентрированной соляной кислоте с последующей очисткой гидролизата и перекристаллизацией продукта [1; 7]. При гидролизе происходит расщепление аце-тамидных и гликозидных связей, что приводит к процессам дезацетилирования и деполимеризации [6]:
CH2OH O
HOH п ^ X—
п
- к. OH п
HCl OH V- Y
п NH;
В настоящее время основным сырьем для получения ДГА*НС1 служит хитин ракообразных (креветка, краб, криль). В клеточной стенке грибов хитин содержится в виде хитин-глюканового комплекса (ХГК), который по своим показателям ни в чем не уступает хитину и является более дешевым и доступным сырьем для получения ДГА*НС1 [3; 8; 9].
Данная работа посвящена разработке способа выделения ДГА*НС1 из ХГК высших грибов и хитина подмора пчел. С этой целью проведено исследование процесса кислотного гидролиза ХГК, выделения и очистки из гидролизата целевого продукта. Варьировались температурный режим, кислотность, продолжительность гидролиза и приемы отмывки от побочных продуктов кислотного гидролиза. На основании полученных результатов был разработан способ выделения ДГА*НС1 из ХГК. Промывание целевого продукта проводилось холодной концентрированной соляной кислотой (от -10 °С до -15 °С). Выход амино-сахара составил 20-60 % (от ХГК) в зависимости от класса, вида и формы плодового тела высших грибов из которого был выделен ХГК. Состав продукта
h
NHAc
и его химическая чистота исследовались методами элементного анализа, ТСХ, ИКС, ПМР, определением удельного угла вращения, температуры плавления и доли основного вещества.
Методика. Материалы. В качестве сырья для выделения D(+)-глюкозамин гидрохлорида использовали ХГК из высших грибов (Марий Эл), Armilariella mellea (опенок настоящий), Morchella esculenta (сморчок настоящий), Cantharellus cibarius (лисичка настоящая), Lactarius rufus (груздь горький), Amanita muscaria (мухомор красный), Macrolepiota excoriata (гриб-зонтик белый), Suillus bovinus (козляк, решетник). Также для получения ДГА*ИС1 были использованы хитин ракообразных (Arthropoda) и хитин подмора пчел (Apis Mallifera), для сравнения процентного выхода и качества ДГА*ИС1, выделенного из хитина различного происхождения. Выделение ХГК из высших грибов и хитина из подмора пчел проводили по четырехстадийной методике, разработанной ранее автором данного сообщения и описанной в работах [2; 3]. Данная методика выделения хитина предусматривает поэтапное удаление из хитинсодержащей биомассы (плодовые тела некоторых видов высших грибов и подмор пчел), сопутствующих хитину веществ: протеинов, липидов, пигментов (в том числе и меланинов), жиров, минеральных веществ [2; 3]. В ходе последовательного проведения четырехстадийной реакций из хитинсодержащей биомассы выделяются чистые образцы в виде порошка (ХГК грибов) или хлопьев (хитин подмора пчел), имеющие цвет от светло-бежевого до белого, нерастворимые в щелочах, разбавленных кислотах, в органических растворителях, в воде и сильно набухающий в ней, сопоставимые с характеристиками стандартного хитина из ракообразных (Arthropoda), и отвечающие техническим требованиям (ТУ 15-02-538-89 и 15-01-472-87).
Получение D(+)-глюкозамина гидрохлорида. В трехгорловую колбу, снабженную электромешалкой, обратным холодильником и термометром, помещали 10 г сухого (с учетом влажности) измельченного ХГК, добавляли 100 мл концентрированной HCl (р = 1,19 г/см3) и при непрерывном перемешивании нагревали на водяной бане при 70-75 °С в течение 3,5-4 ч. Затем колбу с реакционной смесью охлаждали, добавляли 100 мл дистиллированной воды и 2,5-3 г активированного угля. Реакционную массу продолжали нагревать при температуре 50 °С еще в течение 1-1,5 ч при непрерывном перемешивании. Охлажденную реакционную смесь черного цвета отфильтровывали на воронке Шотта или на воронке Бюхнера через плотный капрон в четыре слоя. Фильтрат светло-желтого оттенка упаривали в вакууме водоструйного насоса или на водяной бане при 40 °С до объема 10-15 мл. После охлаждения выпавшие кристаллы ДГА*ИС1 отделяли от жидкости с помощью стеклянного фильтра или воронки Бюхнера через капроновую ткань в четыре слоя. Кристаллы промывали на воронке Бюхнера холодной концентрированной HCl (от -10 °С до -15 °С),
далее поочередно этиловым спиртом и диэтиловым эфиром. Полученные белого цвета кристаллы ДГА *HCI сушили на воздухе до постоянной массы.
