CC BY
80
e
Изучение чувствительности вирусов гриппа А(ИШ1), вызвавших заболевания в апреле—мае 2009 года, к противовирусным препаратам в культуре клеток МБСК
А. А. РОМАНОВСКАЯ1, А. М. ДУРЫМАНОВ1, К. А. ШАРШОВ1, А. В. ЗАЙКОВСКАЯ1,
И. М. СУСЛОПАРОВ1, А. М. ШЕСТОПАЛОВ1, И. А. ЛЕНЁВА2, И. Г. ДРОЗДОВ1
1 ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирск
2 ЦХЛС-ВНИХФИ, Москва
Investigation of Susceptibility of Influenza Viruses A (H1N1), the Cause of Infection in Humans in April — May 2009, to Antivirals in MDCK Cell Culture
A. A. ROMANOVSKAYA, A. M. DURYMANOV, K. A. SHARSOV, A. V. ZAIKOVSKAYA,
I. M. SUSLOPAROV, A. M. SHESTOPALOV, I. A. LENEVA, I. G. DROZDOV
State Scientific Centre Vektor, Novosibirsk
Russian Research Chemicopharmaceutical Institute, Moscow
Изучены биологические свойства вирусов гриппа A(H1N1), вызвавших заболевания у людей в апреле — мае 2009 года, и действие отечественных противовирусных препаратов на их репродукцию в опытах in vitro. Проведено определение нуклеотидной последовательности вирусов с дальнейшим анализом по выявлению мутаций, ответственных за резистентность к противогриппозным препаратам. Результаты экспериментов показали, что препараты арбидол и рибавирин оказывают селективное ингибирующее действие на репродукцию исследуемых вирусов в культуре клеток MDCK, в то время как ремантадин не влияет на их размножение. Полученные данные были подтверждены результатами анализа генома вирусов гриппа A/California/04/2009(H1N1), A/California/07/2009(H1N1) и A/Moscow/01/2009(H1N1)swl, у которых не было обнаружено замен, определяющих резистентность к арбидолу, в то время как все три вируса содержали мутацию в положении 31 М2 белка, являющуюся ответственной за резистентность к препаратам адамантанового ряда.
Ключевые слова: вирус гриппа A (H1N1), арбидол, рибавирин, римантадин, вирусингибирующая активность в культуре клеток.
-Q-
Biological properties of influenza viruses A (H1N1), that were the cause of the infection in humans in April — May 2009, and the action of the Russian antivirals on their reproduction were studied in vitro. The nucleotide sequence in the viruses was determined and followed by detection of the mutations responsible for resistance to the antiinfluenza drugs. The experiments showned that arbidol and ribavirin had a selective inhibitory action on reproduction of the viruses in the MDCK cell culture while rimantadine had no affect on their reproduction. The data were confirmed by the results of the genome analysis in influenza viruses A/California/04/2009(H1N1), A/California/07/2009(H1N1) and A/Moscow/01/2009(H1N1)swl, that revealed no replacements defining the resistance to arbidol while the viruses contained a mutation in position 31 of M2 protein, responsible for the resistance to adamantans.
Key words: influenza virus A (H1N1), arbidol, ribavirin, rimantadine, virus inhibition activity, cell culture.
Введение
В последние месяцы эпидемическая ситуация по всему миру осложнилась вспышками гриппа у людей, вызванными вирусом А(Н1Ш), получившим название свиной грипп или мексиканский грипп. Молекулярно-генетические исследования показали, что он представляет новый вирус с уникальной комбинацией генов, происходящих от свиных, птичьих и человеческих штаммов вирусов гриппа А [1]. Первые клинические наблюдения показали, что заболевание, вызываемое этим вирусом, более контагиозное по сравнению с
© Коллектив авторов, 2009
Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул., д. 3а. Редакция журнала «Антибиотики и химиотерапия»
обычным сезонным гриппом и быстро передается от человека к человеку. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила о введении наивысшего 6-го уровня пандемической угрозы.
