CC BY
53
Є
Изучение чувствительности пандемических вирусов гриппа А 2009 НШ1 и высоковирулентных вирусов гриппа птиц А (Н5Ш) к противогриппозным химиопрепаратам
И. Т. ФЕДЯКИНА1, М. Ю. ЩЕЛКАНОВ1, П. Г. ДЕРЯБИН1,
И. А. ЛЕНЕВА2, Н. В. ГУДОВА2, Т. В. КОНДРАТЬЕВА3, Д. К. ЛЬВОВ'
1 НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского, Москва
2 Центр по химии лекарственных средств — Всероссийский научно-исследовательский химико-фармацевтический институт; Москва
3 ОАО Фармстандарт, Московская обл., Долгопрудный
Susceptibility of Pandemic Influenza Virus A 2009 H1N1 and Highly Pathogenic Avian Influenza Virus A H5N1 to Antiinfluenza Agents in Cell Culture
I. T. FEDYAKINA, M. YU. SHCHELKANOV, P. G. DERYABIN, I. A. LENEVA, N. V. GUDOVA, T. V. KONDRATYEVA, D. K. LVOV D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Moscow;
Centre for Chemistry of Drugs, All-Russian Research Chemicopharmaceutical Institute, Moscow;
JSC Pharmstandart, Moscow Region, Dolgoprudnyi
В paбoте пpивoдятcя laniLic' го цитoтoкcичнocти и aнтивиpycнoй a^^rocm кoммеpчеcкиx пpoтивoгpипroзныx xhmho-пpепapaтoв — Pемaнтaдинa, Ocельтaмивиpa, Apбидoлa и Pníiaoupnna в культуре клеток MDCK в oтroшении вдутое rpMnna А, имеющ№ эпидемичеcкoе з^чение в пocтпaндемичеcкoм пеpиoде. Cyбcтaнции пpепapaтoв Apбидoл,
Pибaвиpин, Pемaнтaдин эффективго пoдaвляли pепpoдyкцию вы^^Е^уле^^« виpycoв rpиnna нтиц A (H5Nl), изoли-pooaMMLx oт бoльныx нтиц. Apбидoл и ocельтaмивиp кapбoкcилaт пoдaвляли pепpoдyкцию пaндемичеcкиx виpycoв rpиnna А 2009 (HlNl) с изменëннoй pецептopнoй cпецифичнocтью, вызвaвшиx тяжёлые cлyчaи зaбoлевaния у людей. Пoкaзaнo, чтo в oramm oт выcoкoвиpyлентныx виpycoв грипп; птиц A (H5Nl) изученные штаммы виpyca пaндемичеcкoгo rpиnna А 2009 (HlNl) резистентны к Pемaнтaдинy.
Ключевые слова: вирус гриппа А, Ремантадин, Осельтамивир, Арбидол, Рибавирин.
The data on cytotoxicity and antiviral activity of commercial antivirals, such as Remantadine, Oseltamivir, Arbidol and Ribavirin in the MDCK cell culture infected with highly pathogenic (H5N1) and pandemic 2009 (H1N1) influenza A viruses are presented. The study of the antiviral activity of antivirals in the MDCK cells culture demonstrated that Arbidol, Rimantadine and Ribavirin efficiently inhibited reproduction of the highly pathogenic H5N1 influenza viruses isolated from sick birds. Arbidol and Oseltamivir carboxylate selectively inhibited reproduction of the pandemic 2009 H1N1 influenza A viruses with changed specificity to the cell receptors, causing severe influenza in men, while remantadine had no effect on their reproduction.
Key words: influenza virus A, Rimantadine, Oseltamivir, Arbidol, Ribavirin.
В XX веке было зафиксировано три пандемии гриппа [1, 2]: 1918—1919 гг. («испанка», Н1Ш, унёсшая, по разным оценкам, от 50 до 100 млн человеческих жизней); 1957—1959 гг. («азиатский грипп», Н2Ш, более 1 млн); 1968—1970 гг. («гонконгский грипп», Н3Ш, около 1 млн). Крупная эпидемия гриппа А в 1977—1978 гг. («русский грипп», Н1Ш) лишь немного «не дотянула» до полноценной пандемии.