Методы исследования. В качестве стандартных образцов сравнения применяли: D(+)-глюкозамин гидрохлорид субстанция (ФСП 42-0314-147В-01, Научнотехнический центр ЭKОБИОТЕK, г. Мурманск), D(+)-глюкозу (ч. д. а., ГОСТ 603В-74), D(-)-фруктозу (ч., ТУ 6-09-1979-77) и D(+)-маннозу (ч., ТУ 6-09-07-666-76), технический хитин ракообразных — Arthropoda (ГОСТ 7630-В7, г. Владивосток).
Анализ и степень чистоты ДГА^О из XTK высших грибов проводили методом тонкослойной хроматографией (TCX) на силикагельсодержащих пластинках «Silufol-R» и «Silufol-UV 254» (Avalier, Czechoslovakia) в сравнении со стандартами (D(+)-глюкозамин гидрохлорид субстанция, глюкоза, фруктоза, манноза). С целью исключения ошибок, контроль процесса отделения ДГА^О от нейтральных сахаров осуществляли методом TCX в нескольких подобранных нами системах растворителей: 1) этанол/ацетон (3 : 2); 2) изопропанол I ацетон/ 0,2 М молочная кислота (6 : 3 : 1); 3) этанол I ацетон I гексан (2 : 2 : 1), и по данным эксперимента определяли Rf (Ratio of Fronts, отношение фронтов или фактор замедления).
Проявление хроматограмм осуществляли в парах йода или путем опрыскивания (0,25 мл свежепере-гнанного анилина + 0,25 г дифениламина в 25 мл ацетона + 1 мл ортофосфорной кислоты) с дальнейшим нагреванием хроматографических пластинок в сушильном шкафу при температуре не более 70 °С.
Kоличество доли основного вещества в ДГА^О определяли фотометрическим методом по Эльсону -Моргану [5; В]. Элементный анализ по азоту, углероду и водороду проводили на автоматическом анализаторе (Perkin Elmer C H N SIO Analyzer 2400). Удельное вращение образцов солянокислого глюкозамина определяли на поляриметре СМ-3 УXЛ 4.2 до и после установления равновесия а- и p-форм в течение суток. ИK-спектры снимали на ИK-фурье-спектрофотометре «VECTOR 22» фирмы «Bruker», ПМР-спектры снимали в Институте органической химии им. Зелинского (г. Москва). Температуру плавления образцов ДГА^О и смешанного плавления определяли на столике ^ф-лера («Boёtius», Германия). Влажность и зольность образцов определяли гравиметрическим методом по ТУ 15-02 53В-В9. Подлинность продуктов определяли по качественной реакции с реактивом Эрлиха [5; В].
Результаты и их обсуждение. Для получения ДГА^О детально исследовались условия кислотного гидролиза XTK гриба вида A. mellea (кислотность, соотношение хитин/кислота, время, температура) и способы очистки материала от побочных продуктов. На основании результатов исследования различных факторов была разработана технология получения солянокислой соли природного аминосахара.
