CC BY
14
инфекций. МУ 3.1.1027-01. М.: Минздрав России; 2002. С. 55.
5. Корнеев Г.А., Тарасов М.А., Кузнецов А.А. и др. // Отлов, учет и прогноз численности мелких млекопитающих и птиц в природных очагах инфекций. МУ 3.1.1029-01. М.: Минздрав России; 2002. С. 71.
6. Магомедов М.Р.Д., Ахтаев М.-Х.Р. Зависимость питания и состояние популяции гребенщиковой песчанки (Мегіопе.з іашагіясіпия) от динамики кормовых ресурсов. Зоол. журн. 1993; 72(2):101-110.
7. Павлов А.Н. К вопросу о распространении полуденных и гребенщиковых песчанок на правом берегу реки Волги. Труды Ростовского-на Д. НИПЧИ. Сталинград; 1959; Х1У:235-43.
8. Попов Н.В. Удовиков А.И., Яковлев С.А., и др. Оценка влияния роли современного потепления климата на формировании нового природного очага чумы песчаночьего типа на территории европейского Юго-Востока России. Поволжский экологический журнал. 2007; 1:55-64.
9. Попов Н.В., Корнев Г.А., Санджиев В.Б.-Х. Эколого-эпизоотологические последствия ирригации и орошения Нижнего Поволжья. РЭТ-инфо. 2000; 3:21-2.
10. Ралль Ю.М. Очерк экологии гребенщиковой песчанки Мегіопез ґашагізсіпт СаП. Грызуны и борьба с ними. Саратов; 1941; 1:179-207.
11. Сувернева Э.А., Тихомиров Э.Л., Тихомирова Н.И. // Распространение песчанок и их блох на территории СевероЗападного Шикаспия в 1970-1988 гг. Эпизоотология и профилактика особо опасных инфекций в антропогенных ландшафтах. Саратов, 1990. С. 74-80.
12. Тихомиров Э.Л. Особенности проявления эпизоотий чумы в условиях антропогенной трансформации ландшафтов (на примере Прикаспийского Песчаного очага чумы) [дис. ... канд. биол. наук! Саратов; 1991. 133 с.
13. Удовиков А.И. Санджиев В.Б.-Х., Толоконникова С.И, и др. Динамика численности малого суслика в регионе СевероЗападного Прикаспия в XX столетии и факторы, ее определяющие. Биоресурсы и биоразнообразие экосистем Поволжья.
Саратов; 2005. С 195-7.
14. Шилова С.А., Чабовский А.В. Неронов В.В.
Экономические перестройки и природные очаги инфекции. РЭТ-инфо. 2004; 1:8-10.
15. Яковлев С.А. Эпизоотологические последствия орошения Прикаспийской низменности [дис. ... канд. биол. наук]. Саратов; 1996. 118 с.
S.A.Yakovlev, G.V.Sangadzhieva, A.I.Udovikov, V.B.-H.Sandzhiev, V.P.Ossipov, V.V.Dikanskaya, N.V.Popov
Assessment of the Influence of Irrigation and Watering on the Changing of the Western Boundary of Tamarisk Gerbil Meriones Tamariscinus Pallas, 1773 (Rodentia, Cricetidae) Natural Habitat in the Territory of the Republic of Kalmykia
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe", Saratov; Elista Plague Control Station, Elista; Astrakhan Plague Control Station, Astrakhan
The modern boundaries of distribution of tamarisk gerbil - Meriones Tamariscinus (Pallas, 1773) were determined in the territory of the republic of Kalmykia. Shown was the role of irrigation and watering of the land in the expansion of its natural habitat to the north and north-west. Epizootiologic and epidemiologic consequences of tamarisk gerbil settling in the territory of Pre-Caspian North-Western steppe natural focus of plague were considered. The tendency of formation of the integrated plague natural focus of the gerbil type in the North-Western Pre-Caspian region and Ciscaucasia was confirmed.
Key words: tamarisk gerbil, house mouse, irrigation and watering of the land, natural habitat changing, biocenotic structure of the plague natural focus, epizootiologic consequences.
Поступила 04.05.08.
