CC BY
18
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
по интенсивности светопропускания мембраны и цитоплазмы макрофагов, которую проводили с помощью де-мо-версии программы Sigma Scan Pro5.
Результаты. Макрофаги, экспрессирующие маркер CD68, имеют темно-коричневую окраску мембраны и светло-коричневую цитоплазму, располагаются преимущественно вдоль синусоидных капилляров. Их количество сопоставимо для обеих групп крыс и составляет 18-20 клеток в поле зрения (х400), однако у крыс, получавших кремний с водой, визуально макрофаги имеют меньшее количество отростков и более темную цитоплазматиче-скую мембрану. Средняя площадь макрофагов составила 179,23±5,94 мкм2 и 117,04±3,35 мкм2 для контрольной и подопытной групп соответственно (p < 0,001). Интенсивность светопропускания цитоплазматической мембраны составляет 110,20±11,06 у.е. и 102,47±1,66 у.е., цитоплазмы — 88,15±8,15 у.е. и 83,96±1,82 у.е. для контрольной и подопытной групп соответственно, что свидетельствует о том, что на поверхности звездчатых макрофагов крыс, получавших кремний, находится большее количество маркера CD68. Таким образом, морфологическая реакция макрофагов как печени, так и лимфоидных органов при данном виде воздействия в течение длительного времени имеет сходный характер.
Заключение. Наши наблюдения свидетельствуют, что при поступлении с питьевой водой соединения кремния макрофаги печени, уменьшаясь в размерах, компенсируют это увеличением экспрессии CD68 на своей цитоплазмати-ческой мембране, что можно расценивать как адаптационную реакцию в ответ на снижение фагоцитарной функции.
ЭФФЕКТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО БЭКГРАУНДА НА ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ K72W ЦИТОХРОМА С IN VIVO
Горшкова Е.А.1, Недоспасов С.А.1, 2, Шилов Е.С.1
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 ФГБУН«Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН, Москва, Россия
Цитохром С является незаменимым элементом дыхательной цепи митохондрий, а также выступает в роли одного из медиаторов внутреннего пути апоптоза. У мышей полный генетический нокаут соматического цитохрома С приводит к эмбриональной летальности. Ранее было показано, что точечная мутация замены лизина-72 нарушает только проапоптотические функции белка и на смешанном генетическом фоне приводит к различным эффектам для разных систем организма in vivo.
Мы перевели ранее полученных мышей с заменой остатка лизина-72 на триптофан (K72W-мыши) в последовательности соматического цитохрома С на смешанный генетический бэкграунд линий C57BL/6 и 129S2, поскольку на чистом генетическом фоне C57BL/6 они демонстрировали нормальный фенотип. Мы предположили, что проявление аномального фенотипа гомозиготных по K72W мышей зависит от генов-модификаторов, специфических для линии 129S2, и поэтому не наблюдается у мышей, несущих мутацию на чистом генетическом фоне линии C57BL/6. Целью данной работы является характеристика влияния мутации K72W на нервную и иммунную системы мыши и нахождение возможных механизмов модификации эффекта мутации, зависящих от генетического бэкграунда.
Для характеристики морфологии мозга K72W/K72W мышей был использован анализ гистологических и томографических изображений, а также цитофлуориметри-ческий анализ инфильтрирующих клеток мозга. Оценка популяций иммунных клеток тимуса и селезенки гомозиготных мышей была произведена при помощи проточной цитофлуориметрии.
По результатам работы была подтверждена зависимость проявления фенотипа с нарушениями развития мозга и тимуса у гомозиготных особей от линиеспецифи-ческих генов-модификаторов: при скрещивании мышей, несущих мутацию K72W на чистом C57BL/6 бэкграунде, с мышами дикого типа линии 129S2 в поколении F2 появляются особи, демонстрирующие аномалии развития. В дальнейших скрещиваниях было установлено, что аномальный фенотип проявляется примерно у 40% гомозигот, что указывает на наличие не менее двух генов-модификаторов. На основании литературных данных мы предположили, что такими модификаторами могут быть гены Casp4, Birc6, Naip1-6, однако проверка методом аллеле-специфической ПЦР не установила соответствия между проявлением аномального фенотипа и носительством аллелей данных генов, специфичных для линии 129S2, в гомозиготном или гетерозиготном состояниях.