Трудность выделения ДГА *HCI из XTK заключалась в том, что в гидролизате XTK присутствовал
не только ДГА*НСІ, но и достаточное количество глюкозы, фруктозы и даже маннозы, хорошо растворимых в воде и нерастворимых ни в одном из органических растворителей, что затрудняло их разделение. Большая часть примесей оставалась в растворе, а часть выпадала в осадок вместе с целевым продуктом. Данные сахара можно разделить методом перекристаллизации в разбавленном растворе спирта, но это приводит к сильному снижению выхода целевого продукта. Применение для этой цели разных хроматографических колонок не перспективно, так как в случае промышленного синтеза препарата можно столкнуться как с проблемами материального характера, так и с трудностями в подборе оборудования. Было установлено, что солянокислый Б-глюкозамин плохо растворим, а нейтральные сахара (глюкоза, фруктоза, манноза) прекрасно растворяются в холодной концентрированной соляной кислоте. Поэтому данная проблема была решена путем промывания осадка ДГА*НСІ холодной (от -10 °С до -15 °С) концентрированной НС1 (контроль осуществляли методом ТСХ).
Таким образом, из гидролизата ХГК гриба вида A. mellea препаративно был выделен ДГА*НСІ с использованием описанного выше метода. Выход целевого продукта составил 50 % от ХГК (табл. 1).
Полученный ДГА'НСІ гриба A. mellea по основным показателям качества соответствовал качеству стандартного ДГА*НСІ субстанции (ФСП 42-0314-1478-01) и представлял собой белый кристаллический порошок без запаха, легко растворимый в воде, малорастворимый в спирте и нерастворимый в хлороформе и в других органических растворителях. Реакция с реактивом Эрлиха была положительной, температура плавления 210 °С с разложением, значение удельного вращения после установления равновесия а- и Р-форм в течение суток [аБ20] = 72,5° (табл. 1), что соответствует литературным данным [1; 7].
Таблица 1 — Характеристики образцов солянокислого Б-глюкозамина различного происхождения
Результаты ТСХ во всех трех системах растворителей свидетельствовали о наличии в полученном продукте одного вещества — ДГА*НСІ. На хроматографических пластинках наблюдалось по одному пятну красно-бурого цвета, что подтверждает достаточную степень чистоты соли глюкозамина. Факторы замедления (Я/) ДГА*НСІ гриба A. mellea во всех трех системах растворителей идентичны с Я/ стандартного образца ДГА*НСІ (ФСП 42-0314-147801) и равны — 0,52 (табл. 1).
Данные элементного анализа по азоту, углероду и водороду ДГА*НСІ гриба А. теїіеа и стандартного образца одного порядка и показывают достаточно хорошую сходимость с теоретически рассчитанными значениями (табл. 2).
Таблица 2 — Элементный анализ образцов солянокислого D-глюкозамина различного происхождения
DGA ♦ HCI хитина различного происхождения Содержание, %
углерода водорода азота
DGA*HCI (теор. расч.) 33,41 6,49 6,49
DGA ♦ HCI (стандарт) 33,44 6,96 6,39
Cantharellus cibarius 33,40 6,67 6,39
Armillariella mellea 33,42 6,В3 6,39
Amanita muscaria 33,44 6,В2 6,47
Morchella esculenta 33,43 6,67 6,45
Строение ДГА-НСІ гриба А. теїіеа потверждено методом ИК-спектроскопии в сравнении с ИК-спек-тром стандартного ДГА-НСІ (табл. 3, рис. 1 и 2). Сравнение основных характеристических полос поглощения образца ДГА*НСІ гриба А. теїіеа и стандартного образца показало идентичность препаратов (табл. 3).
Таблица 3 — Данные ИК-спектра D-глюкозамин хлоргидрата, полученного из хитина различного происхождения
Xарактеристические полосы поглощения Литератур. данные, см-1 v, см-1
Arthropoda A. mellea Apis Mellifera
OH...O (связ.) 3300 ш. 3297 ш. 3301 ш. 3300
NH (связ.) 3041 сл. 3040 сл. 3042 сл. 3041
NH (дефор.) 15В3 с. 15В4 с. 15В3 с. 15В3
C-O-H 1419 ср. 1421 ср 141В ср. 1419
C-N (вал.) 1247 с. 124В с. 1247 с. 1247
C-O 1094 1094 1094 1094
C-O-C 1066 1066 1066 1066
Разработанная методика выделения ДГА'ИО из ХГК A. mellea была применена для кислотного гидролиза ХГК ряда видов высших грибов, хитина из подмора пчел (Apis Mallifera) и ракообразных
(Arthropoda).