В 1997 г. в Гонконге вирус гриппа птиц А/Н5Ш впервые преодолел межвидовой барьер и вызвал заболевание у 18 человек, 6 из которых умерли. С осени 2003 г. высоковирулентный вирус
© Коллектив авторов, 2011
Адрес для корреспонденции: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16. НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского
гриппа A (H5N1) (HPAI / H5N1 — highly pathogenic avian influenza H5N1) начал активно распространяться на территории Юго-Восточной Азии, весной 2005 г. вдоль Джунгарского миграционного русла (тектонического понижения между Тянь-Шанем и Монгольским Алтаем) [1, 2] проник в Северную Евразию и охватил весь Старый Свет, вызвав не только масштабные эпизоотии с высокой летальностью (в ряде случаев — до 100%) среди диких и сельскохозяйственных птиц [1, 2], но и стал причиной 489 лабораторно подтверждённых случаев заболеваний людей, из которых 60% закончились летальными исходами. Несмотря на изначально высокий тропизм к клеткам млекопитающих, штаммы HPAI / H5N1, на сегодняшний день так и не приобрели аффинности к а2'-6'-сиалозидам, что не позволяет им эффек-
-е-
e
тивно репродуцироваться в эпителии верхних дыхательных путей человека и эффективно распространяться воздушно-капельным путём [1, 2]. Вместе с тем опасность преодоления межвидового барьера и приобретения эпидемического потенциала отдельными вариантами HPAI / H5N1 или их реассортантами остаётся достаточно высокой и требует постоянного эколого-вирусологи-ческого мониторинга [1, 2].
Первая пандемия XXI века разразилась в 2009 г. («свиной грипп», H1N1 swl*, пндм 2009 H1N1) и была этиологически связана с реассортантом двух генотипов вируса гриппа A (H1N1), адаптированного к свиньям: американского (ставшего источником сегментов PB2, PB1, PA, HA, NP и NS) и евразийского (NA и M) [3, 4]. К особенностям нового пандемического варианта следует отнести, во-первых место возникновения (Мексика, а не Китай, как это было с пандемиями XX века [1, 2]); во-вторых — исходную резистентность к адаман-тановым производным, ремантадину и амантади-ну, связанную с мутацией S31N в каналообразующем вирусном белке М2 [4, 5]; в-третьих — высокий риск стремительного развития тяжёлых пневмоний, особенно у пациентов с отягощённым анамнезом [5—7]. В конце 2009 г. в организме умерших больных стали обнаруживаться варианты вируса с мутациями в рецептор-связывающем сайте HA1, приводящими к двойной аффинности: как по отношению к а2'-6'-, так и а2'-3'-сиалозидам (с преобладанием последней), что позволяет вирусу эффективно поражать нижние отделы дыхательного тракта [6—7]. Характерный пример описан в работе Д. К. Львова с соавт. [7]: в носоглоточных смывах от трёх умерших больных с Чукотки обнаружены только консенсусные (немутантные) варианты, в трахее — смесь консенсусных и мутантных, а в лёгких — смесь мутантных вариантов вируса. 10 августа 2010 г. ВОЗ декларировала о наступлении в мире постэпидемического периода. На основе знаний и опыта прошлых пандемий можно ожидать, что в ближайшее время вирус будет циркулировать уже в качестве сезонного вируса, возможно социркулируя с другими штаммами сезонного гриппа. При этом дальнейшее распространение мутантов с высокой пневмотропностью при сохранении ими способности к респираторному пути заражения людей может привести к очередной пандемической волне. В настоящее время помимо вируса гриппа A пндм 2009 H1N1 от людей выделяют вирус гриппа A H3N2, вирус гриппа В, также в мире у людей и птиц продолжают регистрировать высокопатогенный вирус гриппа H5N1. Существует опасность реассортации пандемического вируса с циркулирующими вирусами, при этом особую озабоченность вызывает возмож-
* swl означает «swine-like» — свиноподобный.
ность таковой с высокопатогенными вирусами гриппа Н5Ш.
