CC BY
11
DOI: 10.21055/0370-1069-2022-1-77-85
УДК 616.932
В.В. Евдокимова, л.П. Алексеева, о.А. якушева, д.А. левченко, В.д. кругликов, В.П. Зюзина,
м.Э. яговкин
изучение с помощью панели мка поверхностных антигенных детерминант атипичных по АГГлЮтинАБЕльноСти штАММов VIBRIO CHOLERAE
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт», Ростов-на-Дону, Российская Федерация
цель работы - изучение поверхностных антигенных детерминант атипичных по признаку агглютинабель-ности штаммов Vibrio cholerae R-варианта с помощью иммуноферментного анализа и панели моноклональных антител (МКА). материалы и методы. Исследовано 60 штаммов V. cholerae R-варианта, выделенных из объектов окружающей среды на территориях бывшего СССР и субъектов Российской Федерации за 30-летний период (1988-2019 гг.), в реакции слайд-агглютинации с холерными диагностическими сыворотками, иммунофер-ментном анализе с использованием панели МКА к мембранным белкам и набора реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические, меченные пероксидазой хрена, сухие для серологической идентификации V. cholerae 01 и 0139 (in vitro) методом ИФА и дот-ИФА». результаты и обсуждение. Проведен анализ поверхностных структур атипичных по агглютинабельности штаммов V. cholerae R-варианта иммуноферментным методом, который показал, что среди исследуемых штаммов, идентифицированных при выделении как V. cholerae R-варианта, регистрируются отдельные штаммы с различным количеством 0-антигена (диапазон оптической плотности от 0,261±0,002 до 1,312±0,003). Эпитопы специфического 0-антигена обнаружены у части «консервативных» штаммов (30 %), агглютинирующихся только сывороткой RO, и у нескольких штаммов (20 %), которые не имеют гена wbeT, детерминирующего его синтез, и потерявших агглютинабельность со всеми диагностическими холерными сыворотками, в том числе и RO. Эпитопы белковой природы, узнаваемые комплементарными МКА, с различной частотой представлены в составе поверхностных антигенов R-вибрионов; снижение их представленности или отсутствие на поверхности клетки коррелирует с модификацией или утратой R-ЛПС и сопровождается отрицательной реакцией агглютинации.
Ключевые слова: холерный вибрион, R-вариант, агглютинабельность, моноклональное антитело, эпитоп, 0-антиген, мембранный белок OmpT, OmpU, иммуноферментный анализ.
Корреспондирующий автор: Евдокимова Вероника Вячеславовна, e-mail: nika_evd@mail.ru.
Для цитирования: Евдокимова В.В., Алексеева Л.П., Якушева О.А., Левченко Д.А., Кругликов В.Д., Зюзина В.П., Яговкин М.Э. Изучение с помощью панели МКА поверхностных антигенных детерминант атипичных по агглютинабельности штаммов Vibrio cholerae. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 1:77-85. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-1-77-85
Поступила 30.09.2021. Принята к публ. 12.10.2021.
V.V. Evdokimova, L.P. Alekseeva, O.A. Yakusheva, D.A. Levchento, V.D. Kruglikov, V.P. Zyuzina, M.E. Yagovkin
study of the surface Antigenic Determinants of Vibrio cholerae strains with Atypical Agglutinability Using the Panel of Monoclonal Antibodies
Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute, Rostov-on-Don, Russian Federation
Abstract. The aim of the work was to study surface antigenic determinants of V. cholerae R-variant strains using enzyme immunoassay and a panel of monoclonal antibodies (MAbs). Materials and methods. 60 strains of V. cholerae R-variant isolated from ambient environment objects in the territories of the former USSR and the constituent entities of the Russian Federation over a 30-year period (1988-2019) were investigated in the slide agglutination reaction with cholera diagnostic sera, enzyme immunoassay (ELISA) using the panel of MAbs specific to membrane proteins and a set of reagents "Monoclonal diagnostic immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase, dry, for serological identification of V. cholerae O1 and O139 (in vitro) through ELISA and dot-ELISA". Results and discussion. The analysis of the surface structures of V. cholerae R-variant strains with atypical agglutinability has been carried out applying enzyme immunoassay. It showed that individual strains with different amounts of O-antigen are registered among the studied strains identified at isolation as V. cholerae R-variant (the optical density range is from 0.261±0.002 to 1.312±0.003). Epitopes of specific O-antigen were found in some "conservative" strains (30 %) that are agglutinated only with RO serum, and in several strains (20 %) that do not have the wbeT gene that determines its synthesis, and lost agglutinability with all diagnostic cholera sera, including RO. The protein epitopes recognized by complementary MAbs are represented with varying frequency in the composition of surface antigens of R-vibrios; a decrease in their representation or absence on the cell surface correlates with the modification or loss of R-LPS and is accompanied by a negative agglutination reaction.
Key words: Vibrio cholerae, R-variant, agglutinability, monoclonal antibody, epitope, O-antigen, outer membrane protein OmpT, OmpU, enzyme-linked immunosorbent assay.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Veronika V. Evdokimova, e-mail: nika_evd@mail.ru.
Citation: Evdokimova V.V., Alekseeva L.P., Yakusheva O.A., Levchenko D.A., Kruglikov V.D., Zyuzina V.P., Yagovkin M.E. Study of the Surface Antigenic Determinants of Vibrio cholerae Strains with Atypical Agglutinability Using the Panel of Monoclonal Antibodies. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2022; 1:77-85. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2022-1-77-85 Received 30.09.2021. Accepted 12.10.2021.
