CC BY
29
Є
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Изучение противовирусной активности борных производных адамантана на модели вирусов гриппа с пандемическим потенциалом
С. Г МАРКУШИН, Н. А. КАНТАРОВ, С. В. АРТЮШЕНКО, И. И. АКОПОВА, И. Б. КОПТЯЕВА, Ю. Н. БУБНОВ
НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН, Москва НИИ органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН, Москва
Investigation of Antiviral Activity of Adamantan Boron Derivaties on Pandemic Influenza Virus Models
S. G. MARKUSHIN, N. A KANTAROV, S. V. ARTYUSHENKO, I. I. AKOPOVA, I. B. KOPTYAEVA YU. N. BUBNOV
I. I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow N. D. Zelinsky Research Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow
Сравнительное исследование вирусингибирующего действия группы борсодержащих соединений свидетельствует о том, что наиболее выдеаженныш ингибирующим действием на вирусы с пандемическим потенциалом, обладали препараты БГ-12 и БГ-4. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) этих препаратов в отношении исследуемык вирусов равнялась 0,1 мкг/мл. Использование липосом, нагруженных молекулами БГ-12 в оптимальных концентрациях (0,1 мкг/мл), приводило к подавлению размножения вируса чумы птиц в клетках МБСК. Обсуждается возможность создания эффективных средств противовирусной защиты на основе комплексов «липосомы! — борсодержащие соединения».
Ключевые слова: 1-Бораадамантан, борсодержащие соединения, пандемические вирусы гриппа птиц и свиней, липосомы
Comparative investigation of the virus-inhibiting activity of some boron-containing compounds showed that products BG 12 and BG 4 had the highest inhibitory effect on pandemic viruses. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the products was 0.1 mcg/ml. The use of liposomes loaded with BG 12 molecules in the optimal concentration (0.1 mcg/ml) resulted in inhibition of the avian plague virus growth in the MDCK cells. Possible design of efficient drugs for antiviral protection based on the complexes liposomes — boron-containing compounds is discussed.
-Q-
Key words: 1-Boronadamantan, boron-containing compounds, pandemic avian and swine influenza viruses, liposomes.
Введение
Гриппозные пандемии и эпидемии продолжают оставаться в центре внимания отечественного здравоохранения, учитывая масштабы экономических потерь, а также вред, наносимый здоровью населения. Вирусы гриппа птиц серотипов Н5, Н7, Н9, представляющие серьёзную опасность для человека, наносят также огромный урон птицеводству. Сохраняет свой пандемический потенциал и вирус свиного гриппа А/Н1Ш, продолжающий циркулировать в различных частях земного шара. В борьбе с вирусами гриппа наряду с вакцинными препаратами важное значение имеют химиотерапевтические агенты: ремантадин, аман-тадин, осельтамивир, занамивир. Длительное использование этих агентов подтвердило их высокую эффективность. Однако широкое распространение ремантадина и амантадина привело к появлению большого количества резистентных к данным
© Коллектив авторов, 2011
Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул., д. 3а. Редакция журнала «Антибиотики и химиотерапия»
соединениям вариантов вируса гриппа. В последние годы появились сообщения о выделении штаммов вируса гриппа А, резистентных к зана-мивиру и осельтамивиру [1]. Указанные обстоятельства стимулируют поиск иных соединений, которые были бы активны в отношении вирусов гриппа, устойчивых к этим препаратам.
Ранее было показано, что производные 1-бо-раадамантана обладают выраженной противовирусной активностью в отношении вируса гриппа птиц и вирусов гриппа человека [2, 3]. В данной работе представлены данные о вирусингибирую-щей активности производных 1-бораадамантана в отношении некоторых вирусов гриппа, обладающих пандемическим потенциалом. Также мы попытались затронуть теоретические и научнопрактические основы для создания комплексов борных производных адамантана с липосомами, направленных на лечение и профилактику гриппозных инфекций.