Аномальный фенотип гетерогенен и включает такие признаки, как разрастание клеток коры и базальных ганглиев головного мозга, гидроцефалию, уменьшение размера тимуса и увеличение популяции DN-тимоцитов. Аномальные признаки сочетаются независимо друг от друга: встречаются K72W/K72W мыши, со значительно измененной морфологией головного мозга и нормальным распределением популяций тимоцитов, и наоборот. Также мы показали, что несмотря на аномальное развитие головного мозга у части гомозигот K72W/K72W, эк-зоэнцефалия не приводит к нарушению гематоэнцефа-лического барьера и массовой инфильтрации иммунных клеток в головной мозг.
Полученные результаты указывают на важность исследования эффектов генетического бэкграунда в моделях генетических нокинов и нокаутов. Мы планируем продолжить поиск генов-модификаторов апоптотическо-го пути, определение которых может расширить существующее представление о механизмах апоптоза.
Работа была осуществлена при поддержке гранта Президента РФ для ведущих научных школ НШ-10014.2016.4.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-34-01216 мол-а.
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ TNF IN VIVO С ПОМОЩЬЮ НАНОАНТИТЕЛ, СЛИТЫХ С БЕЛКОМ KATUSHKA
Горшкова Е.Н.1, Южакова Д.В.1, 2, Василенко Е.А.1, Ширманова М.В.2, Ефимов Г.А.3, Ермакова К.Д.1, Недоспасов С.А.1, 4, Астраханцева И.В.1
1 Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород, Россия
2 Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород, Россия
3 Гематологический научный центр, Москва, Россия
4 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, Россия
Введение. Фактор некроза опухоли (TNF) является провоспалительным цитокином, который играет важную
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
роль в нормальных физиологических процессах. Однако при многих аутоиммунных заболеваниях отмечается увеличение экспрессии TNF. В связи с этим важным для понимания роли TNF как в патологических, так и в нормальных процессах является выявление основных сайтов экспрессии этого цитокина. Применение методов прижизненной визуализации для изучения экспрессии TNF при аутоиммунных патологиях может открыть новые возможности в понимании биологии этого цитокина. Нами были получены конструкции, состоящие из наноанти-тела против TNF человека и дальне-красного флюоресцентного белка Katushka (TurboFP635), которые могут претендовать на роль как флюоресцентных сенсоров, так и агентов для тераностики TNF-зависимых патологий.
Цель и задачи. Оценить перспективы применения полученных конструктов для визуализации TNF in vivo, исследуя уровень флюоресценции тела и органов, гуманизированных по гену TNF мышей в модели ЛПС/D-галактозамин ^^а!Ы)-индуцированной острой гепато-токсичности.
Материалы и методы. В работе использовались 2 флюоресцентных конструкта: нейтрализующий биологическую активность TNF белок NTN-Kat и связывающий TNF, но не блокирующий его биологическую активность белок BTN-Kat. Анти-TNF активность этих белков была оценена ранее по результатам in vitro- и in vivo-тестов. Белки вводили животным внутрибрюшинно (150 пМ/г веса животного). Затем через 30 минут животным внутрибрюшинно вводили ЛПС (400 нг/г веса) и D-GalN (800 мкг/г веса) либо PBS. Для оценки автофлюоресценции мышам вводили PBS за 30 мин до инъекции ЛПС/D-GalN. Флюоресцентный имиджинг животных и их органов проводился через 1 час, 3 часа и 6 часов после введения ЛПС на установке IVIS-Spectrum (Caliper Life Sciences, США) ex vivo в режиме регистрации эпилюминесценции. Флюоресценцию возбуждали на длине волны 605/15 нм, регистрировали — на 660/10 нм. Для получения изображений животных шерсть удаляли машинкой для бритья и дополнительно проводили депиляцию кремом. При количественном анализе в программе LivingImage (Perkin Elmer) определяли усредненную по интересующей области интенсивность флюоресценции. В работе использовали трансгенных 750huTNFKI мышей, полученных на генетической основе линии C57B1/6, продуцирующих человеческий TNF вместо мышиного.