Evdokimova V.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5522-9097 Alekseeva L.P., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9866-3579 Yakusheva O.A., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8159-7547 Levchenko D.A., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4676-0377
На сегодняшний день практические лаборатории имеют в своем распоряжении необходимый набор диагностических препаратов для идентификации возбудителя холеры. При этом расширение номенклатуры, совершенствование, улучшение качества, стандартизация диагностикумов по-прежнему остаются актуальной задачей. Существенную роль в разработке новых диагностических средств играет идентификация антигенов или их фрагментов, специфичных исключительно для Vibrio cholerae. Гибридомная технология позволяет получать панели высокоаффинных моноклональных антител (МКА) к отдельным эпитопам (в отличие от поликлональных сывороток) диагностически значимых антигенов холерных вибрионов. В настоящее время в Росздравнадзоре зарегистрированы следующие диагностические тест-системы на основе мкА для экспресс-диагностики холеры: «Тест-полоска V. cholerae O1» (ГНЦ ПМБ, г. Оболенск) [1], «Иммуноглобулины моноклональ-ные диагностические флуоресцирующие сухие для серологической идентификации Vibrio cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РИФ «Иг - V. cholerae О1/ О139 - РИФ» (Ростовский-на-Дону противочумный институт) [2], «Иммуноглобулины моноклональные диагностические сухие для серологической идентификации V. cholerae о1 и о139 (in vitro) методом РА «ИГ - V. cholerae О1/О139 - РА» (Ростовский-на-Дону противочумный институт) [3], «Тест-полоска V. cholerae tox+» (ГНЦ ПМБ, г. Оболенск) [4], «Тест-система иммуноферментная для определения продукции холерного токсина штаммами V. cholerae (ИФАХолХТ-М)» (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов) [5], которые могут быть использованы в практическом здравоохранении.
Несмотря на то, что различные варианты имму-ноферментного метода не включены в схему лабораторной диагностики холеры, применение монокло-нальных пероксидазных конъюгатов в иммунофер-ментном анализе (ИФА) и дот-ИФА представляется перспективным в ходе мониторинга воды поверхностных водоемов для обнаружения представителей V. cholerae О1, О139, количественной оценки специфического О-антигена, серологической характеристики типичных и атипичных штаммов, поскольку из объектов окружающей среды наряду с типичными могут выделяться штаммы холерных вибрионов, атипичные по серологическим свойствам, в том числе со сниженной агглютинабельностью холерными диагностическими сыворотками [6-10]. Так, например, в 2006 г. выделение атипичных по антигенному составу штаммов отмечалось на территории десяти административных районов Российской
Kruglikov V.D., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6540-2778 Zyuzina V.P., ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3100-0049 Yagovkin M.E., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8414-4965
Федерации. Среди выделенных культур 28,6 % составляли культуры со сниженной агглютинабельно-стью, неопределяемым сероваром и RO-варианты. А.А. Мошкина [11] при изучении свойств забайкальских штаммов холерных вибрионов 01 отмечает атипичные штаммы с неустойчивыми свойствами: при первичной изоляции культуры обладают агглютинабельностью до титра диагностической холерной сывороткой 01, а при последующих пересевах титр агглютинации резко снижается вплоть до отсутствия агглютинации, вследствие чего установлена серологическая принадлежность к холерным вибрионам поп01/поп0139 серогруппы. Кроме того, может наблюдаться диссоциация культур и появление R-колоний. Атипичные по серологическим признакам культуры холерных вибрионов изучались с помощью моноклональных антител в различных серологических методах: МКА, направленные к эпито-пам 0-боковой цепи, узнавали сходные детерминанты у типичных и тех атипичных вибрионов, которые агглютинировались до 1/4 титра 0-сывороткой и в низких титрах - RO-сывороткой [12].
В случае пребывания холерного вибриона в неблагоприятных условиях окружающей среды изменению подвергаются прежде всего боковые полиса-харидные цепи липополисахарида (ЛПС), отвечающие за серологическую специфичность холерных вибрионов. В процессе перехода штаммов Огава в Инаба боковые цепи частично или полностью редуцируются, в итоге наблюдается снижение или утрата агглютинабельности, либо ее наличие только с сывороткой Инаба/Инаба и R0, или переход в R-варианты. У холерных вибрионов мутации
сопровождаются утратой квиновозамина и пероза-мина (сахаров, характерных для S-форм холерного вибриона) и потерей О-специфичности [13]. При изучении серологической дивергенции возбудителя холеры с помощью панели моноклональных антител, специфичных к детерминантам наружной клеточной стенки V. с^1ете 01, обнаружены различия между представителями сероваров Инаба и Огава в отношении антигенов белковой природы, хотя ранее предполагалось, что сероконверсия холерного вибриона 01 серогруппы из 0гава в Инаба обусловлена главным образом модификацией ЛПС [14]. В лаборатории гибридом Ростовского-на-Дону противочумного института получена и охарактеризована панель МКА, направленных к детерминантам полисахаридной и белковой природы V. сЫ1ете 01, 0139. На базе лаборатории сконструированы на основе МКА пе-роксидазные конъюгаты, используемые в реакциях ИФА и дот-ИФА.
целью исследования явилось изучение поверхностных антигенных детерминант атипичных по признаку агглютинабельности штаммов V. cholerae R-варианта с помощью иммуноферментного анализа и панели МКА.
материалы и методы
Штаммы микроорганизмов. В работе использовали 60 штаммов V. cholerae R-варианта, полученных из коллекции Музея живых культур института. Взвеси холерных вибрионов готовили в 0,9 % растворе хлорида натрия (рН 7,2±0,1) по стандартным образцам мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (в настоящее время - ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России) 10 единиц (0С0 42-28-85П) соответствующего года выпуска, эквивалентных концентрации 1109 м.к./мл. Взвеси культур инактивировали на водяной бане в течение 30 минут.
Реакция агглютинации. Серологическую идентификацию холерных вибрионов проводили в реакции агглютинации (РА) с серогрупповой (01), серова-роспецифическими (0гава и Инаба) и RO диагностическими холерными сыворотками [МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры»].
Подъем гибридом из жидкого азота. При размораживании клеток гибридом криопробирку помещали на 1-2 минуты на водяную баню при 37 °С, добавляли 10-кратный объем теплой культуральной среды, аккуратно перемешивали и центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в культуральной среде RPMI-1640 («БиолоТ», Россия), содержащей 15 % сыворотки плода коровы (HyClone, США), определяли жизнеспособность, концентрацию клеток в тесте с трипановым синим и вносили их в лунки культу-ральных панелей с заранее подготовленным фидерным слоем [15].