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 616.932+616.981.48
И.М.Крепостнова, Л.Ф.Ливанова, С.А.Бугоркова,
Н.И.Смирнова
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ СКОНСТРУИРОВАННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ДИПЛАЗМИДНОГО ШТАММА VIBRIO CHOLERAE СЕРОГРУППЫ О139, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО В-СУБЪЕДИНИЦУ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА И ФАКТОР КОЛОНИЗАЦИИ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ CFA/I
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Показано, что сконструированный авирулентный диплазмидный штамм Vibrio cholerae КМ182, продуцирующий В-субъединицу холерного токсина и фактор колонизации кишечной палочки CFA/I (обеспечивающих формирование антитоксического и антиколонизирующего иммунитета соответственно), способен защищать иммунизированных модельных лабораторных животных от экспериментальной холеры, вызванной вирулентным штаммом холерного вибриона 0139 серогруппы. Определены оптимальные иммунизирующие и заражающие дозы.
Ключевые слова: Vibrio cholerae О139 серогруппы, плазмида, метод RITARD, В-субъединица холерного токсина, фактор колонизации CFA/I.
Эпидемически опасные штаммы холерного ви- которых странах Европы (Германия, Великобритания,
бриона относятся к двум серогруппам - О1 (Vibrio Дания, Франция и др.) [4, 6, 7, 9, 12]. Что касается
cholerae классический и эльтор биовар) и 0139 Российской Федерации, то в последнее десятилетие
(V cholerae О139 с синонимом Бенгал). Вспышки продолжает существовать проблема неконтролируе-
холеры, впервые вызванные в 1992 г. возбудителем мой миграции и пребывания на территории страны
V. cholerae 0139 серогруппы в Индии и Бангладеш иностранных граждан и лиц без гражданства, что
(бенгальская холера), продолжают регистрировать- обеспечивает реальную возможность завоза бенгаль-
ся в ряде регионов Юго-Восточной Азии (Киргизия, ской холеры на ее территорию [3]. Между тем до сих
Узбекистан, Казахстан, Гонконг, Япония и др.) и в не- пор отсутствуют отечественные живые безопасные
и эффективные вакцины против возбудителя холеры новой серогруппы, способные индуцировать напряженный и длительный иммунитет у населения всех возрастных групп [11]. Такая ситуация обусловила конструирование нами авирулентного штамма холерного вибриона 0139 серогруппы с высокой продукцией основных протективных антигенов -В-субъединицы холерного токсина и фактора колонизации энтеротоксигенных штаммов кишечной палочки CFA/I, обеспечивающих формирование антитоксического и антиколонизирующего иммунитета соответственно.
В качестве носителя генов протективных антигенов нами был использован авирулентный, выделенный из воды штамм V. cholerae 170 серогруппы 0139, геном которого, по данным полимеразной цепной реакции (ПЦР), лишен основных генов вирулентности [5]. В клетки этого штамма с помощью коньюгационных скрещиваний последовательно были введены конъюгативные рекомбинантные плазмиды pIEM3, содержащая клонированный ген ctxB, кодирующий продукцию иммуногенной В-субъединицы холерного токсина, и несущая ген резистентности к тетрациклину Tcr и канамицину Kmr [2], и pCFAI. Плазмида pCFAI содержит клонированный ген cfa 1, контролирующий биосинтез основного фактора колонизации CFA/I патогенных для человека штаммов кишечной палочки и ген резистентности к триметоприму Tpr [10]. Было установлено, что введенные в состав плазмид клонированные гомо- и гетерологичные гены ctxB и cfa1 в условиях in vitro и in vivo стабильно наследовались и обеспечивали эффективную продукцию двух основных защитных антигенов.
Цель работы - определение протективных свойств сконструированного нами диплазмидно-го штамма, обозначенного как V cholerae КМ 182 (pIEM3)(pCFAI).
Материалы и методы
Протективные свойства штамма V. cholerae КМ182 определяли на модели взрослых кроликов породы «шиншилла», иммунизированных внутри-желудочно этим штаммом, с последующим заражением их вирулентным штаммом с помощью RITARD (removable intestinal tie-adult rabbit diarrhea) - техники. Метод RITARD основан на внутрикишечном заражении вирулентными штаммами V. cholerae взрослых кроликов [13] с предварительным наложением особой скользящей временной лигатуры на подвздошную кишку в области мезоаппендикса на срок, необходимый для адгезии и ранней колонизации тонкого кишечника холерными вибрионами, и последующего мониторинга инфекционного процесса в течение 5 суток. При этом регистрировали клинические признаки экспериментальной холеры: диарея (наличие жидких каловых масс, их цвет). Ежедневно осуществляли забор ректального мате-
риала с последующим высевом на 1 % пептонную воду и щелочной агар.