Материал и методы
Химиопрепараты. В работе были использованы борные производные адамантана (СщН^). Соединения содержат
-е-
Є
Таблица 1. Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) борсодержащих соединений БГ-12 и БГ-4 для вирусов гриппа птиц и животных, обладающих пандемическим потенциалом, в культуре ФКЭ
Штаммы вирусов Борсодержащие соединения
БГ-12 БГ-4
концентрация, мкг/мл концентрация, мкг/мл
0,8 0,4 0,2 0,1 контроль 1,5 0,8 0,4 0,2 0,1 контроль
А/ВЧП/Вейбридж (H7N7) 0 0 2 17 47 0 0 0 4 23 51
А /Маллард/ Пенсильвания/10218/84 (H5N2) 0 0 11 20 45 0 0 0 3 21 48
A/NIBRG-14 (H5N1) 0 1 13 23 49 0 0 0 2 13 42
А/Калифорния/7/09 (H1N1) 0 0 3 19 44 0 0 0 4 18 48
Примечание. Указано количество бляшек / монослой в одном из трёх опытов. Монослой ФКЭ заражали в дозе 50 БОЕ/матрац и инкубировали под агаровым покрытием при 37°С в присутствии различных концентраций БГ-12 или БГ-
фрагмент амантадина, соединенный координационной связью с атомом бора. Препараты: БГ-99 (3-метил-1- бораада-мантан), БГ-101 (3,5-диметил-1-бораадамантан), БГ-4 (1-бо-раадамантан) и БГ-12 (1-бораадамантан с радикалом, представленным пропильной группой) были получены в лаборатории карбоциклических соединений ИОХ РАН на основе модификации классического варианта аллилбор ацетиленовой конденсации [4].
Вирусы и клетки. Объектами исследования служили штамм вируса чумы птиц А/ВЧП/ Вейбридж (H7N7), штаммы вируса гриппа птиц А/ Маллард Пенсильвания /10218/84 (H5N2) и A/NIBRG-14 (H5N1), штамм вируса гриппа свиней А/ Калифорния /7/09 (H1N1). Вирусы выращивали в 10-дневных куриных эмбрионах.
Опыты проводили в первичной культуре фибробластов куриного эмбриона (ФКЭ), а также в перевиваемой культуре линии MDCK.
Липосомы. Липосомы получали по стандартному методу с незначительными модификациями [5]. Яичный лецитин и ди-пальмитоилфосфатидилхолин («Sigma», США) в концентрации 1—3 мг/мл в растворе 0,01 М KCl инкубировали при 70°С в течение 10 мин в мольном соотношении 1:1 и 1:2. Липосомы из яичного фосфатидилхолина и яичного фосфатидилхолина в смеси с холестерином (3:1, моль:моль) инкубировали в тех же условиях. Затем дисперсию липосом обрабатывали ультразвуком (установка УЗДН-А, Украина) в течение 3 мин (мощность 500 Вт).
Размеры липосом определяли по спектру мутности дисперсии и с помощью электронной микроскопии. Электрофоретическую подвижность липосом fI измеряли коммерческим прибором «Zetasizer-2» (Malvem Inst., США) (Химический факультет МГУ).
Монослой ФКЭ инфицировали изучаемыми штаммами вирусов (50 БОЕ/матрац) и инкубировали под агаровым покрытием при 37° С в присутствии различных концентраций борсодержащих соединений.
Определение размножения вирусов в монослое клеточной линии MDCK. Монослой MDCK инфицировали вируссодержащей жидкостью с множественностью 0,1 БОЕ /клетка. Адсорбцию вируса проводили при комнатной температуре. Затем неадсорбированный вирус отмывали средой МЕМ двукратно и добавляли среду RPMi-1640, содержащую либо БГ-12, либо липосомы, нагруженные молекулами БГ-12. Контроль содержал чистую среду RPMi-1640. Накопление вируса определяли с помощью реакции гемагглютинации и титрования в куриных эмбрионах.
Статистическую обработку материалов проводили с использованием критерия Стьюдента и дисперсионного анализа с применением программ Microsoft Office Excel (2003).
Результаты исследования
1. Изучение противовирусного действия борсодержащих соединений в клеточной культуре.
Поскольку вирусы гриппа птиц (H5N1, H5N2), вирус чумы птиц (H7N7) и вирус гриппа
свиней (Н1Ш) в последние годы стали представлять повышенную опасность для человека, мы сосредоточили основное внимание на изучении ингибирующего действия борсодержащих соединений на эти вирусы. На первой стадии исследования мы определили минимальную подавляющую концентрацию (МПК) борсодержащих соединений в отношении данных вирусов. Как видно из табл. 1, МПК препаратов БГ-12 и БГ-4 в отношении исследуемых вирусов составляла 0,1 мкг/мл. МПК препаратов БГ-99 и БГ-101 колебалась в пределах 0,2—0,8 мкг/мл. (не показано). Поскольку препараты БГ-12 и БГ-101 обладали менее выраженным ингибирующим действием, можно было сделать вывод, что увеличение степени метилирования 1-бораадаманта-нового ядра снижает вирусингибирующую активность препаратов.
2. Влияние липосом, адсорбировавших молекулы БГ-12, на размножение штамма вируса чумы птиц А/ВЧП/Вейбридж (Н7М7) в клетках ШВСК.