Культивирование гибридом in vitro. Культивирование гибридом проводили с использованием стерильных сред и стерильной культуральной посуды, применяли антибиотики, а все манипуляции с клетками проводили в ламинарном боксе (Lamsystems, Россия) с принудительной подачей стерильного воздуха. По мере роста и тиражирования гибридных клонов in vitro производили перенос части клеток в лунки больших объемов (с макрофагами), контролируя антителопродукцию с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА). Смену среды культивирования (половину объема) производили через каждые 2-3 суток. После восстановления криоконсервированных гибридных клонов их пересевали в чашки Петри и культураль-ные флаконы емкостью 50-100 мл и культивировали при 37 °С в С02-инкубаторе. Морфологию клеток оценивали под инвертированным микроскопом, ан-тителообразующую способность и активность антител в культуральной среде - в ТИФА.
Препараты моноклональных антител. Источником МКА служили культуральные жидкости, накопленные при многократном пассировании in vitro гибридом-продуцентов H2F6, A5D8, G3F5, E5F5. Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных жидкостей осуществляли преципитацией сульфатом аммония [16] с последующим диализом. В полученных препаратах определяли концентрацию белка методом Лоури, равную 2-5 мг/мл. Для выявления 01-антигена холерных вибрионов использовали экспериментальный набор реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические, меченные пероксидазой хрена, сухие для серологической идентификации V. cholerae 01 и 0139 (in vitro) методом ИФА и дот-ИФА» (ТУ и акт внедрения от 02.09.2016 № 1041/1-16-10).
Иммуноферментный анализ. Постановку прямого и непрямого твердофазного иммунофермент-ного анализа в полистироловых планшетах осуществляли по общепринятой методике [16]. При постановке непрямого ТИФА использовали антимышиный пероксидазный конъюгат (HRP-Goat-Anti-Mouse, Invitrogen, США). В качестве хромогена использовали 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (AppliChem, германия). 0птическую плотность измеряли на спектрофотометре BioTek EL*800 (BioTek Instruments, США) при длине волны 450 нм (референс-волна -630 нм). Результаты считали положительными, если значение D450 исследуемого образца в 2 раза и более превосходило среднее значение D450 отрицательных контролей.
Статистическая обработка результатов.
Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью программы Microsoft Excel (Microsoft Office 2003). При анализе и обобщении результатов планшетного ТИФА использованы параметрические статистические методы: вычисляли среднюю арифметическую, стандартную ошибку средней арифметической (P<0,05).
результаты и обсуждение
Известно, что поверхностные структуры клетки играют ключевую роль в процессе адаптации холерных вибрионов к условиям окружающей среды, в результате чего появляются штаммы с измененной антигенной структурой, в том числе и неагглюти-набельные. В связи с этим интерес представляло изучение антигенного состава атипичных по агглю-тинабельности штаммов холерных вибрионов. Всего в исследование взяли 60 штаммов, выделенных из объектов окружающей среды на территориях бывшего СССР и субъектов Российской Федерации за 30-летний период (1988-2019 гг.), которые ранее были идентифицированы как эпидемически неопасные (нетоксигенные) штаммы V. cholerae R-варианта. Все штаммы исследованы в реакции агглютинации с холерными диагностическими серогрупповыми и серовароспецифическими сыворотками (01, 0139,
0гава, Инаба и RO) и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью детекции участков кластера м>Ье-01, генов с^А, 1срА [17]. Применение такого чувствительного метода, как иммуноферментный анализ, является эффективным в диагностике глубоко измененных по антигенной структуре штаммов холерных вибрионов. для ответа на вопрос, как часто в составе поверхностных структур R-вибрионов встречаются эпитопы, специфичные для S-вибрионов, мы использовали панель МКА, полученных к типичным холерным вибрионам 01-серогруппы. В ходе работы для оценки представленности специфических антигенных детерминант на поверхности атипичных по признаку агглютинабельности штаммов V. с^1егае R-варианта сначала проводили детекцию 0-полисахарида в ТИФА с помощью пероксидазно-го конъюгата МКА-01. Результаты представлены в табл. 1. По признаку агглютинабельности исследуемые штаммы мы разделили на шесть групп.
Как видно, эпитопы 0-антигена обнаружены у всех представленных групп штаммов, в том числе у штаммов, агглютинирующихся только RO-сывороткой (табл. 1, № п/п 5), и штаммов, не агглютинирующихся ни одной из диагностических сывороток (табл. 1, № п/п 6). 0тсутствие гена м>ЬеТ и в то же время способность некоторых штаммов 5-й и 6-й группы взаимодействовать с МКА-01 может указывать на то, что у S- и R-штаммов имеются общие детерминанты 0-антигена ^-антигена), не кодирующиеся геном м>ЬеТ. Более того, показатели оптической плотности (0П) (0,360±0,004 - 0,465±0,010) позволяют говорить о низкой частоте представленности эпитопов, выявляемых соответствующими им МКА, и регистрировать их наличие на поверхности R-вибрионов можно только с помощью высокочувствительного ТИФА. В 1-й, 3-й, 4-й группах большая часть штаммов вступала в реакцию с МКА-01 (диапазон 0П: 0,261±0,015 - 1,312±0,012), что сви-
Таблица 1 / Table 1
серологическая активность штаммов V. cholerae R-варианта Serological activity of V. cholerae R-variant strains
№ п/п Количество штаммов Агглютинабельность холерными сыворотками Agglutinability with cholera sera Генетическая характеристика Genetic profile Реакция в ТИФА с ПХ МКА-О1 (кол-во штаммов) Диапазон ОП Range of optical density
No. Number of strains OI O1 огава Ogawa Инаба Inaba RO RO Results in ELISA with HP MAb-O1 (number of strains)
ctxA-tcpA-wbeT- «+» (1) 0,261±0,015
1 10 + + ctxA-tcpA-wbeT+ «+» (7) (0,489±0,01)-ь (1,002±0,013)
ctxA+tcpA+wbeT+ «+» (2) (0,635±0,011)-ь (0,701±0,023)
«+» (1) 0,697±0,014
2 3 + - + - ctxA-tcpA-wbeT+ «-» (2) (0,078±0,02)^ (0,088±0,005)
3 4 + + + ctxA-tcpA-wbeT+ «+» (3) (0,351±0,03)^ (1,312±0,012)
ctxA+tcpA+wbeT+ «+» (1) 0,716±0,005
ctxA-tcpA-wbeT- «+» (1) 0,275±0,02
4 5 + - - - ctxA-tcpA-wbeT+ «+» (3) (0,334±0,005)^ (1,008±0,004)
ctxA-tcpA+wbeT+ «+» (1) 0,687±0,01
5 22 + ctxA tcpA wbeT- «+» (7) (0,329±0,01)-ь (0,841±0,022)
«-» (15) (0,074±0,12)^ (0,095±0,022)
ctxA tcpA wbeT- «+» (3) (0,360±0,004)-ь (0,465±0,01)
6 14 - - - - «-» (3) (0,077±0,005)^ (0,085±0,01)
ctxA-tcpA-wbeT+ «-» (8) (0,088±0,005)-ь (0,097±0,014)
к+ 1,453±0,01
к- 0,053±0,013
Примечание: в табл. 1 представлены средние значения оптических плотностей (ОП) и стандартное отклонение P<0,05; К+ (положительный контроль); К- (отрицательный контроль). ПХ - пероксидаза хрена.