Характеристики и элементный состав солянокислого D-глюкозамина, выделенного из хитина различного происхождения, представлены в таблице 1 и 2.
DGA* HCI хитина различного происхождения Наименование показателей Доля основного вещества, %
DGA* HCI (выход), % температура плавления, Т °С К20], ° в воде Rf
DGA * HCI(станд.) - 210-211 +72,5 0,52 9В,0
Arthropoda 6В,5 209-210 +72,5 0,53 97,В
Cantharellus ci-barius 57,В 210 +72,5 0,52 97,9
Armillariella mellea 50,5 210 +72,5 0,52 97,В
Macrolepiot. excoriate 46,В 210-211 +72,0 0,53 97,6
Lactarius rufus 42,4 210-211 +72,5 0,52 97,5
Amanita muscaria 43,7 209-210 +72,0 0,51 97,5
Suillus bovinus 40,3 210-212 +72,0 0,51 97,2
Morchella esculenta 23,В 209-210 +72,5 0,52 97,9
Apis mellifica 71,3 210 +72,5 0,52 9В,1
Выход конечного продукта составляет 20-60 % в зависимости от вида, класса и формы плодового тела высших грибов, что связано с различным содержанием хитина в ХГК. В то же время процентный выход образцов ДГА'НО хитина ракообразных (Arthropoda) и подмора пчел (Apis Mallifera) на порядок выше, и составляет 68,5 и 71,3 % соответственно. Данный факт можно объяснить тем, что из хитинсодержащей биомассы Arthropoda и Apis Mallifera выделяется чистый хитин, который не связан ковалентной связью с глюканами как в ХГК, выделяемый из биомассы высших грибов.
Обращает на себя внимание наименьший процентный выход (23,8 %) солянокислого Б-глюкозамина из ХГК гриба вида МвгсквПа атикМа (сморчок настоящий). Это можно объяснить тем, что данный вид гриба относится к классу Л&сотусе(е&', тогда как остальные вышеприведенные виды грибов относятся к классу Basidiomycetes.
Исследования показали, что температура плавления с разложением, удельное вращение и содержание основного вещества в образцах соответствует литературным данным [1; 7].
Wavenumber cm-1 Рис. 1 — ИК-спектр ДГ А ♦ HCI Armillariella mellea
Wavenumber cm-1
Рис. 2 — ИК-спектр ДГ А ♦ HCI (стандарт)
1 —Агікгоросіа; 2 -
Рис. 3 —
-Аріз теШ/гса; 3 -
ИК-спектры ДГ А ♦ НСІ из хитина различного происхождения:
- Сапікагеїіия сіЬагіт\ 4 —АгтШагіеІІа теїіеа; 5 — БиШи^ Ьоиіпиз; 6 -
-Могскейа еясиїепіа
Естественные науки
Рис. 4 — ПМР-спектр ДГА-HCI из X^ гриба вида Amanita muscaria (мухомор настоящий)
Рис. 5 — ПМР-спектр ДГ А * HCI из XTO гриба вида Morchel. esculenta (сморчок настоящий)
Степень чистоты образцов ДГА^О различного происхождения также контролировалась методом TCX на пластинках «Silufol-UV 254» в элюенте изопропанол/ацетон/0,2 М молочная кислота (6:3:1). Результаты анализа свидетельствуют о наличии в хроматографических пластинках по одному пятну для каждого образца ДГА^О, выделенных из XTK различных видов грибов, хитина ракообразных (Arthropoda) и подмора пчел (Apis Mallifera). Rf для всех образцов практически одинаков и колеблется в пределах нормы (от 0,51 до 0,53), что указывает на
нормы (от 0,51 до 0,53), что указывает на высокую степень чистоты и качества ДГА^О различного происхождения (табл. 1).