Несмотря на успехи вакцинопрофилактики гриппа, важнейшая роль в минимизации последствий этого заболевания отводится химиотерапии. На ранней стадии пандемии, когда вакцина с использованием пандемического штамма ещё не создана, противовирусная химиотерапия является наиболее эффективным инструментом здравоохранения. В постпандемический период наряду с вакцинацией противовирусные препараты продолжают также играть значительную роль. Они рекомендованы для лечения гриппа, протекающего в тяжёлой форме (например, требующей госпитализации), и для лечения пациентов, относящихся к группам риска по осложнениям при гриппе.
Целью настоящего исследования является изучение в культуре клеток МБСК противовирусной активности ряда коммерческих химиопрепаратов, лицензированных для медицинского применения в РФ — Ремантадина, Арбидола и Рибавирина — в отношении вирусов гриппа А, имеющих эпидемическое значение в ближайшем постпандемическом периоде: высоковирулентного гриппа А (Н5Ш), а также штаммов пандемического вируса гриппа А пндм 2009Н1Ш с изменённой рецепторной специфичностью, вызвавших тяжёлые случаи заболевания у людей.
Материал и методы
Вирусные штаммы были предоставлены Государственной коллекцией вирусов РФ при ФГУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ (табл. 1). Вирусы культивировали в аллантоисной полости 9—10дневных куриных эмбрионов (КЭ) в течение 48 ч при 36°С. Инфекционную и гемагглютинирующую активность определяли по ранее описанным методикам [8].
Клеточная культура MDCK (Madin-Darby canine kidney) — почки собаки (Canisfamiliaris) породы кокер-спаниель — была предоставлена Всероссийской коллекцией клеточных культур при ФГУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ. Культивирование клеток осуществлялось на среде DMEM (ИПВЭ РАМН, РФ) с двойным набором аминокислот, 5% фетальной телячьей сыворотки крови («HyClone», США) и антибиотиков.
Химиопрепараты использовались в форме активных субстанций: солянокислый а-метилтрицикло/3.3.1.1/декан-1-ме-танамин (АО «Адамантан», РФ) для Ремантадина; (3R,4R,5S)-4-(ацетиламино)-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновой кислоты этиловый эфир в форме фосфата («F. Hoffmann La Roche Ltd.», Швейцария) для Осельтамиви-ра; этилового эфира 6-бром-5-гидрокси-1-метил-4-диметила-минометил-2-фенилтиометилиндол-3-карбоновой кислоты гидрохлорид серий 2188 / 2189 (ОАО «Фармстандарт», РФ) для Арбидола; 1-/8^-Рибофуранозил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбок-самид («ICN Pharmaceuticals», США) для Рибавирина.
Цитотоксическое действие химиопрепаратов определяли после инкубации в течение 48 ч с клетками линии MDCK с помощью XTT-метода согласно методикам, описанным ранее [8—9]. Концентрация препарата, уменьшающая значение
%
I
s
СП
s
0
S
g
s
1
s
0
1 I
КЗ
o
oí
Оч
Со
I
-fcv
Таблица 1. Краткая информация о штаммах вируса гриппа А из ГКВ РФ, использованных в работе
Штамм Номер депонента в ГКВ РФ Источник изоляции ввд образец Место изоляции Субтип
A/duck/N о vosibirsk/56/2005 2371 Домашняя утка (Alias platyrhynchos dom.) Пул внутренних органов: мозг, Чановская котловина (Новосибирская обл.) Высоко вирулентный Н5М1
A/gygnus olor/Astrakhan/AstO5-2-6/2005 2384 Лебедь-шипун ( Cygnus olor) печень, селезёнка, сгусток крови Нижний пояс дельты Волги (Астраханская обл.)
A/grebe/Tyva06-l/2006 2393 Большая поганка (Podiceps crista tus) Оз. Убсу-Нур (Республика Тыва)
A/chicken/Moscow/2/07 2404 Домашняя курица ( Gallus gal lus dom.) Деревня Павловское (Московская обл.)
A/chicken/Krasnodar/300/07 2418 Домашняя курица ( Gallus gal lus dom.) ПТФ «Лебяжье-Чепигинское» (Краснодарский край)
A/gygnus gygnus/Krasnodar/329/07 2421 Лебедь-кликун ( Cygnus cygnus) Лиман Лебяжий (Краснодарский край)
A/pigeon/Rostov-on-Don/6/07 2423 Сизый голубь ( Columba livia) Хутор Гуляй-Борисовка (Ростовская обл.)