Note: the table 1 shows the average values of optical densities and the standard deviation P<0,05; K+ (positive control); K- (negative control). PH - horseradish peroxidase.
Таблица 2 / Table 2
специфическая активность препаратов мкА в непрямом ТифА Specific activity of MAb preparations in indirect ELISA
< -s Титр, 0П Titer, OD
1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000
H2F6 1,420±0,02 1,174±0,01 1,181±0,01 1,100±0,004 1,026±0,025 0,901±0,003
A5D8 1,560±0,03 1,302±0,022 1,195±0,01 1,032±0,02 0,920±0,012 0,815±0,01
G3F5 1,597±0,012 1,415±0,015 1,221±0,023 1,097±0,015 1,050±0,015 0,846±0,02
E5F5 1,519±0,02 1,306±0,011 1,138±0,011 1,101±0,014 1,024±0,01 0,808±0,015
К+ (положительный контроль/positive control) 1,635±0,03
К- (отрицательный контроль/negative control) 0,047±0,01
Примечание: в табл. 2 представлены средние значения оптических плотностей (0П) и стандартное отклонение P<0,05; К+ (положительный контроль); К- (отрицательный контроль); 0П - оптическая плотность.
Note: the table 2 shows the average values of optical densities (OD) and the standard deviation P<0.05; K+ (positive control); K- (negative control); OD - optical density.
детельствовало, наряду с наличием гена wbeT и аг-глютинабельности холерными диагностическими серогрупповыми и сероварспецифическими сыворотками (01, 0гава, Инаба), об их принадлежности к 01-серогруппе. Во 2-й группе два из трех штаммов, агглютинирующихся сывороткой Инаба, не вступали в реакцию с МКА-01, что обусловлено, скорее всего, утратой или частотой встречаемости концевых антигенных детерминант боковых цепей ЛПС, которые у штаммов Инаба более короткие, и чаще наблюдается их модификация при неблагоприятных воздействиях. Пятая группа, условно названная «консервативной» и обозначенная как R-вариант, включала штаммы, которые агглютинируются только сывороткой холерной RO от 1/2 диагностического титра и у которых отсутствует ген wbeT; в этой группе у 7 из 22 штаммов (30 %) обнаружены эпитопы 0-антигена (диапазон 0П: 0,329±0,01 - 0,841±0,022), судя по взаимодействию с МКА. Принимая во внимание положительную реакцию отдельных R-вариантов с МКА-01, можно предположить, что геномная область биосинтеза 01-антигена сохраняется у этих «консервативных» R-штаммов, возможно, в измененной форме, что требует дальнейших молекулярно-генетических исследований. В 6-ю группу включены штаммы, которые потеряли способность агглютинироваться диагностическими холерными сыворотками, в том числе RO, несмотря на то, что часть из них содержит ген wbeT, но только с помощью МКА в ТИФА у 3 из 14 (20 %) штаммов обнаружены эпитопы 01-антигена.
Мы располагали панелью МКА, стабильно продуцирующих специфические иммуноглобулины к мембранным белкам холерных вибрионов 01-, 0139-серогрупп [18]. Для приготовления препаративных количеств МКА клетки гибридом H2F6, A5D8, G3F5, E5F5 размораживали и тиражировали in vitro. 0ценку интенсивности антителопродукции проводили с помощью тестирования в ТИФА образцов среды из лунок с гибридомами. После накопления культуральных жидкостей проводили выделение
иммуноглобулинов методом сульфатаммонийного осаждения (при 50 % насыщения). С помощью непрямого ТИФА установили специфическую активность каждого препарата МКА (табл. 2). В качестве антигена (сенситина) использовали обеззараженную бактериальную взвесь V. cholerae El Tor 18826 (ctxA+, tcpA+). Для работы препараты МКА использовали в рабочем разведении 1:4000 - 1:8000.
Эпитопную направленность МКА определяли в иммуноблоттинге, используя лизаты клеток холерных вибрионов (рисунок). В результате обработки мембраны МКА H2F6 и G3F5 специфические белковые полосы обнаружены на уровне маркерных белков 38-42 кДа у штамма V. cholerae El Tor 18826 (ctxA+ tcpA+), при инкубации мембраны
250 1 2 1 2 1 2 1 . 2
100
50_
ijguu >
25
20_
10
метч. H2F6 G3R5 A5D8 Dl i
Иммуноблоттинг МКА H2F6, G3F5, E5F5, A5D8 с бактериальными лизатами:
1 - V. cholerae El Tor 18826 (ctxA+ tcpA+); 2 - V. cholerae El Tor 18512 (ctxA- tcpA-)
Immunoblotting of MAb H2F6, G3F5, E5F5, A5D8 with bacterial lysates:
1 - V. cholerae El Tor 18826 (ctxA+ tcpA+); 2 - V. cholerae El Tor 18512 (ctxA- tcpA-)
с МКА A5D8 - у штаммов V. cholerae El Tor 18826 (ctxA+ tcpA+) и V. cholerae El Tor 18512 (ctxA- tcpA-), что подтверждает установленную ранее эпитопную направленность МКА: H2F6 и G3F5 специфичны к эпитопам белка наружной мембраны OmpT (40 кДа), A5D8 - OmpU (38 кДа) [18]. При обработке мембраны МКА D6 выявляются антигенные детерминанты, соответствующие белковой полосе с молекулярной массой 60-65 кДа.