Внутрижелудочную иммунизацию осуществляли трехкратно с интервалом в 21 день взрослым кроликам массой 2,5-3 кг живыми клетками изучаемого штамма. Клетки вводили по методу Сгау с соавт. [8], используя желудочный зонд. Для нейтрализации кислого содержимого желудка было введено (с помощью желудочного зонда) 15 мл 5 % раствора гидрокарбоната натрия с интервалом в 15 мин. Иммунизирующие дозы составляли 109 м.к. и 5-1010 м.к. в 1 мл бульона ЬБ (таблица).
На 14-е сутки после последней иммунизации кроликов заражали вирулентным штаммом. Контролем служили 2 интактных животных, зараженных аналогичным образом. Патолого-анатомические исследования как опытных, так и контрольных животных проводили по мере их гибели и после умерщвления их хлороформом по истечении 5 сут. Оценивали изменения внутренних органов по состоянию кровенаполнения сосудов, наличию признаков дистрофии. В желудочно-кишечном тракте описывали состояние сосудов, степень наполнения кишечника содержимым, определяли его цвет, характер и объем. Для гистологических исследований брали кусочки внутренних органов - сердце, легкие, печень, селезенку, почки с надпочечником, мезентериальные лимфатические узлы и 3 отрезка тонкого и толстого кишечника, которые фиксировали в 10 % водном растворе формалина. После фиксированные кусочки внутренних органов изучали по общепринятой схеме [1].
Результаты и обсуждение
Для изучения протективных свойств штамма V сИо1вгав КМ182(р1БМ3)(рСЕА1) О139 серогруп-пы, содержащего антигены, обеспечивающие антибактериальный (0139 соматический антиген и полисахаридная капсула), антитоксический (В-субъ-единица холерного токсина), антиколонизирующий (фактор колонизации кишечной палочки СЕЛ/1) иммунитет, взрослые кролики были проиммуни-зированы внутрижелудочно в дозах, указанных в таблице. В качестве контроля были использованы интактные кролики.
Интактные кролики, зараженные по методу
Дозы заражения и иммунизации, используемые для изучения протективных свойств потенциально вакцинного штамма V екоіегае КМ182
№ группы Доза иммунизации, м.к. Доза заражения, м. к. % выживших животных Клиническое проявление инфекционного процесса
Контроль 0 109 0 ++++
1 109 108 100 -
2 109 10 9 50 -
3 5-1010 108 100 -
4 5-1010 109 50 -
RITARD токсигенным штаммом V. cholerae Р16064 в дозе 109 м.к., пали в течение 24 ч после заражения с характерной для холерной инфекции патоморфологической картиной острой диареи с последующим высевом чистой культуры холерного вибриона. При гистологических исследованиях обнаружены дистрофические изменения органов, гемодинами-ческие нарушения в виде различной степени выраженности полнокровия сосудов, в почках значительные поля некротического нефроза, в кишечнике выраженный катар.
Иммунные кролики через 14 дней после последней иммунизации были заражены по методу RITARD вирулентным штаммом V cholerae Р16064 0139 серогруппы в дозах 108 м.к. и 109 м.к. Все выжившие кролики (срок наблюдения 5 дней) были умерщвлены хлороформом.
В зависимости от иммунизирующей и заражающей доз все опытные животные были поделены на 4 экспериментальные группы (всего 8 животных).
Животные 1-й и 3-й опытных групп доживали до 5-х суток в 100 % случаев. У этих животных были обнаружены минимальные гемодинамические расстройства в виде незначительного полнокровия сосудов паренхиматозных органов и серозной оболочки тонкого кишечника. В тонком кишечнике содержалось небольшое количество серозно-слизистого содержимого желтого или желтовато-зеленоватого цвета. В толстом кишечнике было обычное содержимое. При гистологических исследованиях у животных этих групп регистрировали признаки умеренного функционального напряжения паренхиматозных элементов внутренних органов (печень, миокард) и незначительное очаговое полнокровие сосудов. Хотя у животных 3-й группы наблюдали на фоне полнокровия сосудов коры и мозгового вещества почек очаги некронефроза, умеренное полнокровие капиллярных клубочков, усиление клеточ-ности ряда клубочков. В кишечнике отмечены относительно минимальные доброкачественные изменении: умеренная очаговая гидропическая дистрофия эпителия, незначительное очаговое полнокровие сосудов подслизистой оболочки, небольшие циркуляторные нарушения - умеренный очаговый отек подслизистой оболочки. Наблюдали увеличение количества МЭЛ (межэпителиальных лимфоцитов) в тонком кишечнике с признаками их активации, усиление гиперпластической реакции в строме ворсин и собственной пластинки слизистой за счет увеличения количества лимфоцитов и плазматических клеток, появление бластических элементов. Такого рода изменения больше были выражены у животных 3-й группы. У животных этих групп отмечены достаточно четкие признаки вторичного иммунного ответа со стороны периферических органов иммунной системы, обычно в лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником. Наблюдалась гиперплазия клеток в периартериальных муфтах селезенки
с накоплением значительного числа бластических элементов в этих зонах (Т-зонах). В светлых центрах фолликулов и мозговых тяжах лимфатических узлов, зародышевых центрах и маргинальных зонах мальпигиевых телец селезенки чуть в меньшей степени регистрировали гиперпластические процессы и усиление митотической активности (В-зоны). Образование крупных светлых центров в фолликулах лимфоидных органов у животных 3-й группы отражало формирование наиболее полноценной иммунной реакции. В лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником (пейеровы бляшки), наблюдали активацию Т- и В- зон, накопление плазматических клеток и плазмобластов в купольной части лимфоидных образований. Все эти показатели показывают на достаточно высокую активность лимфоидных органов, даже с признаками некоторой гиперактивации, что можно объяснить завышенной дозой иммунизации.
