CC BY
16
УДК 616.932:616.9-092.9
С.А.Бугоркова, Н.А.Осина, Т.В.Бугоркова, Л.Ф.Ливанова, Н.И.Смирнова, В.В.Кутырев
МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE С РАЗНЫМ НАБОРОМ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУЛЕНТНОСТИ НА ОРГАНИЗМ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЖИВОТНОГО
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
При сопоставлении данных клинико-морфологического анализа с результатами морфометрической оценки изменений у крольчат-сосунков, внутрикишечно зараженных холерными вибрионами с разным набором детерминант вирулентности, показано, что необходимым условием для развития холерогенной реакции у крольчат является обязательное присутствие в геноме холерного вибриона гена ctx.А. Экспериментальная инфекция в этом случаи сопровождается превышением учитываемых морфометрических параметров в почках и печени по сравнению с интактными животными. Изменения у крольчат, зараженных ctx А- штаммами, носят в большей степени адаптационно-компенсаторный характер и в незначительной мере обусловлены ZOT и ACE токсинами холерного вибриона. Реакция апудоцитов кишечника крольчат зависит от генотипа штаммов V. cholerae, используемых для заражения, и коррелирует со степенью выраженности морфологических изменений в кишечнике и внутренних органах экспериментальных животных.
Ключевые слова: холерный вибрион, детерминанты вирулентности, экспериментальная инфекция.
Возможность реализации патогенных свойств холерного вибриона в макроорганизме зависит от наличия в геноме микроба соответствующих детерминант вирулентности. В патогенезе холеры ведущая роль принадлежит токсинам, под влиянием которых происходит формирование основных патологических процессов, ведущих к обезвоживанию организма [4]. Продукцию последних связывают с наличием у вибрионов генов ctxAB, zot, ace, представленных в коровой области профага СТХф [15]. Не меньшее значение отводится этапу колонизации кишечника холерными вибрионами, продуктивность которого обусловлена наличием у патогена хромосомных генов (tcpA-F), входящих в состав острова патогенности VPI и кодирующих биосинтез пилей адгезии (TCP) - основного фактора колонизации [8, 10, 13].
Цель настоящего исследования - сопоставить данные клинико-морфологического анализа с результатами морфометрической характеристики изменений у крольчат-сосунков, зараженных холерными вибрионами с разным набором детерминант вирулентности.
Материалы и методы
В работе использованы 23 природных штамма V. cholerae биовара эльтор и 1 штамм - V. cholerae классического биовара, выделенные от больных, носителей и из внешней среды.
Для проведения ПЦР-анализа культур V. cholerae применяли тест-систему «ГенХол - Тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом ПЦР» (ТУ 8895-006-01898109-2007, производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб»). Работу выполняли в соответствии с инструкцией к препарату. Для выявления tcpA гена использовали олигонуклеотидные праймеры, предложенные S.P.Keasler, R.H.Hall [14], zot и ace генов — праймеры, предложенные A.Basu et
аі. [11], проводя амплификацию фрагментов tcpА, zot и асе генов с данными праймерами в соответствии с авторскими рекомендациями.
Для воспроизведения экспериментальной холеры 64 кролика-сосунка 7-8-дневного возраста массой 140-165 г внутрикишечно [12] заражали 4-часовой агаровой культурой V. смієте в дозе Ы07 м.к., контрольным крольчатам («К») внутрикишечно вводили 0,2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Всех павших и усыпленных хлороформом животных по истечении срока наблюдения (48 ч) подвергали патологоанатомическому исследованию. Гистологический материал, фиксированный в 10 % нейтральном растворе формалина, обрабатывали по общепринятой схеме [3]. Полутонкие срезы окрашивали гематоксилином и эозином [2], альциановым синим и Шифф-реактивом [6], импрегнировали серебром по Гримелиусу [6]. Морфометрическую обработку проводили с помощью аппаратно-программного комплекса МЕКОС-Ц и программы ДММ (версия 2.1.0.0).
Результаты и обсуждение
Интенсивность развития специфического инфекционного процесса у крольчат, обусловленного заражением V. смієте с разным набором детерминант вирулентности, оценивали по результатам учета макроскопических изменений (табл. 1).