Полученные препараты МКА использовали в непрямом ТИФА для изучения спектра мембранных белков у штаммов V. cholerae El Tor, V. cholerae О139, V. cholerae R-варианта. Результаты представлены в табл. 3.
Как видно, детерминанты мембранного белка OmpU, выявляемые МКА A5D8, представлены у всех исследуемых штаммов. По-видимому, этот мембранный порин является стабильным и консервативным антигеном, который остается неизменным даже при условии попадания холерных вибрионов в неблагоприятную среду и на этапе их перехода из S- в R-форму. Более того, может происходить увеличение биосинтеза белка OmpU, в частности у штаммов геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор при высокой температуре (42 °С), что является одним из механизмов их адаптации к действию теплового стресса [19]. МКА H2F6, G3F5 выявляют специфические эпитопы мембранного белка OmpT у tcpA+ штаммов холерных вибрионов О1, О139, а среди R-вибрионов - как у tcpA+, так и у tcpA- штаммов (табл. 3, № п/п 6-9). МКА D6 обнаруживает «свои» эпитопы у всех взятых в исследование штаммов V. cholerae El Tor, О139, а среди штаммов V. cholerae
R-вариант - у большей части (82 %). Спектр поверхностных антигенных детерминант выборки штаммов представлен в табл. 4.
Анализ результатов ТИФА, полученных при исследовании 60 штаммов холерных вибрионов, отличающихся по признаку агглютинабельности, показал разнообразие представленности эпитопов на их поверхности. Так, все штаммы, агглютинирующиеся сыворотками 01 и серовароспецифической 0гава и Инаба, вступали в реакцию с МКА 01, направленными к 0-антигену, т.е. они равноценны по-ликлональной 01 сыворотке. Эти же штаммы взаимодействовали со всеми МКА, узнающими «свои» детерминанты в составе поверхностных белковых антигенов. Что касается штаммов, агглютинирующихся R0-сывороткой, то среди них лишь небольшая часть имела детерминанты мембранного белка ОтрТ (40 кДа), узнаваемые МКА H2F6, и единичные эпитопы 0-антигена, подтверждение тому - низкие значения 0П в ИФА. Частота встречаемости эпито-пов мембранных белков у штаммов, не агглютинирующихся ни одной из диагностических сывороток, была минимальной.
В неблагоприятных условиях среды обитания холерный вибрион использует несколько стратегий адаптации: формирование сложных сообществ микробных клеток - биопленок, переход в некультиви-руемое (покоящееся) состояние, трансформация в «персистирующий» фенотип [20-25]. Это приводит к появлению атипичных по фенотипическим признакам штаммов - от морфологии клеток и колоний до ослабления и утраты агглютинабельности холерными диагностическими серогрупповыми
Таблица 3 / Table 3
Взаимодействие штаммов V. cholerae El Tor, V. cholerae о139, V. cholerae R-варианта с мкА в ТифА Interaction of V. cholerae El Tor, V. cholerae O139, V. cholerae R-variant strains with MAb in ELISA
№ п/п No. Количество исследованных штаммов Number of strains Бактериальные штаммы Bacterial strains МКА (положительная реакция, количество штаммов) MAb (positive reaction; number of strains)
H2F6 A5D8 G3F5 D6
1 8 V. cholerae El Tor ctxA+tcpA+ 8 8 7 8
2 8 V. cholerae El Tor ctxA- tcpA+ 8 8 7 8
3 8 V. cholerae El Tor ctxA- tcpA- 0 8 0 8
4 5 V. cholerae 0139 ctxA+ tcpA+ 5 5 4 5
5 6 V. cholerae 0139 ctxA- tcpA- 0 6 1 6
6 3 V. cholerae R-вариант ctxA+tcpA+ wbeT+ (вода/water) 3 3 2 3
7 1 V. cholerae R-вариант ctxA+ tcpA+ wbeT+ (человек/patient) 1 1 1 1
8 16 V. cholerae R-вариант ctxA- tcpA- wbeT+ (вода/water) 1 16 14 16
9 40 V. cholerae R-вариант ctxA- tcpA- wbeT- (вода/water) 3 40 27 29
Таблица 4 / Table 4
оценка методом ТифА спектра поверхностных антигенных детерминант у атипичных по признаку агглютинабельности штаммов
V. cholerae R-варианта
Evaluation of the spectrum of surface antigenic determinants in V. cholerae R-variant strains with atypical agglutinability using ELISA
№ п/п No. Штамм V. cholerae R-варианта V. cholerae R-variant strains Агглютинабельно сть холерными сыворотками Agglutinability with diagnostic cholera sera Генетическая характеристика Genetic profile F8G12 (MKA-O1) F8G12 (MAb-O1) H2F6 A5D8 G3F5 D6
1 13918 01(1/2 ДТ), Огава (1/2 ДТ) O1(1/2 DT), Ogawa (1/2 DT) ctxA+tcpA+wbeT+ + + + + +
2 17569 О1(ДТ) O1 (DT) ctxA-tcpA+wbeT+ + + + + +
3 17572 О1(1/4 ДТ), Инаба (ДТ) O1(1/4 DT) Inaba(DT) ctxA-tcpA- wbeT+ + - + - +
4 13910 RO (ДТ) RO (DT) ctxA- tcpA- wbeT- - + + - +
5 1б290 RO (ДРТ) RO (DWT) ctxA- tcpA- wbeT- - - + - +
б 18138 RO (1/2ДТ) RO (1/2 DT) ctxA- tcpA- wbeT- - - + - +
7 13902 отриц. negative ctxA- tcpA- wbeT- - - + - +
8 1890б отриц. negative ctxA- tcpA- wbeT- - - + - -
9 18500 отриц. negative ctxA- tcpA- wbeT- - - + - -
Примечание: ДТ - диагностический титр сыворотки.
Note: DT - diagnostic titer of the serum.