Во 2-й и 4-й группах выжило 50 % кроликов. У выживших животных отмечали умеренную инъекцию сосудов серозной оболочки тонкого кишечника, регистрировали наличие незначительного объема серозно-слизистого желтоватого содержимого в верхних отделах тонкого кишечника и несколько в большом объеме слизистого желтовато-зеленоватого содержимого в нижних отделах тонкого кишечника. В толстом кишечнике кашицеобразное содержимое коричневого цвета. Умеренное полнокровие коркового вещества почек.
При гистологическом исследовании внутренних органов у животных этих групп отмечали достаточно выраженные признаки вторичного иммунного ответа, Т-зоны в селезенке и мезентериальных лимфатических узлах широкие плотные, с признаками активации (усиления митотической активности).
У животных 2-й группы у 50 % (павшие) наблюдался умеренный катар тонкого кишечника с наполнением жидкостью серозной слизи желтого цвета, в нижнем отделе скопление газа и кашицы только у павших животных. У выживших в течение 5 сут зараженных кроликов не наблюдалось изменений со стороны внутренних органов. Гистологические изменения наблюдали только у павших животных. У выживших животных не выявлены признаки специфического инфекционного воспаления. Обнаружено умеренное проявление активности в периферических лимфоидных органах, умеренное функциональное напряжение со стороны внутренних органов. Выжившие животные 4-й группы не имели макроскопических изменений внутренних органов.
Таким образом, сконструированный авирулент-ный штамм V. сИо1вгав КМ 182 обладал достаточной протективностью. Оптимальная доза иммунизации, защищающая лабораторных животных от развития инфекционного процесса при заражении их высоковирулентным штаммом V. сИо1вгав Р16064 в дозе 108, составила 109 м.к./мл.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. М.: Медицина; 1982.
2. Ильина Т.С., Смирнов Г.Б., Смирнова Н.И. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез В-субъ-единицы холерного токсина, способ ее конструирования и штамм бактерий Vibrio cholerae продуцент В-субъединицы холерного токсина. АС № 1505022 от 18.09.87.
3. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Безсмертный В.Е. и др. Холера в мире, странах СНГ и России: эпидемиологическая обстановка (1998-2007 г.) Холера и патогенные для человека вибрионы. Сб. матер. пробл. комиссии. Ростов н/Д, 2008; 21:13-6.
4. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Федоров Ю.М., Подосинникова Л.С., Горобец А.В. Холера в начале ХХ1 века. Прогноз. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005; 3:44-8.
5. Осин А.В., Ливанова Л.Ф., Ерошенко Г.А., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Изучение особенностей наследования и экспрессии рекомбинантной плазмиды с клонированными генами холерного токсина в авирулентном штамме. Холера и патогенные для человека вибрионы. Сб. матер. пробл. комиссии. Ростов н/Дону. 2002; 15:103-6.
6. Alam M., Hasan N.A., Sadique A., Bhuiyan N.A., Ahmed K.U., Nusrin S. et al. Seasonal cholerae caused by Vibrio cholerae serogroups O1 and O139 in the coastal aquatic environment of Bangladesh. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72(6):409б-104.
7. Albert M.J., Siddique A.K., Islam M.S. Large outbreak of clinical cholerae due to Vibrio cholerae non-O1 in Bangladesh. Lancet. 1993; 341:704.