A/chicken/Rostov-on-Don/35/07 2434 Домашняя курица ( Gallus gal lus dom.) ПТФ «Гуляй-Борисовская» (Ростовская обл.)
A/cliicken/Primorje/l/08 2440 Домашняя курица ( Gallus gal lus dom.) Село Воздвиженка (Приморский край)
A/grebe/Tyva/2/2010 2682 Большая поганка (Podiceps crista tus) Оз. Убсу-Нур (Республика Тыва)
A/California/07/2009 2447 Человек (Homo sapiens sapiens) Назальный смыв Больная гриппом А(НШ1) средней тяжести Пандемический НШ1 из г. Сан-Диего (Калифорния, США); передан в ГКВ РФ из С ОС (Атланта, США); (ГО СБС 2009712112) по Программе международного обмена штаммами.
A/IIV-Vladivostok/59/2009 2534 Носоглоточный смыв Больная гриппом А (НШ1) средней тяжести из г. Владивосток (Приморский край).
A/IIV-Elista/64/2009 2539 Носоглоточный смыв Больная гриппом А (НШ1) средней тяжести из г. Элисты (Республика Калмыкия).
A/IIV-Khabarovsk/149/2009 2613 Лёгочная ткань Житель г. Хабаровска (Хабаровский край), умерший от лёгочной недостаточности при двусторонней пневмонии тяжёлого течения и РДС.
A/IIV-Anadyr/177/2009 2641 Лёгочная ткань Житель г. Анадыря (Чукотский автономный округ), умерший от лёгочной недостаточности при двусторонней пневмонии тяжёлого течения и РДС.
О
§
3
0~
1
Cr
n=¡
О
2 ?
Є
ОП450 на 50% по сравнению с контролем клеток, принималась за 50% цитотоксическую дозу (ЦД50). Максимальная концентрация препарата, не изменяющая значение ОП450 по сравнению с контролем клеток, принималась за максимально переносимую концентрацию (МПРК).
Противовирусная активность химиопрепаратов оценивалась по уровню подавления ими экспрессии вирусных антигенов с использованием твёрдофазного иммуноферментного анализа (ИФА), модифицированного для тестирования противовирусной активности в культуре клеток [9]. Концентрацию препарата, уменьшающую значение величины оптической плотности в ИФА в два раза по сравнению с контролем без препарата, принимали за 50% ингибирующую концентрацию (ИК50). Множественность заражения: 0.01 ТЦД50 (50% тканевая цитопатическая доза в культуре клеток). Для каждой комбинации вирусного штамма и концентрации химиопрепарата проводили три независимых эксперимента по 4 лунки планшета в каждом из них. Препарат вносили за 2 ч до заражения клеточной культуры.
Результаты и обсуждение
1. Изучение цитотоксического действия субстанций препаратов. Определение цитотоксичес-кого действия препаратов в культуре клеток MDCK с использованием ХТТ показало, что для арбидола ЦД50 составила 40 мкг/мл, для риманта-дина — 60 мкг/мл, а для рибавирина — 100 мкг/мл. МПРК всех полученных препаратов была ниже и составила 30 мкг/мл, 50 и 80 мкг/мл для арбидола, римантадина и рибавирина соответственно.
2. Изучение противовирусной активности препаратов в отношении различных штаммов высокопатогенных вирусов гриппа А/Н5 в культуре клеток MDCK. Для изучения влияния препаратов на репродукцию высокопатогенных вирусов гриппа птиц A/H5N1 использовали вирусы, происхождение которых описано в табл. 1
Изучение действия нетоксичных для клеток MDCK концентраций противовирусных препаратов арбидола, ремантадина и рибавирина на репродукцию ВГ птиц (A/H5N1) было проведено с использованием метода иммуноферментного анализа, модифицированного для определения противовирусной активности соединений в культуре клеток при множественности заражения 0,01 ТЦД50. Из полученных нами кривых зависимости вирусингибирующего эффекта от концентрации (доза-ответ) каждого из изученных химиопрепаратов были определены значения ИК50, которые
представлены в табл. 2. Видно, что все восемь изученных высокопатогенных вирусов гриппа птиц А/Н5Ш чувствительны к арбидолу, рибави-рину и ремантадину.
