CC BY
26
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
роль в нормальных физиологических процессах. Однако при многих аутоиммунных заболеваниях отмечается увеличение экспрессии TNF. В связи с этим важным для понимания роли TNF как в патологических, так и в нормальных процессах является выявление основных сайтов экспрессии этого цитокина. Применение методов прижизненной визуализации для изучения экспрессии TNF при аутоиммунных патологиях может открыть новые возможности в понимании биологии этого цитокина. Нами были получены конструкции, состоящие из наноанти-тела против TNF человека и дальне-красного флюоресцентного белка Katushka (TurboFP635), которые могут претендовать на роль как флюоресцентных сенсоров, так и агентов для тераностики TNF-зависимых патологий.
Цель и задачи. Оценить перспективы применения полученных конструктов для визуализации TNF in vivo, исследуя уровень флюоресценции тела и органов, гуманизированных по гену TNF мышей в модели ЛПС/D-галактозамин ^^а!Ы)-индуцированной острой гепато-токсичности.
Материалы и методы. В работе использовались 2 флюоресцентных конструкта: нейтрализующий биологическую активность TNF белок NTN-Kat и связывающий TNF, но не блокирующий его биологическую активность белок BTN-Kat. Анти-TNF активность этих белков была оценена ранее по результатам in vitro- и in vivo-тестов. Белки вводили животным внутрибрюшинно (150 пМ/г веса животного). Затем через 30 минут животным внутрибрюшинно вводили ЛПС (400 нг/г веса) и D-GalN (800 мкг/г веса) либо PBS. Для оценки автофлюоресценции мышам вводили PBS за 30 мин до инъекции ЛПС/D-GalN. Флюоресцентный имиджинг животных и их органов проводился через 1 час, 3 часа и 6 часов после введения ЛПС на установке IVIS-Spectrum (Caliper Life Sciences, США) ex vivo в режиме регистрации эпилюминесценции. Флюоресценцию возбуждали на длине волны 605/15 нм, регистрировали — на 660/10 нм. Для получения изображений животных шерсть удаляли машинкой для бритья и дополнительно проводили депиляцию кремом. При количественном анализе в программе LivingImage (Perkin Elmer) определяли усредненную по интересующей области интенсивность флюоресценции. В работе использовали трансгенных 750huTNFKI мышей, полученных на генетической основе линии C57B1/6, продуцирующих человеческий TNF вместо мышиного.
Результаты. Поскольку модель острой гепатоток-сичности, индуцированная одновременным введением D-GalN и ЛПС, характеризуется воспалительным процессом в брюшной полости, как и ожидалось, наибольший уровень флюоресценции наблюдался при получении изображений животных со стороны живота. При этом через 1 час после введения ЛПС и D-GalN у мышей наблюдалось диффузное усиление сигнала (BTN-Kat — 1,83 х 108, NTN-Kat - 1,15 х 108 [p/s/cm2/sr]/[|W/cm2]) по сравнению с контрольными мышами, после введения PBS (BTN-Kat - 1,41 х 108, NTN-Kat - 2,55 х 107 [p/s/cm2/sr]/[|W/cm2]). Аналогичное увеличение сигнала через 1 час мы также наблюдали для органов, при этом наиболее интенсивной флюоресценцией обладали легкие (BTN-Kat - 3,83 х 107, NTN-Kat - 6,83 х 107[p/s/ cm2/sr]/[|W/cm2]), кишечник (BTN-Kat - 8,24 х 107, NTN-Kat - 6,68 х 107 [p/s/cm2/sr]/[|W/cm2]) и кожа (BTN-Kat - 6,19 х 107, NTN-Kat - 5,32 х 107 [p/s/cm2/sr]/ [|W/cm2]). По результатам анализа сигнала через 6 часов после начала эксперимента мы могли наблюдать,
что у контрольных мышей, не стимулированных ЛПС и D-GalN, уровень флюоресценции BTN-Kat снижался до значения 9,76 х 106 (p/s/cm2/sr)/(|W/cm2), сопоставимого с аналогичным значением автофлюоресценции (2,17 х 107 [p/s/cm2/sr]/[|W/cm2]), что, вероятно, свидетельствует о полном его выведении из организма. В то же время мы могли наблюдать накопление белка NTN-Kat как при оценке сигнала от животного со стороны живота (7,04 х 107 [p/s/cm2/sr]/[|W/cm2]), так и при оценке органов (преимущественно легкие и кожа).