Основной стратегией борьбы с новым гриппом А(Н1Ш), как и впрочем с любым гриппом, является вакцинация. Однако известно, что для разработки, тестирования, проверки безопасности, производства и распространения новой вакцины необходимо не менее 6 месяцев — слишком большой промежуток времени в условиях надвигающейся пандемии. В этом случае в начале возможной пандемии противовирусные этиотропные препараты становятся единственным средством для эффективной борьбы с распространением ви-
e
руса, а в случае заболевания — и единственным средством его лечения. К настоящему времени в мире и в России для лечения и профилактики гриппа широко применяются несколько групп таких препаратов. К первому поколению относятся препараты адамантанового ряда: получивший распространение в США и в Западной Европе аман-тадин, а также используемый в основном в США, Канаде, России — римантадин [2—4]. К препаратам второго поколения относятся ингибиторы нейраминидазы: используемый в форме спрея за-намивир (Реленза) и применяемый в виде капсул или в виде суспензии для детей озельтамивир (Та-мифлю) [2, 4]. В России широкое распространение получил оригинальный отечественный препарат Арбидол, принадлежащий к классу индолов [5, 6]. Кроме того, для лечения тяжёлых случаев гриппа и ОРВИ в мировой практике применяется рибави-рин [2, 4, 7]. При гриппе данный препарат применяется внутривенно или в виде аэрозольной ингаляции в специально оборудованных камерах.
С первых дней выявления нового вируса необходимо было дать рекомендации для профилактики и лечения вызванного им заболевания. В связи с этим возникли вопросы о сравнительной эффективности этиотропных противовирусных препаратов в отношении вируса гриппа А (Н1Ш). В США в Центре контроля заболеваний были проведены исследования вирусов Н1Ш, выделенные от 13 пациентов из различных штатов [8]. Анализ геномов этих вирусов показал, что все они имели замену в М2 белке в положении 31, ответственную за резистентность к препаратам адамантанового ряда. С другой стороны, вирус ни от одного из пациентов не имел мутаций в вирусном белке нейраминидазе, ответственных за резистентность к озельтамивиру или занамивиру. Кроме того, изучение действия озельтамивира и занамивира на ферментативную активность ней-раминидазы изолированных вирусов Н1Ш также показало, что данные препараты эффективно ингибировали их нейраминидазную активность и ИК50 (ингибирующие концентрации 50) были сравнимы с ИК50 этих препаратов для лабораторных и эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В. Таким образом, предварительные исследования показали, что вирус гриппа типа А (Н1Ш), вызывающий заболевания людей, начиная с апреля 2009 года, является устойчивым к действию противовирусных препаратов амантадин и ри-мантадин, но чувствителен к осельтамивиру (Та-мифлю) и занамивиру (Реленза) [8]. Однако на настоящий момент эти данные пока не подтверждены изучением чувствительности противогриппозных препаратов к этой группе вирусов в культуре клеток. Целью настоящей работы являлось изучение биологических свойств вирусов гриппа А (Н1Ш), выделенных в Калифорнии и Москве в
апреле—мае 2009 г., и определение чувствительности противогриппозных этиотропных химиопрепаратов в отношении данных вирусов в культуре клеток, а также на основании молекулярно-генетического анализа.
Материал и методы
Вирусы и клетки. Вирусы, изолированные от пациентов из Калифорнии, на 10-дневных куриных эмбрионах (A/California/07/2009) и в культуре клеток MDCK (A/California/04/2009), полученные из Центра по контролю заболеваний ( США, Атланта) были переданы для исследования во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора из ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Были приготовлены стоки вирусов, которые хранили при -70°С. Перед началом эксперимента вирусы прошли по четыре пассажа на куриных эмбрионах и в культуре клеток MDCK. 23 мая 2009 г. из ФГУН ЦНИИЭ был передан клинический материал (мазки из носа и зева) от больного, вернувшегося 18 мая из США. Из клинического материала при первом пассаже на клетках MDCK был изолирован вирус гриппа, как описано ранее [9]. В реакции ПЦР выделенный вирус был идентифицирован как высокопатогенный НШ1, происходящий от свиней и получивший название А/ Moscow/01/2009swl.
В настоящей работе использовали пулы вирусов, наработанные при заражении клеток MDCK клиническим материалом (А/ Moscow/01/2009swl), а также стоки вирусов А/ Califomia/04/2009 или А/California /07/2009. В качестве рефе-ренс-вируса использовали вирус А/Соломоновы острова/03/06/.
Клетки MÄCK выращивали на среде ДМЕМ (ООО БиолоТ, Санкт-Петербург) с добавлением 10% эмбриональной телячей сыворотки (HyClone, Бельгия), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл канамицина в атмосфере с 5%-содержанием СО2.
За день до эксперимента по исследованию противовирусной активности препаратов клетки MDCK высевали на 96-лу-ночные планшеты (Orange Scientific, Бельгия) из расчета 30 000 клеток/лунку в 200 мкл среды для культивирования клеток.