Ранее нами было показано, что липосомы, полученные на основе дипальмитоилфосфати-дилхолина, могли взаимодействовать с молекулами препарата БГ-12, адсорбируя их в широком диапазоне концентраций препарата [5]. При концентрациях БГ-12 свыше 10,0 мкг/мл наблюдалось падение дзета-потенциала липосом с последующим выхода кривой на плато. Этот факт мог трактоваться как невозможность дальнейшего встраивания молекул БГ-12 в липидную мембрану липосом. В наших экспериментах мы использовали невысокие концентрации БГ-12 (0,1 мкг/мл).
Монослой МБСК был инфицирован вирусом чумы птиц с множественностью 0,1 ЭИД50/кл. После адсорбции вируса на клетках в течение 30 мин при комнатной температуре монослой промывали двукратно средой ЯР Мі-1640 и затем в матрац вносили ту же среду, содержащую липо-сомы, адсорбировавшие молекулы БГ-12. Концентрация липосом равнялась 0,1 мг/мл. Концентрация БГ-12 в составе липосом равнялась 0,1 мкг/мл. В качестве контроля использовали виру-синфицированные клетки в присутствии среды ЯРМі-1640, вирусинфицированные клетки в
Є
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 2. Влияние липосом, содержащих препарат БГ-12, на размножение штамма вируса чумы птиц А/ВЧП/ Вейбридж (Н7N7) в клетках MDCK
Cоcтaв поддeрживaющeй среды
Титр вируca в среде после инфицировaния монослоя MDCK (ГАЕ/мл)
24 ч 48 ч 72ч 96 ч
Среда RPMi-1640 1:8 1:64 1:128 1:128
Среда RPMi-1640 + липосомы (0,1 мг/мл) 1:8 1:64 1:128 1:128
Среда RPMi-1640 + БГ-12 (0,1 мкг/мл) 1:8 1:З2 1:64 1:64
Среда RPMi-1640 + липосомы (0,1 мг/мл) + БГ-12 (0,1 мкг/мл) 1:2 1:16 1:З2 1:32
Примечание. Пробы среды отбирали каждые 24 часа после инфицирования монослоя MDCK вируссодержащей жидкостью с титром 0,1 ЭИД50 /кл. Титр вируса определяли в реакции гемагглютинации с использованием куриных эритроцитов.
Таблица 3. Влияние липосом с разным составом фосфолипидов, содержащих препарат Б-12, на размножение штамма вируса чумы птиц А/ВЧП/Вейбридж (Н7Ш) в клетках MDCK
Состав системы
Титр вируca (ГАЕ/мл), lg ЭИД50/мл
48 ч
72 ч
l20 ч
Клетки MDCK, инфицированные вирусом чумы птиц Клетки MDCK, инфицированные вирусом чумы птиц + препарат БГ-12 (1,0 мкг /мл)
Клетки MDCK, инфицированные вирусом чумы птиц + липосомы (дипальмитоилфосфатидилхолин) (2 мMoль/мл) + Са2+ (2,0 мM) Клетки MDCK, инфицированные вирусом чумы птиц + липосомы (дипальмитоилфосфатидилхолин + фосфатидилэтаноламин) (0,2 мг/мл) + Са2+ (2,0 мM)
Клетки MDCK, инфицированные вирусом чумы птиц + липосомы (дипальмитоилфосфатидилхолин + фосфатидилэтаноламин) (0,2 мг/мл) + БГ-12 (1 мкг/мл) + Са2+ (2,0 мM)
64 (4,0+0,02) 128 (4,5+0,02) 256 (4,5+0,02)
0 (0) 0 (0) 0 (0)
4 (1,5+0,02) 0 (0) 0 (0)
4 (1,5+0,02) 0 (0) 0 (0)
0 (0) 0 (0) 0 (0)
Примечание. Пробы среды отбирали через 48 ч, 72 ч и 120 ч. Титр вируса определяли с помощью реакции гемагглютинации и методом титрования вируса в куриных 10-дневных эмбрионах. Инфекционный титр вируса (^ ЭИД50 / мл) указан в скобках.
присутствии среды ЯРМі-1640, содержащей препарат БГ-12 в концентрации 0,1 мкг/мл, а также среды ЯРМі-1640, содержащей липосомы в концентрации 0,1 мг/мл. Инфицированные клетки МБСК инкубировались в СО2-инкубаторе 4 дня при 37°С. Как видно из табл. 2, размножение вируса в клетках МБСК со средой ЯРМі-1640 проходило интенсивно и через 72—96 ч титр вируса достигал 128 ГАЕ /мл. Добавление в среду препарата БГ-12 в концентрации 0,1 мкг/мл вызывало снижение титра вируса до 64 ГАЕ/мл. Однако включение в состав среды липосом, нагруженных молекулами БГ-12, приводила к ещё более выраженному вирусингибирующему эффекту.