8. Cray W.C., Tokunaga E., Pierse N.F. Successful colonization and immunization of adult rabbits by oral inoculation with Vibrio cholerae O1. Infect. Immun. 1983; 41(20):735-41.
9. Faruque S.M., Chowdhury N., Kamruzzaman M., Shafi Ahmad Q., Faruque A.S.G., Salam M.A. et al. Emerg. Infect. Dis. 2003; 9(9):1116-22.
10. Evans D.G., Evans D.J., Clegg S., Pauley J.A. Purification and characterization of the CFA1 antigen of enterotoxigenic
Escherichia coli. Infect. Immun. 1979; 25(2):738-48.
11. Ledon T., Valle E., Valmaseda T., Faruque A.S.G.,
Ansaruzzaman M., Faruque S.M. et al. Construction and characterization of O139 cholera vaccine candidates. Vaccine 2003; 21(11—12):1282—91.
12. Outbreak verification list. 27. WHO. Geneva, Switzerland
2005.
13. Spira W.M., Sack R.B., Froelich J.F. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Esherichia coli deiar-rhea. Infect. Immun. 1981; 32:739-47.
I.M.Krepostnova, L.F.Livanova, S.A.Bugorkova,
N.I.Smirnova
Investigation of Protective Properties of the Constructed
Recombinant Biplasmid Strain of Vibrio cholerae O139 Serogroup Producing Cholera Toxin B Subunit and Escherichia coli Colonization Factor CFA/1
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe",
Saratov
The constructed avirulent biplasmid Vibrio cholerae strain KM182 producing cholera toxin B subunit and Escherichia coli colonization factor CFA/1 (providing for antitoxic and anti-colonization immunity formation, correspondently) was demonstrated to protect immunized model laboratory animals from experimental cholera caused by the virulent Vibrio cholerae O139 strain. The optimal doses for immunization and challenging were determined.
Key words: Vibrio cholerae O139 Serogroup, plasmid, RITARD method, cholera toxin B subunit, colonization factor CFA/1.
Поступила 10.07.08.
УДК 616.981.452:575
Л.М.Куклева, Г.А.Ерошенко, В.Е.Куклев, Я.М.Краснов, Н.П.Гусева, Г.Н.Одиноков, В.В.Кутырев
СРАВНЕНИЕ ПОЛНОЙ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА RHAS У ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ОСНОВНОГО И НЕОСНОВНЫХ ПОДВИДОВ
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Определена полная нуклеотидная последовательность гена rhaS - регуляторного гена rha локуса хромосомы у штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов, а также у Y. pseudotuberculosis I-III сероваров. Установлено наличие в гене rhaS значимых и несущественных нуклеотидных замен, которые, по-видимому, являются причиной различной способности к ферментации рамнозы у штаммов возбудителя чумы (основного и неосновных подвидов) и псевдотуберкулеза.
Ключевые слова: возбудитель чумы, основной и неосновные подвиды Y. pestis, ферментация рамнозы, нуклеотидная последовательность.
Ферментация рамнозы является одним из важнейших диагностических признаков, позволяющих дифференцировать возбудителей чумы и псевдотуберкулеза. Yersinia pseudotuberculosis активно использует этот углевод в качестве источника углерода и энергии, тогда как штаммы основного подвида Y. pestis не способны к ферментации рамнозы [1, 5]. Штаммы неосновных подвидов чумного микроба, занимающие промежуточное положение между основным подвидом Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, способны ферментировать рамнозу, хотя выраженность этого признака у разных подвидов варьирует. Так, штаммы кавказского и алтайского подвидов активно ферментируют рамнозу в первые 24-48 ч от начала культивирования, а штаммы улэгейского подвида - в более поздние сроки через (48-96 ч)
[3]. Для штаммов гиссарского подвида отмечена изменчивость сроков проявления этого признака (от 1-2 сут до ее полного отсутствия) [4]. Причины столь существенных различий в проявлении способности к ферментации рамнозы у штаммов основного и неосновных подвидов остаются к настоящему моменту невыясненными. Устойчивое отсутствие этого признака у штаммов основного подвида У. pвstis свидетельствует о наличии генетического дефекта в генах локуса гИа, кодирующего ферменты утилизации рамнозы.
Ь-рамноза (метилпентоза) утилизируется бактериальными клетками с помощью группы ферментов, синтез которых детерминируется генами, расположенными в гИа локусе. Строение рамнозного регуло-на подробно изучено на модели кишечной палочки.