Заключение. Таким образом, можно сделать вывод, что использование белков BTN-Kat и NTN-Kat возможно для прижизненного изучения экспрессии TNF. При этом белок BTN-Kat способен быстро выводиться из организма, что характеризует его как эффективный сенсор с коротким временем жизни. В то же время белок NTN-Kat способен в свободном виде или в виде комплексов с TNF накапливаться в организме и сохранять при этом свою нейтрализующую активность, что было ранее подтверждено с помощью in vivo-тестов.
Работа выполнена при поддержке Грантов РФФИ № 16-34-00561, № 17-04-01478 и в рамках государственного задания (шифр проекта 20.6159.2017/П220).
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ IL-6 В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ АСТМЫ У МЫШЕЙ
Губернаторова Е.О.1, 2, Друцкая М.С.1, 2, Недоспасов С.А.1, 2, Туманов А.В.1
1ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН Москва, Россия 2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Частота и тяжесть хронических заболеваний легких, таких как аллергическая астма, растет с каждым годом, затрагивает от 200 до 300 миллионов человек. Первопричина, приводящая к развитию многих хронических заболеваний легких, остается неизвестной, и современные методы терапии астмы направлены преимущественно на облегчение симптомов. Таким образом, существует острая потребность в разработке новых методов лечения астмы. IL-6 представляет собой провоспалительный ци-токин с плейотропными функциями — от гемопоэтиче-ской регуляции и регенерации тканей до индукции хронического воспаления и развития рака. Недавние исследования подтверждают связь IL-6 и воспаления в легких, следовательно, IL-6 может быть важной мишенью для терапии астмы (Doganci A. et al., 2005).
Цель. Изучение роли IL-6 в экспериментальной модели астмы у мышей, индуцированной белковым экстрактом из домашнего пылевого клеща (HDM, house dust mite).
Для исследования влияния IL-6 на аллергическое воспаление дыхательных путей нами была оптимизирована мышиная модель острой астмы (Blanchet M.R. et al., 2012). Сенсибилизирующее введение 1 мг HDM осуществляли за неделю до основного курса. Индукцию проводили посредством ежедневного интраназального введения HDM из расчета 0,5 мг/г веса мыши в течение 2 недель. Антитела против IL-6 мыши (из расчета 2,5/г веса мыши) вводили внутрибрюшинно перед каждой иммунизацией. Контрольной группе мышей вместо инъекции anti-IL-6 антител производили инъекции физиологического раствора. По окончании эксперимента
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
оценивали интенсивность и характер воспаления в легких, а также уровень провоспалительных цитокинов, ассоциированных с астмой.
В ходе данной работы было обнаружено, что, по сравнению с контрольными мышами, мыши, подвергавшиеся анти-Ш-6 терапии, демонстрируют значительное снижение тяжести воспаления дыхательных путей. Подсчет иммунных клеток в тканях легких и бронхоальвеолярной жидкости, проведенный в конце эксперимента, показал снижение общего числа лимфоцитов в группе мышей, которым вводили антитела блокирующие IL-6. Кроме того, цитофлуориметрический анализ выделенных из легких и бронхоальвеолярной жидкости лимфоцитов выявил существенное снижение как доли, так и абсолютного числа гранулоцитов и патогенных при астме 1Ь2-клеток у мышей на фоне анти-Ш-6 терапии. Методом количественного ПЦР было установлено, что блокировка IL-6 приводила к снижению экспрессии активирующих цитокинов, таких как IL-4, IL-5, и IL-13, участвующих в индукции и поддержании воспаления при астме. Иммунофермент-ный анализ (ELISA) сыворотки и бронхоальвеолярной жидкости показал снижение уровня IgE, маркера астматического поражения легких, у мышей, подверженных anti-IL6 терапии по сравнению с контрольными мышами. Наконец, экспрессия муцина Muc5ac и маркера бокаловидных клеток Gob5 была снижена на фоне анти-Ш-6 терапии. Следует отметить, что медикаментозное подавление продукции слизи в дыхательных путях является одним из способов облегчения состояния при астме.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что введение антител против IL-6 может снижать гиперреактивность дыхательных путей и аллергическое воспаление в мышиной модели HDM-индуцированной астмы. Данные результаты предоставляют рациональную основу для начала разработки терапии астмы, основанной на блокировке IL-6. Дальнейшие эксперименты необходимы для определения конкретного клеточного источника IL-6 в данной модели, а также с целью установления молекулярного механизма, определяющего па-тогенность этого цитокина в астме.
Работа была осуществлена при поддержке гранта РНФ 14-25-00160.
РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ЭХИНОХРОМА А В КАЧЕСТВЕ СОПРОВОДИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ БЛЕОМИЦИН-ИНДУЦИРОВАННОГО ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА В ЛЕГКИХ НА РАННЕМ ЭТАПЕ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА
Гусева О.Е., Лебедько О.А., Рыжавский Б.Я., Кузнецова М.С.
Хабаровский филиал ФГБНУ«Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» — Научно-исследовательский институт охраны материнства и детства, Хабаровск, Россия
Введение. Блеомицин — смесь гликопептидных антибиотиков с цитостатическим эффектом, механизм действия которого связан со способностью вызывать фрагментацию молекул ДНК. Блеомицин входит в «золотые» стандарты терапии различных форм лимфогранулематоза у детей и подростков. Повсеместно известен его пневмо-токсический эффект, который характеризуется развитием воспалительных и фибротических изменений. Одним из ключевых молекулярных механизмов формирования
и прогрессирования воспалительно-фиброзных процессов является оксидативный стресс, нарушающий баланс редокс-сенситивной регуляции апоптоза, пролиферации, дифференцировки, миграции мезенхимальных и эпителиальных клеток. Препараты на основе природного антиоксиданта Эхинохрома А (2,3,5,6,8-пента-гидрокси-7-этил-1,4-нафтохинон) в настоящее время широко используются в офтальмологии, кардиологии, неврологии.
Цель и задачи. Изучение влияния Эхинохрома А на показатели оксидативного стресса, индуцированного блеомицином, в легких крыс на раннем этапе постна-тального онтогенеза. Исследование влияния Эхинохро-ма А на блеомицин-индуцированные нарушения процес-синга свободных радикалов (СР) в легких крыс на раннем этапе постнатального онтогенеза.
Материалы и методы. Исследование проводилось в рамках программы фундаментальных исследований ДВО РАН «Новые лекарственные формы, биопрепараты и медицинские технологии, преимущественно на основе молекул и надмолекулярных комплексов из биологических объектов Дальнего Востока и Мирового океана», научный проект 15-I-5-030. Опыт поставлен на крысах линии Вистар. Животные были разделены на три группы. Первая группа — «блеомицин» — введение блеомицина крысам в возрасте 30 дней, однократное, внутрибрю-шинное, в дозе 1 мг/кг. Вторая группа «блеомицин + эхи-нохром» — введение блеомицина, как и в первой группе, а также введение эхинохрома А через желудочный зонд в форме водного раствора, приготовленного extempore, в дозе 10 мг/кг в течение 5 суток (в день введения блеомицина, а также на 2, 3, 4 и 5-е сутки после этого). Третья группа — «контроль» — однократное внутрибрюшинное введение 30-дневным крысам физиологического раствора в эквиобъемных блеомицину дозах. Для интегральной оценки процессов биогенеза СР в гомогенатах легочной ткани использовали метод хемилюминесценции (ХМЛ) на люминесцентном спектрометре LS 50B «PERKIN ELMER».
Результаты. Результаты ХМЛ-исследования легких крыс, повергнутых воздействию блеомицина, свидетельствовали о развитии выраженного оксидативного стресса. Зарегистрировано повышение генерации свободных радикалов в целом — показатель Ssp превышал аналогичный в группе «контроль» в 2,6 раза, при этом продукция супероксид-анион радикалов (Sluc), перекисных радикалов (Sind-1) возросла в 2,8 и 3,2 раза соответственно. Зарегистрирована интенсификация первичного этапа перекисного окисления липидов: концентрация гидроперекисей липидов (h) превышала значения в группе «контроль» в 3,1 раза. Нарушение процессинга СР сопровождалось ослаблением антиоксидантной антирадикальной защиты и снижением перекисной резистентности: величина Sind-2 возросла в 3,4 раза, амплитуда H — в 3,2 раза соответственно. Известно, что Эхинохром А способен одновременно блокировать ряд звеньев свободнора-дикальных реакций, действует как перехватчик активных форм кислорода, нейтрализует липопероксидные радикалы, хелатирует ионы металлов, ингибирует перекисное окисление липидов. Эти свойства были продемонстрированы им в данной экспериментальной модели — величины всех ХМЛ-параметров, характеризующих оксидативный статус в группе «блеомицин+эхинохром» (Ssp, Sluc, Sind-1, h, Sind-2, H), были достоверно меньше, чем в группе «блеомицин» — в 1,9; 2,0; 1,9; 2,0; 2,4; 2,3 раза соответственно.