Для заражения клеток вирусом использовали следующую ростовую среду (среда для размножения вируса): ДМЕМ (ООО БиолоТ, Санкт-Петербург), 0,2% БСА (Sigma-Aldrich, США), 2 мкг/мл обработанного ТРСК трипсина (Sigma-Aldrich, США), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл канамицина.
Исследование биологических свойств вирусов. Для определения 50%-ной эмбриональной инфекционной дозы (ЭИД50) и 50% тканевой цитопатической инфекционной дозы (ТЦИД50) вирусы титровали на 10-дневных куриных эмбрионах и в культуре клеток MDCK соответственно. Величины ЭИД50 и ТЦИД50 рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина [10].
50%-ную мышиную инфекционную дозу (МИД50) определяли в опытах по интраназальному заражению 80 мышей ВАЬВс 8-недельного возраста. В экспериментах использовали десятикратные разведения стоков вирусов, начиная с 1:10, в фосфатнобуферном растворе в объеме 50 мкл. Значение МИД50 рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина [10].
Реакцию гемагглютинации (РГА) выполняли, титруя 50 мкл культуральной среды/аллантоиса в 50 мкл PBS с последующим добавлением 50 мкл 0,5% эритроцитов петуха.
Определение нуклеотидной последовательности вирусов. Вирусную РНК выделяли из гомогената клеток MDCK, инфицированных штаммом A/Moscow/01/2009(H1N1)swl, с помощью набора для выделения РНК «SV Total RNA Isolation System» (Promega Corporation, США) в соответствии с инструкцией производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с праймерами Uni12 с помощью AMV обратной транскриптазы
Є
В ПОМОЩЬ ПРАКТИКУЮЩЕМУВРАЧУ Таблица 1. Биологические свойства штаммов высокопатогенного вируса гриппа ЖМ
Название вируса
История ^ТЦИД50/мл Тигр в РГА lg ЭИД50/ мл lg МИД50/мл МИД50/(ЭИД50)
пассажей
A/Califomia/07/2009(H1N1)
A/California/04/2009(H1N1)
A/Moscow/01/2009(H1N1)
4/РКЭ, 1/MDCK 5,5 1:128
5/MDCK 6,4 1:64
2/MDCK 6,2 1:64
7,5
5
4,8
1,5
(Fermentas, Литва). ПЦР проводили со специфическими к каждому сегменту вирусной РНК праймерами, рекомендованными ВОЗ (http://www.who.int/entity/csr/resources/publications/swine-flu/GenomePrimers_20090512.pdf). Продукты амплификации выделяли с помощью QIAquick gel extraction kit (QIAGEN, США) и затем секвенировали по обеим цепям ДНК по прямому и обратному праймерам M13 на автоматическом секвенаторе 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). При анализе полученный: нуклеотидныгх последовательностей использовали пакет программ Vector NTI Advance 10 (Invitrogen, США). Полученные нуклеотидные последовательности опубликованы в базе данны: GenBank под следующими номерами: GQ246613, GQ246614, GQ246615, GQ246616, GQ246617, GQ184628, GQ184629, GQ184630.
Препараты. В экспериментах использовали субстанции следующих препаратов: арбидол, предоставленный фирмой «Фармстандарт» (серии 2188, 2189), солянокислый ремантадин (АО Адамантан, Москва) и рибавирин (ICN, США).
Цитотоксическое действие 50 (ЦД50) определяли как описано ранее [11].
Противовирусную активность исследуемых препаратов в отношении вирусов гриппа А учитывали по уровню экспрессии вирусных антигенов в тест-системе на основе иммуно-ферментного анализа (ИФА) [11].