ИК50 арбидола для ВГ A/Gygnus gygnus/ Кга5поёаг/329/07, А^геЪе/Тууа06-1/06 и А/сЫск-en/Krasnodar/з00/07 составляла 9,8, 10,0, 10,1 мкг/мл соответственно и была незначительно выше для других пяти высокопатогенных ВГ / Н5Ш (от 11,1 до 13, 9 мкг/мл).
Среди всех восьми изученных вирусов гриппа птиц / Н5Ш для рибавирина ИК50 была наименьшей в отношении ВГ А^геЪе/Тууа06-1/06 и составляла 1,8 мкг/мл. В отношении других семи вирусов ИК50 рибавирина была несколько выше — от 3,5 до 5,6 мкг/мл.
Для ремантадина значения ИК50 в отношении изученных ВГ А/Н5Ш, изолированных от диких и домашних птиц, составляли от 1,3 до 4, 0 мкг/мл и были сходны с ИК50 рибавирина для этих же вирусов.
Полученные нами значения ИК50 для рибавирина и ремантадина в отношении изученных вирусов гриппа птиц Н5Ш были ниже, чем ИК50 арбидола для соответствующих вирусов, однако если для выражения ИК50 использовать молярные концентрации препаратов, то с учётом того, что молекулярные массы рибавирина и ремантадина в два и более раз меньше, чем молекулярная масса арбидола, то различие в ИК50 будет меньшим.
Таким образом, проведённые эксперименты показали, что арбидол, рибавирин и ремантадин в культуре клеток эффективно подавляли размножение всех изученных штаммов вирусов гриппа птиц А/Н5Ш.
3. Изучение чувствительности пандемических вирусов гриппа 2009 А(ИШ1) к противовирусным препаратам в культуре клеток МБСК. Происхождение и выделение использованных в исследовании вирусов гриппа А 2009 Н1Ш(пндм) с изменённой рецепторной специфичностью, вызвавших тяжёлые случаи заболевания у людей, описаны в табл. 1.
При изучении действия нетоксичных для клеток концентраций противовирусных препаратов на репродукцию изученных пандемических вирусов гриппа А пндм 2009 НШ1, для осельтамивира кар-
Таблица 2. Значения ИК50 противовирусных препаратов в отношении различных штаммов высокопатогенных вирусов гриппа птиц А/^М
Вирусы ИК50, мкг/мл
Арбидол Рибавирин Ремантадин
A/Grebe/Tyva06-1/06 10,0 1,8 2,1
A/chicken/Moscow/2/07 11,1 5,4 4,0
A/Gygnus gygnus/Krasnodar/329/07 9,8 5,6 2,1
A/chicken/Krasnodar/300/07 10,1 4,8 2,2
A/pigeon/Rostov-on-Don/6/07 12,5 5,1 1,3
A/chicken/Rostov-on-Don/35/07 12,8 4,9 1,4
A/chicken/Primorje/1/08 13,0 3,5 3,2
A//Tyva/2/2010 13,9 4,7 1,4
Є
Таблица 3. ИК50 для химиопрепаратов в отношении вирусов гриппа пндм 2009 №N1
Вирус ИК5о, мкг/мл
Ремантадин Арбидол Рибавиринрин Осельтамивир карбоксилат
А/СаШ/07/09 не ингибирует 7,5 10,8 Н. и.
А/11У-БШа/64/2009 не ингибирует 6,6 Н. и.* 0,1
А/ПУ-УШ^1ок/59/2009 не ингибирует 6,7 Н. и. 0,08
А/11У-КЬаЪагс^к/149/2009 не ингибирует 3,2 Н. и. 0,2
A/ГГУ-Anadyr/177/2009 не ингибирует 7,7 Н. и. 1,1
Примечание. * Н. и. - не изучали.