Результаты. Поскольку модель острой гепатоток-сичности, индуцированная одновременным введением D-GalN и ЛПС, характеризуется воспалительным процессом в брюшной полости, как и ожидалось, наибольший уровень флюоресценции наблюдался при получении изображений животных со стороны живота. При этом через 1 час после введения ЛПС и D-GalN у мышей наблюдалось диффузное усиление сигнала (BTN-Kat — 1,83 х 108, NTN-Kat - 1,15 х 108 [p/s/cm2/sr]/[|W/cm2]) по сравнению с контрольными мышами, после введения PBS (BTN-Kat - 1,41 х 108, NTN-Kat - 2,55 х 107 [p/s/cm2/sr]/[|W/cm2]). Аналогичное увеличение сигнала через 1 час мы также наблюдали для органов, при этом наиболее интенсивной флюоресценцией обладали легкие (BTN-Kat - 3,83 х 107, NTN-Kat - 6,83 х 107[p/s/ cm2/sr]/[|W/cm2]), кишечник (BTN-Kat - 8,24 х 107, NTN-Kat - 6,68 х 107 [p/s/cm2/sr]/[|W/cm2]) и кожа (BTN-Kat - 6,19 х 107, NTN-Kat - 5,32 х 107 [p/s/cm2/sr]/ [|W/cm2]). По результатам анализа сигнала через 6 часов после начала эксперимента мы могли наблюдать,
что у контрольных мышей, не стимулированных ЛПС и D-GalN, уровень флюоресценции BTN-Kat снижался до значения 9,76 х 106 (p/s/cm2/sr)/(|W/cm2), сопоставимого с аналогичным значением автофлюоресценции (2,17 х 107 [p/s/cm2/sr]/[|W/cm2]), что, вероятно, свидетельствует о полном его выведении из организма. В то же время мы могли наблюдать накопление белка NTN-Kat как при оценке сигнала от животного со стороны живота (7,04 х 107 [p/s/cm2/sr]/[|W/cm2]), так и при оценке органов (преимущественно легкие и кожа).
Заключение. Таким образом, можно сделать вывод, что использование белков BTN-Kat и NTN-Kat возможно для прижизненного изучения экспрессии TNF. При этом белок BTN-Kat способен быстро выводиться из организма, что характеризует его как эффективный сенсор с коротким временем жизни. В то же время белок NTN-Kat способен в свободном виде или в виде комплексов с TNF накапливаться в организме и сохранять при этом свою нейтрализующую активность, что было ранее подтверждено с помощью in vivo-тестов.
Работа выполнена при поддержке Грантов РФФИ № 16-34-00561, № 17-04-01478 и в рамках государственного задания (шифр проекта 20.6159.2017/П220).
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ IL-6 В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ АСТМЫ У МЫШЕЙ
Губернаторова Е.О.1, 2, Друцкая М.С.1, 2, Недоспасов С.А.1, 2, Туманов А.В.1
1ФГБУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН Москва, Россия 2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Частота и тяжесть хронических заболеваний легких, таких как аллергическая астма, растет с каждым годом, затрагивает от 200 до 300 миллионов человек. Первопричина, приводящая к развитию многих хронических заболеваний легких, остается неизвестной, и современные методы терапии астмы направлены преимущественно на облегчение симптомов. Таким образом, существует острая потребность в разработке новых методов лечения астмы. IL-6 представляет собой провоспалительный ци-токин с плейотропными функциями — от гемопоэтиче-ской регуляции и регенерации тканей до индукции хронического воспаления и развития рака. Недавние исследования подтверждают связь IL-6 и воспаления в легких, следовательно, IL-6 может быть важной мишенью для терапии астмы (Doganci A. et al., 2005).
Цель. Изучение роли IL-6 в экспериментальной модели астмы у мышей, индуцированной белковым экстрактом из домашнего пылевого клеща (HDM, house dust mite).
Для исследования влияния IL-6 на аллергическое воспаление дыхательных путей нами была оптимизирована мышиная модель острой астмы (Blanchet M.R. et al., 2012). Сенсибилизирующее введение 1 мг HDM осуществляли за неделю до основного курса. Индукцию проводили посредством ежедневного интраназального введения HDM из расчета 0,5 мг/г веса мыши в течение 2 недель. Антитела против IL-6 мыши (из расчета 2,5/г веса мыши) вводили внутрибрюшинно перед каждой иммунизацией. Контрольной группе мышей вместо инъекции anti-IL-6 антител производили инъекции физиологического раствора. По окончании эксперимента