(01, 0139) и вариантоспецифическими (Инаба и Огава) сыворотками - или агглютинирующихся RO-сывороткой в различных сочетаниях с ними. При идентификации атипичных по агглютинабельности холерных вибрионов 01, т.е. штаммов V. с^1егае R-вариантов, следует учитывать, что они представляют собой форму антигенной изменчивости данных микроорганизмов. Основу внешней антигенной мозаики R-вариантов составляет R-ЛПC, и все воздействия, которым подвергается микробная клетка, в первую очередь отражаются на структуре R-core, обусловливая его значительные вариации по терминальным моносахаридам. Анализ с помощью панели МКА поверхностных структур атипичных по агглютинабельности штаммов V. с^1егае R-варианта в иммуноферментном методе показал, что среди штаммов, идентифицированных при выделении как V. ^о1егае R-варианта, регистрируются отдельные культуры с различным количеством 0-антигена (диапазон оптической плотности - от 0,261±0,002 до 1,312±0,003). Эпитопы специфического О-антигена обнаружены у небольшой части «консервативных» штаммов (30 %), агглютинирующихся только сывороткой RO, и у нескольких штаммов (20 %), которые не имеют гена wbeT, детерминирующего его синтез, и потерявших агглютинабельность со всеми
диагностическими холерными сыворотками, в том числе и RO, и такие варианты холерных вибрионов безусловно требуют дальнейшего изучения. Эпитопы мембранных белков 38-42 и 60-65 кДа, узнаваемые комплементарными мкА, с различной частотой представлены в составе поверхностных антигенов штаммов V. с^1егае, взятых в исследование. Результаты ТИФА показали, что снижение их представленности или отсутствие на поверхности клетки коррелируют с модификацией или утратой R-ЛПC и сопровождаются отрицательной реакцией агглютинации. Вполне вероятно, что они находятся в ассоциации с R-ЛПC, образуя белково-полисахаридный комплекс. для решения вопросов, касающихся антигенных отличий типичных и атипичных вибрионов, повышения точности и достоверности идентификации последних, представляется целесообразным углубленное изучение генов, детерминирующих синтез О- и R-ЛПC, их экспрессии и возможности обнаружения этих полисахаридов с помощью современных иммунологических методов на основе специфических поликлональных сывороток и МКА.
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
список литературы
1. Алексеева Л.П., Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Храмов М.В., Кругликов В.Д., Агафонова В.В., Фатеева О.Ф., Чеботарев Д.А., Керманов А.В. Сравнительная оценка методов дот-иммуноанализа и иммунохроматографии при выявлении холерных вибрионов 01 серогруппы. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; 6:88-93.
2. Кретенчук О.Ф., Алексеева Л.П., Маркина О.В., Козлова Г.А, Яговкин М.Э., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. Оптимизация условий получения диагностических флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для идентификации холерных вибрионов О1- и О139-серогрупп. Клиническая лабораторная диагностика. 2012; 12:32-4.
3. Алексеева Л.П., Кругликов В.Д., Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Евдокимова В.В., Авдеева Е.П., Фатеева О.Ф., Яговкин М.Э. Идентификация холерных вибрионов О1 и О139 серо-групп с помощью моноклональных антител и реакции слайд-агглютинации. Клиническая лабораторная диагностика. 2010; 11:53-6.
4. Баранова Е.В., Ветчинин С.С., Шевяков А.Г., Соловьев П.В., Миронова Л.В., Пономарева А.С., Басов Е.А., Хунхеева Ж.Ю., Кругликов В.Д., Алексеева Л.П., Бикетов С.Ф. Конструирование иммунохроматографического теста на основе моноклональных антител для выявления холерного токсина. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2020; 16(2):18-26.
5. Михеева Е.А., Девдариани З.Л., Осина Н.А., Щербакова С.А. Определение холерного токсина у штаммов V. cholerae в иммуноферментном анализе с использованием моноклональных антител. Биозащита и биобезопасность. 2014; 6(4):38-42.
6. Хайтович А.Б. Биологические свойства Vibrio cholerae как составная часть эпиднадзора за холерой. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2001; 1:5-9.
7. Марамович А.С., Урбанович Л.Я., Куликалова Е.С., Шкаруба ТТ. Роль и значение поверхностных водоемов в становлении и развитии VII пандемии холеры. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2009; 2:21-5.
8. Иванова С.М., Титов Г.В., Безсмертный В.Е., Титова С.В., Кругликов В.Д., Москвитина Э.А., Архангельская И.В., Ежова М.И., Кудрякова Т.А., Зубкова Д.А., Водопьянов С.О., Водопьянов А.С. Информация о биологических свойствах холерных вибрионов О1 серогруппы, изолированных из объектов окружающей среды и от людей на территории российской Федерации в 2014 году. В кн.: Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы проблемной комиссии. Вып. 28. Ростов н/Д; 2015. С. 67-70. {Электронный ресурс]. URL: http:// antiplague.ru/wp-content/uploads/2015/06/Cholera-28-2015.pdf (дата обращения 28.09.2021).
9. Яшкулов К.Б., Каляева Т.Б., Оброткина Н.Ф., Тюнникова В.Д., Дандаева Б.В. О свойствах культур холерных вибрионов О1, выделенных из воды открытых водоемов Республики Калмыкия в период с 2012-2014 гг. В кн.: Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы проблемной комиссии. Вып. 28. Ростов н/Д; 2015. С. 71-5. [Электронный ресурс]. URL: http://antiplague.ru/wp-content/uploads/2015/06/Cholera-28-2015. pdf (дата обращения 28.09.2021).
10. Иванова С.М., Иванников В.В., Мискинова Т.А., Лопатин А.А, Титова С.В., Кругликов В.Д., Москвитина Э.А., Архангельская И.В., Левченко Д.А., Чемисова О.С., Гаевская НЕ., Ежова М.И., Непомнящая Н.Б. Информация о биологических свойствах холерных вибрионов О1 серогруппы, изолированных из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации в 2017 году. В кн.: Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник статей проблемной комиссии. Вып. 31. Ростов н/Д; 2018. С. 48-51. [Электронный ресурс] URL: http://antiplague.ru/wp-content/uploads/2019/01/ СБОРН 31.pdf (дата обращения 28.09.2021).
11. Мошкина А.А. Свойства забайкальских штаммов холерных вибрионов О1, выделенных за последние пять лет. В кн.: Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник статей Проблемной комиссии. Вып. 32. Ростов н/Д; 2019. С. 110-112. [Электронный ресурс]. URL: http://antiplague.ru/wp-content/ uploads/2019/11/Холера-и-патогенные-для-человека-вибрионы-выпуск-32.pdf (дата обращения 28.09.2021).