боксилата и арбидола были получены кривые зависимости вирусингибирующего эффекта от концентрации (доза-ответ), из которых для них были определены ИК50, представленные в табл. 3. В качестве сравнения был использован эталонный вирус гриппа А 2009 НШ1 (пндм) А/СаШотіа/07/09.
Арбидол и осельтамивир селективно подавляли репродукцию всех изученных штаммов вируса гриппа А 2009 Н1Ш(пндм) в культуре клеток МБСК, при этом значения ИК50 не отличались значительно для эталонного А/СаШотіа/07/09 и вирусов гриппа А 2009 Н1Ш(пндм) с изменённой рецепторной специфичностью, вызвавших тяжёлые случаи заболевания у людей. Значения ИК50 для арбидола в отношении всех изученных вирусов были сходны и составляли от 3,2 до 7,5 мкг/мл. Несмотря на то, что ИК50 для осельтамивира кар-боксилата в отношении вируса гриппа А/ІГУ-Anadyr/177/2009 составляла 1,1 мкг/мл и была почти в 10 раз выше, чем для других изученных нами вирусов гриппа А 2009 Н1Ш( пндм) (0,08—0,1 мкг/мл), ее значение входило в диапазон концентраций осельтамивира карбоксилата для различных штаммов вирусов гриппа А и В, оцениваемых как чувствительные к данному препарату.
В отличие от изученных нами вирусов гриппа птиц, представленные в этом исследовании вирусы гриппа А пндм 2009 Н1Ш были нечувствительны к ремантадину. Препарат в высокой концентрации 50 мкг/мл не вызывал подавления репродукции четырёх штаммов вируса гриппа человека А пндм 2009 Н1Ш в клетках МбСК (см. табл. 3).
Обсуждение результатов
Изученные противовирусные химиопрепараты имеют различную химическую природу и обладают различными механизмами действия. Наши исследования показали, что препараты арбидол, ремантадин и рибавирин в культуре клеток МБСК в дозах не токсичных для клеток, существенно ингибировали репродукцию изученных штаммов высоковирулентного вируса гриппа А (Н5Ш). Важно отметить, что в отличие от вирусов Н5Ш, изолированных от больных людей в 2003— 2004 гг. в странах Юго-Восточной Азии, которые были резистентны к препаратам адамантанового ряда, изученные нами вирусы гриппа Н5 были чувствительны к ремантадину, который эффек-
тивно подавлял их репродукцию в культуре клеток. Последний факт следует подчеркнуть особо, поскольку неконтролируемое применение препаратов адамантанового ряда, к которым относится ремантадин, на птичьих фермах в Юго-Восточной Азии привело к тому, что большинство штаммов из этого региона, изолированных от сельскохозяйственных птиц после 2004 г., обладают резистентностью к амантадину / ремантадину [10, 11]. Это чрезвычайно важно с точки зрения подготовки к возможной эпидемии и пандемии НРА1 / Н5Ш, а также химиотерапии и химиопрофилактики контингентов повышенного риска заболеваемости (персонала ПТФ, ветеринаров, охотоведов и т.д.). Полученные результаты согласуются с имеющимися данными о том, что в геноме штаммов НРА1 / Н5Ш Цинхай-Сибирского (2.2) и Уссурийского (2.3.2) генотипов, получивших распространение в западном и восточном секторах Северной Евразии, соответственно, отсутствуют молекулярные маркёры резистентности к исследованным химиопрепаратам [1, 2].
Данные, полученные в нашей работе, совпали с полученными ранее в многочисленных исследованиях данными о резистентности пандемических штаммов вируса гриппа А (Н1Ш) swl к ремантадину [4, 5]. Этот химиопрепарат ингибирует функционирование протонных каналов, формируемых тетрамером вирусного белка М2, и выход рибонуклеопротеида вируса в цитоплазму клетки-мишени. Поэтому резистентность к ремантадину формируется мутациями в М-сегменте вирусного генома, которых в настоящее время, известно несколько. Мутация Б3Ш содержится в белке М2 евразийского генотипа свиного гриппа А (Н1Ш), ставшего источником М-сегмента (наряду с МА-сегментом) в процессе реассортации с американским генотипом свиного гриппа А (Н1Ш), что привело к появлению пандемического гриппа А (Н1Ш) swl [3, 5]. Резистентность пандемического штамма (2009 г.) к ремантадину сделало это антигриппозное средство неэффективным для лечения пандемического гриппа.