При изучении активности противовирусных препаратов методом ИФА клетки MDCK, как уже бышо сказано выше, выращивали в 96-луночныгх планшетах. Перед заражением вирусом клетки 2 раза промывали средой без сыворотки для снижения возможной неспецифической реакции. Исследуемые препараты добавляли к клеткам в двукратной концентрации в 100 мкл среды МЕМ. К вирусному контролю добавляли по 100 мкл среды, а к контролю клеток — 200 мкл. После инкубации клеток с исследуемыми препаратами в течение 1,5—2 часов при 37°С в лунки, исключая клеточный контроль, добавляли по 100 мкл вируса на среде ДМЕМ. Множественность заражения составляла 0,001-0,1 ТЦИД50 на клетку. Все процедуры проводили на среде для размножения вируса. Далее планшеты инкубировали в термостате с СО2 в течение 20 ч при 37°С. После инкубации клетки исследовали под инвертированным микроскопом, чтобы зарегистрировать отсутствие в них цитотоксиче-ских и цитопатических изменений. Среду удаляли и клетки фиксировали 80% ацетоном в PBS в течение 15 минут, хорошо высушивали и затем отмывали 3 раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ, PBS с 0,05% твин-20). Эти и все дальнейшие процедуры отмывки проводили указанным раствором. Затем к клеткам добавляли по 100 мкл раствора PBS c 1% фетальной сыворотки и 0,05% твин-20, инкубировали при 37°С в течение 30 мин. После удаления раствора к клеткам добавляли по 100 мкл моноклональный: антител (МКА) к NP-белку вируса гриппа А в концентрации 10 мкг/мл. После инкубации с антителами в течение 1 часа при 37°С в лунки вносили по 100 мкл IgG кролика против IgG мыши, меченнык пероксидазой хрена в разведении 1:1000. После 4-кратной отмывки лигированную пероксидазу вышвляли добавлением в лунки 100 мкл ОФД (ор-тофенилендиамин-субстратный буфер). Реакцию учитывали по оптической плотности (ОП) при 490 нм в спектрофотометре фирмы Биоком. Каждое разведение вируса исследовали в 4 повторностях, для которых вычисляли среднее значение ОП490. Процент ингибирования определяли по формуле:
100 X [1 (ОП490 опыта ОП490 клеточного контроля)/
ОП490 вирусного контроля ОП490 клеточного контроля]
Результаты исследования
1. Сравнительное изучение биологических свойств вирусов A/California/04/2009, A/California/07/2009, A/Moscow/01/2009swl.
В первой серии экспериментов были исследованы биологические свойства вирусов A/California/04/2009(H1N1), A/California/07/ 2009(H1N1) и A/Moscow/01/2009(H1N1)swl. Изучение вирусов в реакции гемагглютинации (РГА), в культуре клеток и при заражении куриных эмбрионов показало, что они сравнимы по свой инфекционности. Титры всех трёх изученных вирусов в РГА, а также их значения ТЦИД50 для них сходны (табл. 1). Значение ТЦИД50 вируса A/California/07/2009(H1N1) было несколько ниже (на 0,7—0,9lg), чем соответствующие величины для двух других штаммов вируса. Это возможно объяснить тем, что вирус A/California/ 07/2009(H1N1) изначально был выделен и пассировался только на РКЭ (ЭИД50 на 2 lg превышает ТЦИД50). Возможно, что в ходе предыдущих пассажей на эмбрионах тропизм вируса к рецепторам клетком MDCK был отчасти утрачен, что может быть связано с особенностями рецепторного сайта молекулы ге-магглютинина исследуемых вирусов [12].
Показано, что гибель мышей при заражении их вирусами, выделенными от людей, наступает только после адаптации этих вирусов путем многократного пассирования их в лёгких животных [13]. Эксперименты по заражению мышей вирусами A/California/04/2009(H1N1), A/California/ 07/2009(H1N1) в разведениях 1:10—1:107 показали, что ни в одном случае данное заражение не вызвало гибели мышей. В то же время у инфицированных мышей наблюдались клинические признаки заболевания, такие как конъюнктивит, чихание, снижение активности, исхудание, изменение качества шерсти, одышка (частые движения грудной клетки с усилением брюшного дыхания), вибрация грудной клетки при дыхании (хрипы). Надо отметить, что эти признаки в группе мышей, зараженных вирусом A/California/ 07/2009(H1N1) в разведении 1:10, начали проявляться уже через 1 сутки после заражения. Через 2 суток заболели уже 83% животных из этой группы. Первые признаки заболевания в других группах появились на 2—4-е сутки, причем клиническая симптоматика проявлялась только до разведений не выше 1:104 в 0,1 мл. На 3—5-е сут-
e
Таблица 2. Действие противогриппозных препаратов на репродукцию новых вирусов гриппа А (ЖМ) в культуре клеток MDCK
Название препарата/вируса Процент подавления вирусной репродукции
Множественность заражения Множественность заражения
0,1/0,01 ТЦЦ50на клетку 0,01/0,001 ТЦЦ на клетку
Арбидол (мкг/мл) 5,0 10 15 5,0 10 15
А/ Калифорния/07/2009 49,5+6,5* 79,0+7,9 92,0+13,8 60,3+9,2 83,6+0,5 98,3+2,8
А/Калифорния/04/2009 51,3+2,8 74,0+9,8 99,0+1,4 57.0+12,7 76,5+9,1 98,2+2,8
А/Москва/01/2009 swl 45,4+3,6 74,7+7,0 98,3+2,9 55,3+13,3 81,2+14,4 100
А/Соломоновы острова/ 03/06 21** 61 96 42 88 99
Рибавирин (мкг/мл) 10 10
А/Калифорния/07/2009 68,3+2,4 89,0+10,5
А/Калифорния/04/2009 61,5+3,5 100
А/Москва/01/2009 swl 80,7+21,8 92,5+8,7
А/Соломоновы острова/ 03/06 74 85
Римантадин (мкг/мл) 0,1 1 5 0,1 1 5
А/Москва/01/2009 swl н. и. 8+1 н. и. 15+2 10+1 15+1
А/Калифорния/07/2009 н. и. н. и. н. и. 16+2 12+2 н. и.