3. Влияние липосом с разным составом липидов, содержащих препарат БГ-12, на размножение штамма вируса чумы птиц А/ВЧП/Вейбридж (Н7Ю) в клетках МБСК.
В следующей серии экспериментов использовали липосомы на базе комбинации фосфатиди-лэтаноламина и дипальмитоилфосфатидилхолина в соотношении 1:1 и 2:1. Результаты изучения влияния этих липосом, содержащих препарат БГ-12, на размножение вируса гриппа представлены в табл. 3. Как видно из таблицы, в клетках МБСК, инфицированных вирусом чумы птиц, наблюдалось значительное накопление гемагглютинирую-щих титров, что свидетельствовало об активном размножении вируса. При инкубации вирусин-
филированных клеток при 37°С гемагглютиниру-ющий титр вируса в среде на 3-й день достигал 128 ГАЕ /мл, а на 5-й день — 256 ГАЕ/мл. В клетках, инфицированных вирусом чумы птиц, в присутствии в среде препарата БГ-12, наблюдалось подавление размножения вируса. Также полное подавление размножения вируса наблюдалось в вирусинфицированных клетках в присутствии ли-посом, нагруженных молекулами препарата БГ-12. Следует отметить, что, как видно из табл. 3, нативные липосомы также обладали значительным вирусингибирующим действием, при этом степень подавления в определенной степени зависела от липидного состава липосом. Дисперсия липосом на базе дипальмитоилфосфатидилхоли-на ингибировала размножение вируса в меньшей степени, чем дисперсия липосом, полученных на базе смеси фосфатидилэтаноламина и дипальмитоилфосфатидилхолина.
Обсуждение результатов
Сравнительное изучение вирусингибирую-щего действия группы борсодержащих соединений позволяет сделать вывод, что наиболее выраженным ингибирующим действием на исследуемые вирусы обладали препараты БГ-12 и БГ-4. Минимальная подавляющая концентрация этих препаратов в отношении исследуемых вирусов составляла 0,1 мкг/мл. Большинство исследо-
Є
ванных нами вирусов с высоким пандемическим потенциалом обладают значительной вирулентностью для домашней птицы. Учитывая сравнительно невысокую стоимость препаратов БГ-4 и БГ-12, их можно использовать для профилактики эпизоотий в крупных и мелких птицехозяйствах Российской Федерации.
Изучение электрохимических характеристик липосом на базе дипальмитоилфосфатидилхоли-на при их взаимодействии с препаратом БГ-12 [6], показало, что оптимальными концентрациями БГ-12 для встраивания в липосомы являются концентрации в диапазоне от 0,1—10,0 мкг/мл. В наших экспериментах мы использовались невы-
ЛИТЕРАТУРА
1. Ward P., Small J, Smith J. et al. Oseltamivir ( Tamiflu) and its potential for use in the event of an influenza pandemic. Antimicrob Chemother 2005; 55: Suppl: S1, 5—21.
2. Михайлов Б. М., Смирнов В. H., Смирнова О. Д. и др. Изучение противовирусного действия 1-бораадамантана. Хим Фармакол журн 1998; 1: 122—126.
3. Маркушин С. Г., Синицын Б. В., Гинзбург В. П. и др. Изучение механизмов противовирусного действия производного бораадаманта-на препарата БГ-12. Вопр. вирусол. 1993; 3: 122—126.
сокие концентрации БГ-12. Тем не менее использование липосом, нагруженных молекулами БГ-12 в таких концентрациях, приводило к подавлению размножения вируса чумы птиц. Состав липидов липосом влиял на вирусингибирующую активность комплексов «липосомы — препарат БГ-12». Интересно отметить, что чистые липосо-мы обладали, в определенной степени, вируссин-гибирующей активностью.
Можно предположить, что использование ли-посом другого состава и выбор более «агрессивных» борсодержащих соединений поможет в будущем создать эффективные средства противовирусной защиты.
4. Bubnov Y. N., Gurskii M. E., Erdyakov S. Y. Bicyclic Systems with Bridgehead Boron Atom. In: Comprehensive Heterocyclic Chem.
2008, 3d Ed., / A. R. Katrizky, R. Taylor, K. Jones (Ed) 2008; 11: 13: 242-249.
5. Pagano L., Offidani M., Fianchi V. et al. Mucormycosis in hematologic patients. Hematologica 2004; 89: 207—214.
6. Kontarov N. A., Artushenko S. V., Markushin S. G. et al. A study of the interaction of of 1-boraadamantane with liposomes. Biophysics. 2010, 55: 230—231.
АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2011, 56; 5-6 é—