Осельтамивир (Тамифлю) эффективен как в отношении пндм НШ1, так и в отношении высокопатогенных вирусов гриппа А (Н5Ш). Однако, уже известны случаи выделения вируса гриппа Н5Ш от пациентов, принимавших осельтамивир,
e
а к настоящему времени зарегистрированы более 300 случаев выделения резистентныж к осельтами-виру вирусов гриппа пндм 2009 H1N1. Кроме того, осельтамивир обладает сравнительно высокой стоимостью и остаётся малодоступным для значительной части населения России.
Хотя имеются немногочисленные клинические исследования, свидетельствующие в пользу эффективности рибавирина при лечении гриппозной инфекции у людей, данный препарат в настоящее время для лечения гриппа практически не используется. Одной из причин, ограничивающих его широкое использование, является наличие у него эмбриотоксических и тератогенных свойств. Лечение рибавирином (перорально) было предпринято во время первой вспышки птичьего гриппа у людей в Гонконге в 1997 году (1 пациент), а также во время вспышки во Вьетнаме в 2004 году (2 пациента), однако убедительных данных, позволяющих сделать вышод об эффективности этого препарата, получено не бышо [12]. Комбинация риба-вирина с другим противовирусным препаратом возможно позволит уменьшить побочные эффекты его высоких доз. В пользу этого свидетельствуют данные об использовании комбинации осель-тамивира, ремантадина и рибавирина в культуре клеток, показавшие эффективность комбинации в отношении осельтамивир- и ремантадинорезистентных штаммов вируса гриппа. Эта комбинация позже быша успешно применена при лечении тяжелого случая гриппа, вызванного пандемическим штаммов вируса гриппа H1N1 [13].
Таким образом, в настоящее время одним из основных химиопрепаратов выбора при лечении гриппозной инфекции в России остается отечественный препарат арбидол.
Механизм противовирусного действия арби-дола заключается в нарушении конформацион-ных изменений во второй субъединице поверхностного белка гемагглютинина (HA), необходимых для проникновения в мембрану эндосомы, что
ЛИТЕРАТУРА
1. Щелканов М. Ю. Эволюция высоковирулентного вируса гриппа A (H5N1) в экосистемах Северной Евразии (2005—2009 гг.). Дисс. ... д.б.н. М.: 2010; 488.
2. Львов Д. К. Популяционные взаимодействия в биологической системе: вирус гриппа A — дикие и домашние животные — человек; причины и последствия проникновения на территорию России высокопатогенного вируса гриппа A/H5N1. ЖМЭИ 2006; 3: 96—100.
3. Novel swine-origin influenza A (H1N1) virus investigation team. Emergence of novel swine-origin influenza A ( H1N1) virus in human. New Engl J Med 2009; 10: 1—10.
4. Львов Д. К., Бурцева Е. И., Прилипов А. Г. и др. Изоляция 24.05.2009 и депонирование в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ N 2452 от 24.05.2009) первого штамма A/Moscow/01/2009 (H1N1) swl, подобного свиному вирусу A (H1N1), от первого выявленного 21.05.2009 больного в г. Москве. Вопросы вирусологии 2009; 54: 5: 10—14.
5. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. Update: drug susceptibility of swineorigin influenza A (H1N1) viruses, April 2009. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) 2009; 58: 433—435.
приводит к нарушению слияния мембран вирио-на и эндосомы [14, 15]. В экспериментах in vitro обнаружены молекулярные маркёры резистентности к арбидолу [15], расположенные в пределах второй субъединицы HA, однако арбидолорезис-тентные штаммы до сих пор от людей не выделены. Кроме того, проведённые ранее исследования выявили активность арбидола в отношении резистентных к ремантадину и осельтамивиру штаммов вируса гриппа, что позволяют рассматривать его как препарат для лечения и профилактики гриппозной инфекции, вызванной такими вирусами. В нашей работе, как и в ранее проведённых исследованиях [16, 17] величина ИК50 арбидола в отношении патогенных вирусов были несколько выше, чем их ИК50, полученные нами ранее для непатогенных вирусов гриппа подтипа Н5, выделенных от диких птиц на территории России [17], а также эпидемических и эталонных штаммов вируса гриппа A и В человека [16, 18]. Более высокие концентрации арбидола, необходимые для подавления вирусной репродукции патогенных штаммов вируса гриппа птиц, дают основание для увеличения доз препарата в случае его использования для лечения инфекции, вызванной этими вирусами, как это было сделано с осельтамивиром [19].