Примечание. * — среднее значение по результатам трёх независимых опытов, каждый из которых проведен в 4 параллелях; ** — среднее значение одного опыта, проведённого в 4 параллелях; н. и. — не идентифицировано.
ки от начала болезни наблюдали постепенное выздоровление. Длительность заболевания у мышей доходила до 9 суток. На вскрытии через 6 суток от момента заражения были обнаружены признаки пневмонии, гиперемия ткани лёгких, вплоть до крупозного воспаления. МИД50 для вирусов гриппа А/СаШогта/07/2009(НШ1) составляла 5,0 ^ в мл и содержала 1,5 ЭИД50. Значение МИД50 А/СаШогта/04/2009(НШ1) были примерно таким же, составляя 4,8 ^ (см. табл. 1).
2. Изучение цитотоксического действия субстанций препаратов. Определение цитотоксического действия субстанций препаратов в культуре клеток МБСК показало, что для субстанции арбидола цитотоксическая доза 50 (ЦД50) составила 40 мкг/мл, субстанции ремантадина — 60 мкг/мл, а для субстанции рибави-рина — 100 мкг/мл.
3. Изучение противовирусной активности субстанций препаратов. В первой серии экспериментов изучено действие арбидола, риманта-дина и рибавирина на репродукцию вирусов гриппа НШ1 в культуре клеток МБСК при двух различных множественностях заражения: (0,01 ТЦИД50/кл и 0,1 ТЦИД50/кл — для вирусов, выделенных культуре клеток, 0,001 ТЦИД50/0,1 мл и 0,01 ТЦИД50/0,1 мл — для А/СаШогта/07/2009 (НШ1). В качестве контроля был использован эталонный штамм вируса гриппа человека А/Соломоновы остро-ва/03/06(НШ1). Для предварительной оценки активности субстанция арбидола была изучена при трёх концентрациях 5,0, 10 и 15 мкг/мл. Субстанция рибавирина была изучена в концентрации 10 мкг/мл, римантадин в концентрациях 0,1, 1 и 5 мкг/мл, последняя из которых эквивалентна по молярности концентрации арбидола 10 мкг/мл. Из данных, представленных
в табл. 2, видно, что римантадин во всех изученных концентрациях при двух множественностях заражения практически не оказывал какого-либо действия на репродукцию всех трёх изученных вирусов гриппа H1N1.
Напротив, арбидол и рибавирин оказывали ингибирующее влияние на репродукцию всех изученных вирусов гриппа, причем степень ингибирования во всех случаях зависела от множественности заражения. Наибольший ингибирующий эффект размножения всех изученных вирусов наблюдался при добавлении арбидола и рибавирина при более низкой множественности заражения. При увеличении концентрации арбидола его ингибирующий эффект на репродукцию как эталонного штамма вируса гриппа, так и вирусов гриппа увеличивался. Из данных табл. 2 также видно, что арбидол и рибавирин эффективно подавляли размножение всех изученных вирусов, причем уровень ингибирования для каждого вируса был практически одинаковым (60—80%) при использовании их в равной концентрации 10 мкг/мл.
Однако дизайн проведённого эксперимента позволяет получить только первичные данные о противовирусной активности изученных субстанций и не дает возможности выявить точно различия по активности как между самими препаратами, так и в отношении изученных вирусов. В связи с этим далее нами было изучено действие различных концентраций препаратов с выявленной активностью (арбидол и римантадин) на репродукцию вирусов гриппа А/ California /04/2009, А/ California/07/2009, А/ Moscow /01/2009swl. Данные о влиянии различных концентраций арбидола (2, 4, 6, 8, 10, 12,5, 15 мкг/мл) на репродукцию этих вирусов гриппа, представлены графически на рис. 1.
Є
Чувствительность к арбидолу вирусов Н1М А/ Moscow /01/2009swl (а), А/ California /07/2009 (b) и А. /California /04/2009 (с).