12. Алексеева Л.П., Черепахина И.Я., Сальникова О.И., Бурлакова О.С. Изучение антигенных взаимосвязей типичных и R-форм холерных вибрионов на основе моноклональных антител. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.
1998; 4:9-12.
13. Hisatsune K., Hayashi M., Haishima Y., Kondo S. Relationship between structure and antigenicity of O1 Vibrio cholerae lipopolysaccharides. J. Gen. Microbiol. 1989; 135(7):1901-07. DOI: 10.1099/00221287-135-7-1901.
14. Kaper J.B., Morris J.G. Jr, Levine M.M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1):48-86. DOI: 10.1128/CMR.8.1.48.
15. Кэтти Д., редактор. Антитела. Методы. Кн. 1. М.: Мир; 1991. 287 с.
16. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк.; 1991. 288 с.
17. Левченко Д.А., Архангельская И.В., Кругликов В.Д., Подойницына О.А. Атипичность штаммов Vibrio cholerae О1 по признаку агглютинабельности. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020; 97(5):482-91. DOI: 10.36233/0372-9311-2020-97-5-10.
18. Евдокимова В.В., Алексеева Л.П., Кретенчук О.Ф., Кругликов В.Д., Архангельская И.В., Бурша О.С. Моноклональ-ные антитела к термостабильным поверхностным антигенам холерных вибрионов О1- и О139-серогруппы. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2015; 3:51-7.
19. Заднова С.П., Агафонов Д.А., Шашкова А.В., Смирнова Н.И. Сравнительная устойчивость типичных и генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара El Tor к действию неблагоприятных факторов внешней среды. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014; 2:11-7.
20. Миронова Л.В. Современные представления о закономерностях эпидемического процесса при холере: экологические и молекулярно-биологические аспекты. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2018; 23(5):242-50. DOI: 10.18821/1560-95292018-23-5-242-250.
21. Куликалова Е.С., Урбанович Л.Я., Саппо С.Г., Миронова Л.В., Марков Е.Ю., Мальник В.В., Корзун В.М., Миткеева С.К., Балахонов С.В. Биопленка холерного вибриона: получение, характеристика и роль в резервации возбудителя в водной окружающей среде. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2015; 1:3-11.
22. Silva A.J., Benitez J.A. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016; 10(2):e0004330. DOI: 10.1371/journal.pntd.0004330.
23. Jubair M., Morris J.G. Jr, Ali A. Survival of Vibrio cholerae in nutrient-poor environments is associated with a novel "persister" phenotype. PLoS One. 2012; 7(9):e45187. DOI: 10.1371/journal. pone.0045187.
24. Wu B., Liang W., Kan B. Growth phase oxygen, temperature and starvation affect the development of viable but non-cultur-able state of Vibrio cholerae. Front Microbiol. 2016; 7:404. DOI: 10.3389/fmicb.2016.00404.
25. Lutz C., Erken M., Noorian P., Sun S., McDougald D. Environmental reservoirs and mechanisms of persistence of Vibrio cholerae. Front. Microbiol. 2013; 4:375. DOI: 10.3389/ fmicb.2013.00375.
References
1. Alekseeva L.P., Telesmanich N.R., Lomov Yu.M., Khramov M.V., Kruglikov V.D., Agafonova V.V., Fateeva O.F., Chebotarev D.A., Kermanov A.V. [Comparative evaluation of dot-immunoassay and immunochromatography in the detection of Vibrio cholerae O1 serogroup]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [JournalofMicrobiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2010; (6):88-93.
2. Kretenchuk O.F., Alekseeva L.P., Markina O.V., Kozlova G.A., Yagovkin M.E., Kruglikov V.D., Arkhangel'skaya I.V. [Optimization of conditions for obtaining diagnostic fluorescent monoclonal immunoglobulins for the identification of Vibrio cholerae O1- and O139-serogroups]. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika [Clinical Laboratory Diagnostics]. 2012; (12):32-4.
3. Alekseeva L.P., Kruglikov V.D., Telesmanich N.R., Lomov Yu.M., Evdokimova V.V., Avdeeva E.P., Fateeva O.F., Yagovkin M.E. [Identification of cholera vibrios of O1 and O139 serogroups using monoclonal antibodies and slide-agglutination reaction]. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika [Clinical Laboratory Diagnostics]. 2010; (11):53-6.
4. Baranova E.V., Vetchinin S.S., Shevyakov A.G., Solov'ev P.V., Mironova L.V., Ponomareva A.S., Basov E.A., Khunkheeva Zh.Yu., Kruglikov V.D., Alekseeva L.P., Biketov S.F. [Designing an immune-chromatographic test based on monoclonal antibodies to detect cholera toxin]. Vestnik Biotekhnologii i Fiziko-Himicheskoi Biologii Imeni Yu.A. Ovchinnikova [Bulletin of Biotechnology and Physical-Chemical Biology Named after Yu.A. 0vchinnikovT72020; 16(2):18-26.
5. Mikheeva E.A., Devdariani Z.L., Osina N.A., Shcherbakova S.A. [Detection of cholera toxin in V. cholerae strains in enzyme immunoassay using monoclonal antibodies]. Biozashchita i Biobezopasnost' [Biosecurity andBiosafety]. 2014; 6(4):38-42.
6. Khaitovich A.B. [Biological properties of Vibrio cholerae as an integral part of cholera surveillance]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2001; (1):5-9.
7. Maramovich A.S., Urbanovich L.Ya., Kulikalova E.S., Shkaruba T.T. [The role and importance of surface water bodies in the emergence and development of the VII cholera pandemic]. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni [Epidemiology and Infectious Diseases]. 2009; (2):21-5.