Как подчёркивает ВОЗ в своих программных документах, в постпандемический период наряду с вакцинацией противовирусные препараты продолжают играть значительную роль. В связи с этим чрезвычайно актуальным является постоянный мониторинг чувствительности циркулирующих вирусов к противовирусным препаратам, а также устойчивой передачи вирусов, резистентных к противовирусным препаратам, от человека к человеку. Представленные в настоящей работе результаты являются частью этих исследований, проводимых в Центре экологии и эпидемиологии гриппа при ФГУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрав-соцразвития РФ.
6. Львов Д. К., Яшкулов К. Б., Прилипов А. Г. и др. Обнаружение аминокислотных замен аспарагиновой кислоты на глицин и аспарагин в рецептор-связывающем сайте гемагглютинина в вариантах пандемического вируса гриппа A H1N1 swl от больных с летальным исходом и со средне-тяжелой формой заболевания. Вопросы вирусологии 2010; 55: 3: 15—18.
7. Львов Д. К., Бурцева Е. И., Прилипов А. Г. и др. Возможная связь летальной пневмонии с мутациями пандемического вируса гриппа A / H1N1 swl в рецептор-связывающем сайте субъединицы HA1 гемагглютинина. Там же 2010; 55: 4: 4—9.
8. Assay Guidance Manual. http://www/ncgc.nih.gov/guidance/sec-tion2.html
9. Методические указания по изучению специфической противовирусной активности фармакологических веществ: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Ред. Р. У. Хабриев. М.: 2005; 532—557.
10. Cheung C. L., Rayner J. M., Smith G. J. et al. Distribution of amantadine-resistant H5N1 avian influenza variants in Asia. J Infect Dis 2006; 193: 12: 1626—1629.
Є
11. He G., Qiao J., Dong C. et al. Amantadine-resistance among H5N1 avian influenza viruses isolated in Northern China. Antiviral Res 2008; 77: 1: 72-76.
12. Avian influenza A (H5N1) infection in humans. The writing Committee of the WHO Consultation on human influenza A/H5. New Engl J Med 2005; 353: 1374-1385.
13. Nguyen et al. 2009.
14. Глушков P. Г., Фадеева Н. И., Ленева И. A. и др. Молекулярно-биологические особенности действия арбидола — нового противовирусного препарата. Хим-фарм журн 1992; 2: 8—15.
15. Leneva I. A., Russell R. J., Boriskin Y. S., Hay A. Characteristics of arbidol-resistant mutants of influenza virus: implications for the mechanism of anti-influenza action of arbidol. Antiviral Res 2009; 81: 132—140.
16. Ленёва И. А., Федякина И. Т., Гуськова T. A., Глушков P. Г. Чувствительность различных штаммов вируса гриппа к арбидолу. Изу-
чение эффекта арбидола на репродукцию вируса гриппа А в комбинации с различными противовирусными препаратами. Тер арх
2005; 8: 84—88.
17. Федякина И. Т., Ленёва И. А., Ямникова С. С. и др. Чувствительность вирусов гриппа А/Н5, изолированных от диких птиц на территории России, к арбидолу в культуре клеток MDCK. Вопр вирусол 2005; 6: 22-25
18. Ленёва И.А., Федякина И.Т., Еропкин М.Ю. и др. Изучение противовирусной активности отечественных противогриппозных химиопрепаратов в культуре клеток и на модели животных. Там же 2010; 3: 19—27.
19. Yen H., Monto A., Webster R. et al. Virulence may determine the necessary duration and dosage of oseltamivir treatment for highly pathogenic A/Vietnam/1203/04 influenza virus in mice. J Infect Diseases
2005; 192: 665—672
—è