Видно, что ингибирующий эффект находится в пропорциональной зависимости от концентрации препарата. Арбидол в концентрации 2 мкг/мл
подавляет репродукцию вируса на 22—38%, при увеличении концентрации до 4 мкг/мл величина ОП490 уменьшается примерно вполовину по сравнению с вирусным контролем. Последующее увеличение концентрации арбидола приводит к дальнейшему подавлению экспрессии вирусных антигенов, а при концентрации 12,5—15 мкг/мл размножение вируса подавляется практически полностью. Такие же кривые зависимости виру-сингибирующего эффекта от концентрации (доза-ответ) были получены для рибавирина. Концентрации препаратов, ингибирующие вирусную репродукцию на 50%, представлены в табл. 3. Ингибирующая концентрация (ИК50) арбидола для вирусов гриппа А/ California /07/2009 и А/ Moscow /01/2009swl была примерно одинаковой и составляла около 4 мкг/мл. Для субстанции рибавирина ИК50 была несколько ниже, чем для арбидола: в отношении вирусов гриппа А/ California /07/2009 и А/ Moscow /01/2009swl составляла 2 мкг/мл и 1,5 мкг/мл соответственно.
4. Определение нуклеотидной последовательности вирусов гриппа H1N1 и анализ участков, ответственных за резистентность к противовирусным препаратам. Резистентность к препарату обусловлена мутациями в том вирусном белке, который является мишенью действия препарата. Известно, что препараты адамантанового ряда являются блокато-рами М2 белка, и резистентность к ним обусловлена мутациями в положениях 26, 27, 30, 31 или 34 белка мишени М2 [13]. Занамивир и озельтамивир являются ингибиторами вирусного фермента ней-раминидазы, резистентность к ним обусловлена наличием мутаций в его активном сайте. Мутации в положениях R292K и E119G нейраминидазы обусловливают резистентность к обоим ингибиторам нейраминидазы, в то время как штаммы с единственной из мутаций R292K или в 274 положениях резистентны к озельтамивиру, и обладают только сниженной чувствительностью к занамивиру [14, 15]. Анализ нуклеотидной последовательности штаммов А/ California /07/2009, A/California/ 04/2009 и А/ Moscow /01/2009swl показал, что ней-раминидаза этих штаммов, кодируемая сегментом NA, не содержит характерных мутаций (E-119, H-274, R-293, N-295), обусловливающих резистентность вируса к её ингибиторам осельтамивиру и занамивиру. Как следует из нуклеотидной последовательности изученных штаммов, в них присутствует одна, определяющая, мутация в положении
Таблица 3. Ингибирующая концентрация 50 ( ИК50) для различных противовирусных препаратов в отношении различных штаммов вирусов гриппа Н1М
Вирусы ИК50, мкг/мл
Рибавирин Римантадин Арбидол
А/Califomia/07/2009 2,0 >5 4,0
А/Califomia/04/2009 1,5 >5 4,0
А/Moscow/01/2009swl 1,5 >5 4,0
e
31 М2 белка (серин заменённый на аспарагин), что подтверждает полученные нами в культуре клеток данные об устойчивости этих вирусов к ри-мантадину.
Мутанты, резистентные к арбидолу, в настоящий момент получены только in vitro в культуре клеток путём многократного пассирования ( около 20 пассажей) вируса в присутствии препарата. Изучение механизма действия арбидола показало, что его мишенью являются нейроминидазы вируса гриппа и резистентность к нему обусловлена мутациями в положениях K51N, Q42H, Q27N, Kl17R его субъединицы HA2 [16]. Анализ генома вирусов гриппа H1N1 показал, что в вирусах H1N1 А/ California /07/2009, A/California/ 04/2009 и А/ Moscow /01/2009swl нет замен, ответственных за резистентность к арбидолу, что совпадает с полученными нами данными об активности этого препарата в культуре клеток.