Из анализа ИК-спектров образцов ДГА^О, полученных из ХГК различных видов грибов (рис. 3, табл. 3) видно, что полосы поглощения полученных целевых продуктов идентичны полосам поглощения ДГА^О хитина ракообразных (Arthropoda) и подмора пчел (Apis Mallifera) и соответствуют литературным данным [4]. Полоса в области 3300 см-1 для
Рис. 6 — ПМР-спектр стандартного ДГА * НСІ
ДГА*ИС1 относится к валентным колебаниям ОН (межмолекулярные водородные связи полиассоциа-тов). В ИК-спектрах соединений обнаружены полосы сильной интенсивности в областях 3080-3010 см-1, 1690-1640 см-1, 1590-1520 см-1, относящиеся к различным колебаниям группы МИ.
Спектры содержат также полосы поглощения, относящиеся к группам С-О-Н и С-О-С, что также подтверждает структуру соединения [4].
Также для подтверждения чистоты и качества продуктов были сняты ПМР-спектры всех образцов ДГА*ИС1, выделенных из хитина различного происхождения, некоторые из которых представлены на рисунках 4 и 5.
Сопоставление ПМР-спектров ДГА*ИС1, выделенных из хитина различного происхождения со спектром стандартного образца ДГА*ИС1 (рис. 6), также показало полную их идентичность.
Однако, ЯМР-спектры 13С фиксируют незначительные отличия, и, на наш взгляд, могут быть использованы, в дальнейшем, для детального изучения образцов солянокислого Б-глюкозамина, полученных из хитина разного происхождения.
Таким образом, учитывая химические и физикохимические подтверждения достоверности полученных нами образцов солянокислого Б-глюкозамина, с выходами конечных продуктов, которые находятся на высоком уровне, можно сказать, что получение этого моносахарида из хитина высших грибов и подмора пчел имеет место, наряду с другими хитинсодержащими материалами.
Полученные результаты показывают принципиальную возможность препаративного получения солянокислого Б-глюкозамина высокого качества с дос-
таточно высоким выходом из хитина высших грибов и подмора пчел с применением нами разработанной методики выделения и очистки ДГА*ИС1.
Работа выполнена по гранту МарГУ, по заданию Федерального агентства по образованию (по разделу «Исследование состояния и динамики популяции растений и животных»).
Список литературы
1. Гаттерман Л., Виланд Г. Практические работы по органической химии / пер. с нем. под ред. В. М. Родионова. — М.; Л.: Гос-химиздат., 1948.
2. Ившин В. П., Артамонова С. Д., Ившина Т. Н., Шарнина Ф. Ф. Методы выделения хитин-глюканового комплекса из нативной биомассы высших грибов // Высокомолек. соед. Б. — 2007. — Т. 49. — № 12. — С. 2215.
3. Ившина Т. Н., Артамонова С. Д., Ившин В. П., Шарнина Ф. Ф. Выделение хитин-глюканового комплекса из плодовых тел шляпочных грибов // Прикл. биохимия и микробиология. — 2009. — Т. 45. — № 3. — С. 1.
4. Казицына Л. А., Куплетская Н. Б. Применение УФ-, ИК- и ЯМР-спектроскопии в органической химии. — М.: Высшая школа, 1971.
5. Костина, А. М., Бабицкая В. Г., Лобанок А. Г. Хитин мицели-альных грибов рода РешсШшш // Прикладная биохимия и микробиология. — 1978. — Т. 14. — № 4. — С. 586-593.
6. Кочетков Н. К., Бочков А. Ф., Дмитриев Б. А. Химия углеводов. — М.: Химия, 1967.
7. Лазурьевский Г. В., Терентьева И. В., Шамшурин А. А. Практические работы по химии природных соединений. — М.: Высшая школа. 1961.
8. Максимов В. И., Родоман В. Е. Колориметрический анализ гидролизатов хитина для химической характеристики их качества // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы пятой конференции. — М.; Щелково: Изд-во ВНИРО, 1999. — С. 239-241.
9. Феофилова Е. П., Терешина В. М., Меморская А. С. Хитин мицелиальных грибов: методы выделения, идентификация и физико-химические свойства // Микробиология. — 1995. — Т. 64. — № 1. — С. 27.