8. Ivanova S.M., Titov G.V., Bezsmertny V.E., Titova S.V., Kruglikov V.D., Moskvitina E.A., Arkhangel'skaya I.V., Ezhova M.I., Kudryakova T.A., Zubkova D.A., Vodop yanov S.O., Vodop'yanov A.S. [Information on biological properties of cholera vibrios of O1 serogroup, isolated from environmental objects and from patients on the territory of the Russian Federation in
and Pathogenic for Humans Vibrios. Proceedings of the Problem Commission]. Issue 28. Rostov-on-Don; 2015. P. 67-70. (Cited 28 Sept 2021). [Internet]. Available from: http://antiplague.ru/wp-con-tent/uploads/2015/06/Cholera-28-2015.pdL
9. Yashkulov K.B., Kalyaeva T.B., Obrotkina N.F., Tyunnikova V.D., Dandaeva B.V. [Regarding the properties of cholera vibrio O1 cultures isolated from the water of surface reservoirs of the Republic of Kalmykia in 2012-2014]. In: [Cholera and Pathogenic for Humans Vibrios. Proceedings of the Problem Commission]. Issue 28. Rostov-on-Don; 2015. P. 71-5. (Cited 28 Sept 2021). [Internet] Available from: http://antiplague.ru/wp-content/uploads/2015/06/Cholera-28-2015.pdf.
10. Ivanova S.M., Ivannikov V.V., Miskinova T.A., Lopatin A.A., Titova S.V., Kruglikov V.D., Moskvitina E.A., Arkhangel'skaya I.V., Levchenko D.A., Chemisova O.S., Gaevskaya N.E., Ezhova M.I., Nepomnyashchaya N.B. [Information about biological properties of cholera vibrios of O1 serogroup isolated from environmental objects on the territory of the Russian Federation in 2017]. In: [Cholera and Pathogenic for Humans Vibrios. Proceedings of the Problem Commission]. Issue 31. Rostov-on-Don; 2018. P. 48-51. (Cited 28 Sept 2021). [Internet]. Available from: http://antiplague.ru/ wp-content/uploads/2019/01/CB0PHHK-31.pdf.
11. Moshkina A.A. [Properties of Trans-Baikalian strains of cholera vibrios O1 isolated over the past five years]. In: [Cholera and Pathogenic for Humans Vibrios. Proceedings of the Problem Commission]. Issue 32. Rostov-on-Don; 2019. P. 110-2. (Cited 28 Sept 2021). [Internet]. Available from: http://antiplague.ru/wp-content/uploads/2019/1I/Xojiepa-H-naTOreHHLie-gM-HenoBeKa-BH6pHOHLI-BLinyCK-32.pdf.
12. Alekseeva L.P., Cherepakhina I.Ya., Sal'nikova O.I., Burlakova O.S. [Study of antigenic relations between typical and R-forms of cholera vibrios, based on monoclonal antibodies]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology andImmunobiology]. 1998; (4):9-12.
13. Hisatsune K., Hayashi M., Haishima Y., Kondo S. Relationship between structure and antigenicity of O1 Vibrio chole-rae lipopofysaccharides. J. Gen. Microbiol. 1989; 135(7):1901-07. DOI: 10.1099/00221287-135-7-1901.
14. Kaper J.B., Morris J.G. Jr, Levine M.M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1):48-86. DOI: 10.1128/CMR.8.1.48.
15. Catty D., editor. [Antibodies. Methods]. Book 1. Moscow: "Mir"; 1991. 287 p.
16. Egorov A.M., Osipov A.P., Dzantiev B.B., Gavrilova E.M. [Theory and Practice of Enzyme Immunoassay]. Moscow: "High School"; 1991. 288 p.
17. Levchenko D.A., Arkhangel'skaya I.V., Kruglikov V.D., Podoinitsyna O.A. [Atypical strains of Vibrio cholerae O1 by ag-glutinability indicator]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii
i Immunobiologi [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2020; 97(5):482-91. DOI 10.36233/0372-93112020-97-5-10.
18. Evdokimova V.V., Alekseeva L.P., Kretenchuk O.F., Kruglikov V.D., Arkhangel'skaya I.V., Bursha O.S. [Monoclonal antibodies to thermostable surface antigens of Vibrio cholerae O1-and O139-serogroup]. Epidemiologiya i Infektsionm>e Bolezni. [Epidemiology and Infectious Diseases]. 2015; (3):51-7.
19. Zad nova S.P., Agafonov D.A., Shashkova A.V., Smirnova N.I. [Comparative resistance of typical and genetically altered strains of Vibrio cholerae El Tor biovar to adverse environmental factors]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2014; (2):11-7.
20. Mironova L.V. [Modern views on epidemic process patterns in case of cholera: ecological and molecular biological aspects]. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni [Epidemiology and infectious diseases]. 2018; 23(5):242-50. DOI: 10.18821/1560-9529-2018-235-242-250.
21. Kulikalova E.S., Urbanovich L.Ya., Sappo S.G., Mironova L.V., Markov E.Yu., Mal'nik V.V., Korzun V.M., Mitkeeva S.K., Balakhonov S.V. [Vibrio cholerae biofilm: production, characterization and role in pathogen preservation in the aquatic environment]. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2015; (1):3—11.
22. Suva A.J., Benitez J.A. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016; 10(2):e0004330. DOI: 10.1371/journal.pntd.0004330.
23. Jubair M., Morris J.G. Jr, Ali A. Survival of Vibrio cholerae in nutrient-poor environments is associated with a novel "persister" phenotype. PLoS One. 2012; 7(9):e45187. DOI: 10.1371/journal. pone.0045187.
24. Wu B., Liang W., Kan B. Growth phase, oxygen, temperature and starvation affect the development of viable but non-cultur-able state of Vibrio cholerae. Front Microbiol. 2016; 7:404. DOI: 10.3389/fmicb.2016.00404.
25. Lutz C., Erken M., Noorian P., Sun S., McDougald D. Environmental reservoirs and mechanisms of persistence of Vibrio cholerae. Front. Microbiol. 2013; 4:375. DOI: 10.3389/ fmicb.2013.00375.
Authors:
Evdokimova V.V., Alekseeva L.P., Yakusheva O.A., Levchenko D.A., Kruglikov V.D., Zyuzina V.P., Yagovkin M.E Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute. 117/40, M. Gor'kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation. E-mail: plague@aaanet.ru.
Об авторах:
Евдокимова В.В., Алексеева Л.П., Якушева О.А., Левченко ДА, Кругликов В.Д., Зюзина В.П., Яговкин М.Э. Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт. Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40. E-mail: plague@aaanet.ru.