Обсуждение результатов
15 и 17 апреля 2009 года в США были зарегистрированы заболевания гриппом у людей, вызванные новым вирусом гриппа H1N1 с уникальной комбинацией генома, получившим название мексиканский (свиной) грипп. К настоящему времени зарегистрированы заболевания в 105 странах. ВОЗ объявила об угрозе возникновения первой в этом веке пандемии гриппа. Изучение биологических свойств вирусов гриппа A/California/04/2009 (H1N1), A/California/07/ 2009 (H1N1), выделенных от пациентов в Калифорнии (США), а также A/Moscow/01/2009 (H1N1)swl, выделенного от заболевшего пациента, прибывшего в Москву из США, проведённое нами в настоящей работе, показало, что все три вируса хорошо размножаются как в культуре клеток, так и в куриных эмбрионах, при этом их инфекционные титры не различаются значительно. Выявленное нами снижение титра вируса в культуре клеток для вируса A/California/07/2009 (H1N1) (менее 1lg), возможно объяснить тем, что вирус A/California/07/2009(H1N1) изначально был выделен и пассировался только на РКЭ. Возможно, что в ходе пассажей на эмбрионах тропизм вируса к клеткам MDCK был отчасти утрачен, что связано с особенностью рецепторного сайта молекулы гемагглютинина исследуемых вирусов. Известно, что белок НА1 имеет сродство к сиаловым кислотам, которые соединены как с 3-м (a-(2—3)-Gal), так и с 6-м (a-(2—6)-Gal) атомом галактозы (Gal) углеводных группировок рецепторов клетки. Для клеток MDCK характерно наличие обоих типов рецепторов, тогда как для оболочки, выстилающей аллантоисную полость РКЭ, характерно наличие только (а-(2—3)-Gal) [12]. Проведённое нами изучение вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) на мышах показало,
что он не обладает высокой патогенностью. Инфицирование мышей данным вирусом не вызвало их гибели, в то время как признаки заболевания у животных наблюдались, причем 1 МИД50 содержала 1,5 ЭИД50. Вирусы данной группы по своей патогенности в отношении мышей значительно отличались от вирусов подтипа H5N1, вызвавших заболевания у людей, и инфицирование которыми мышей приводит к развитию системного острого заболевания, приводящему к летальному исходу без предварительной адаптации [17].
В настоящей работе нами было показано, что препараты арбидол и рибавирин в культуре клеток MDCK в дозах, не токсичных для клеток, существенно ингибировали репродукцию вирусов гриппа A/California/04/2009(H1N1), A/California/ 07/2009(H1N1) и A/Moscow/01/2009(H 1N1 )swl, вызвавших заболевания у людей в апреле-мае 2009 г. Ингибирующий эффект обоих препаратов зависел от множественности заражения вирусами и увеличивался при ее уменьшении. Действие ар-бидола и рибавирина в культуре клеток возрастало с увеличением их концентрации. Значения ИК50 для арбидола и рибавирина были сходны со значениями, полученными ранее для эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В человека [18,19]. Значение ИК50 в наших опытах для арбидола было выше, чем у рибавирина. Однако если для выражения ИК50 использовать молярные концентрации препаратов, то с учётом того, что молекулярная масса рибавирина в два раза ниже, чем молекулярная масса арбидола, различие в ИК50 будет незначительным. Нами не было выявлено действия римантадина на репродукцию ни у одного из изученных вирусов в культуре клеток. Эти результаты подтверждают данные молекулярно-генетического анализа штамма A/Moscow/01/2009(H1N1)swl, проведённого нами, а также штаммов A/California/04/2009 (H1N1), A/California/07/2009(H1N1), опубликованных ранее [1, 8]. Определение нуклеотидной последовательности этих вирусов свидетельствует о замене в М2 белке в положении 31, ответственном за резистентность к препаратам адамантанового ряда (амантадин и риманта-дин). Напротив, проведённое нами определение нуклеотидной последовательности штамма A/Moscow/01/2009(H1N1)swl показало отсутствие аминокислотных замен в НА, ответственных за резистентность к арбидолу. Молекулярно-генетический анализ штаммов A/California/ 04/2009(H1N1), A/California/07/ 2009 (H1N1) также подтвердил эти результаты. Таким образом, совокупность полученных нами результатов показала, что новые вирусы гриппа АЩШ1) являются устойчивыми к действию римантадина, но чувствительны к арби-долу и рибавирину.
Большой интерес представляет дальнейшее изучение эффективности данных препаратов на модели животных. Однако проведённое нами в настоящей работе изучение вируса гриппа на модели гриппозной пневмонии мышей показало, что данные вирусы вызывают только слабые признаки заболевания, но не вызывают гибели мышей при их заражении. Также показано, что для хорьков, являющихся другой животной моделью для изучения эффективности противогриппозных препаратов, данный вирус также слабо патогенен и не вызывает гибели животных, а потеря веса при их заражении составляет всего 8% (обычно 25%). Все это делает невозможным достоверное изучение эффективности действия препаратов без предварительной адаптации данного вируса к животным. С другой стороны, адаптация вируса, обладающего уникальной композицией генома, к животным поможет получить новую информацию о механизмам патогенеза гриппозной инфекции.
Угроза возникновения вызванной вирусом гриппа А новой пандемии гриппа, последствия которой трудно предсказать, является реальной. Опыт предыдущих пандемий в прошлом веке показывает, что они могут различаться по своей тя-
ЛИТЕРАТУРА
1. Emergence of novel swine-origin influenza A (H1N1) virus in human. Novel swine-origin influenza A (H1N1) virus investigation team. The New England Journal of Medicine 2009; 10: 1—10.
2. FDA. Antiviral Drug Advisory Committee. Gaithersburg: Centre for Drug Evaluation and Research 2002; 1—266.
3. Zlydnikov D. M, Kubar O. I., Kovaleva T. P. et al. Study of rimantadine in the USSR: a review of the literature. Rev Infect Dis 1981; 3: 408—421.
4. Hayden F. WHO guidelines on the use of vaccines and antivirals during influenza. Annex 5-considerations for the use of antivirals during an influenza pandemic, Geneva, 2—4 October, 2002.
5. Glushkov R. G. Arbidol. Antiviral, immunostimulant, interferon inducer. Drug Future 1992; 17: 1079—1081.
6. Гусъкова Т. А, Глушков P. Г. Арбидол — иммуномодулятор, индуктор интерферона, антиоксидант. М.: 1999; 93.
7. Rodriguez W. J, Hall C. B., Welliver R. et al. Efficacy and safety of aerosolized ribavirin in young children hospitalized with influenza: a double-blind, multicenter, placebo-controlled trial. J Pediatr 1994; 125: 129—35.
8. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. Update: drug susceptibility of swineorigin influenza A (H1N1) viruses, April 2009.Centers for Disease Control and Prevention (CDC) 2009; 58: 433—435.
9. Meguro, H, Bryant, J. D., Torrence, A. E.,Wright, P. F. Canine kidney cell line for isolation of respiratory viruses. J Clin Microbiol 1979; 9: 175—179.
10. Ашмарин И. П., Воробъев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: 1962; 173.
жести, и прогнозирование течения пандемии является комплексным процессом, зависящим от многих факторов. Среди них важнейшим является оценка чувствительности вируса, вызвавшего пандемию, к противогриппозным препаратам. В связи с тем, что на этом этапе полноценные клинические исследования на людях невозможны, необходимо тщательное доклиническое изучение, включающее в себя исследование чувствительности вируса к препарату на основе молекулярно-генетического анализа, его способности подавлять размножение вируса в культуре клеток, а также эффективности на животных моделях. При получении доказательств противовирусной активности лекарственного средства in vitro необходимо оценивать возможность его применения in vivo с учётом способности препарата к достижению эффективных концентраций в крови. С другой стороны, помимо активности в выборе противогриппозных препаратов значимыми являются уровень безопасности, доступность и стоимость. В совокупности эти факторы помогут выработать необходимую стратегию лечения и профилактики гриппозной инфекции в условиях приближающейся пандемии и принять решения о создании запаса противогриппозных препаратов.
11. Ленёва И. А., Фадеева Н. И., Федякина И. Т. и др. Применение им-муноферментной индикации вирусспецифических антигенов в изучении нового противогриппозного препарата арбидола. ХФЖ 1994; 9: 4_8.
12. Gambaryan A. S., Tuzikov A. B., Piskarev V. E. et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolimers non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'sialyl(N-acetyllactosamine). Virology 1997; 232: 345—350.
13. Ward A. Virulence of influenza A virus for mouse lung. Virus Genes 1997; 14: 187—194.
14. Hay A. Amantadine and Rimantadine Mechanisms. In book: Antiviral Drug Resistance, D.Richman (ed), John Willey and Sons Ltd, UK. 1996; 44—58.
15. Monto A. Viral susceptibility and the choice of influenza antivirals . Clinical Infectious Diseases 2008; 47: 346—348.
16. Leneva I. A., Russell R. J., Boriskin Y. S., Hay A. J. Characteristics of arbidol-resistant mutants of influenza virus: implications for the mechanism of anti-influenza action of arbidol. Antiviral Res 2009.
17. Avian influenza A (H5N1) infection in humans. The writing Committee of the WHO Consultation on human influenza A/H5. New Engl J Med 2005; 353: 1374—1385.
18. Ленева И. А., Федякина И. Т., Гусъкова Т. А., Глушков Р. Г. Чувствительность различных штаммов вируса гриппа к арбидолу. Изучение эффекта арбидола на репродукцию вируса гриппа А в комбинации с различными противовирусными препаратами Тер архив 2005; 8: 84—88.
Crotty S., Cameron C., Andino R. Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis? J Med Chem. 2002; 80: 86—95.
-e-