Для морфометрического исследования экспериментальных животных объединили в три группы: 1-я - крольчата, зараженные культурами штаммов с генотипом СхА+, асе+, zot+ , tcpA+; 2-я- зараженные культурами штаммов с генотипом СхА-, tcpA+; 3-я -зараженные культурами штаммов с генотипом СхА-, tcpA-.
В 1-й группе регистрировали 100 % гибель крольчат в первые 25-30 ч наблюдения и развитие у них характерной холерогенной реакции в кишечнике
Таблица 1
Характеристика штаммов V. cholerae О1 серогруппы в тестах in vitro и in vivo
Генетическая характеристика штаммов Процент павших зараженных животных с
Штаммы V cholerae холерогенной реакцией энтеропатогенной реакцией Вирулентность т vivo
М1259, М1273, М1268, М674, 358, 569В, 410, 968 ctxA+, ace+,zot+, tcpA+ 100 0 Вирулентные
М1258, М1262, М1256, 1265 rtxA-, ace-, zot-, tcpA- 0 40 Слабовирулентные
М1191 otxA-, ace+, zot+, tcpA+ 0 50
М661, М1183, rtxA-, ace+, zot+, tcpA- 0 0 Лвирулентные
203, М1336, КМ27 rtxA-, ace-, zot-, tcpA+ 0 0
М1397, М1398, М1242, М1257, М1280, КМ26 rtxA-, ace-, zot-, tcpA- 0 0
на фоне различной степени выраженности гемодина-мических расстройств со стороны внутренних органов, особенно при заражении V. сЫ1ете еЬог М674 и V. сЫ1ете сЫ1ете 569В.
При гистологическом исследовании органов животных 1-й группы наблюдали дистрофические изменения паренхиматозных элементов в печени и почках на фоне выраженного полнокровия сосудов. По результатам морфометрического исследования отмечали резкое полнокровие капилляров коркового вещества почек и относительно выраженное полнокровие сосудов мозгового вещества (табл. 2). Суммарная площадь капилляров коркового вещества на единицу площади среза в этой группе в 3 раза превышала аналогичный показатель в группе контрольных крольчат. Более выраженным полнокровие сосудов коркового вещества было на введение холерных вибрионов штаммов V. сЫ1ете М1259 и V. сЫ1егае М1273 (11562,48±4888,23 и 10072,34±3756,22 мкм2 соответственно). Средний показатель количества почечных телец на единицу площади среза у животных в этой группе почти в 2 раза был ниже аналогичного показателя у контрольных крольчат. Наблюдали выраженную гидропическую дистрофию эпителия извитых канальцев почек вплоть до появления участков некротической гибели клеток и различной степени
выраженности явления отека и полнокровия сосудистых клубочков. Отмечали выраженные признаки нарушенного белкового и жирового обмена в гепатоци-тах, особенно при заражении холерными вибрионами классического биовара (штамм V. сЫ1ете 569В), так ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ) гепа-тоцитов у них составлял 0,16 (у животных из группы «К» - 0,28). У крольчат этой группы резко снижались процессы экстрамедулярного кроветворения в печени, а на фоне некоторого запустения внутридолько-вых синусоидальных печеночных гемокапилляров регистрировали резкое полнокровие центральных вен и уменьшение числа звездчатых ретикулоэндоте-лиоцитов (табл. 2). Эти изменения свидетельствовали о снижении не только синтетической функции гепа-тоцитов и детоксицирующих возможностей органа, но и защитных реакций макроорганизма, обусловленных адекватным функционированием ретикуло-эндотелиоцитов. Наблюдаемые частичная редукция лимфатических фолликулов в мезентериальных лимфатических узлах и относительная инверсия слоев коркового вещества надпочечников при умеренном снижении феохромии мозгового вещества отражали степень функционального напряжения процессов адаптации у экспериментальных животных.
В кишечнике крольчат регистрировали выра-
Таблица 2
Морфометрическая характеристика изменений у крольчат-сосунков, зараженных V cholerae О1 серогруппы
Определяемый показатель Группы штаммов Контроль (К)
1-я 2-я 3-я
Площадь почечного тельца в мкм2 (М±т) 2789,42±1096,08 2095,74±813,64 1995,55±649,06 1810,68±673,87
Площадь сосудистого клубочка в мкм2 (М±т) 1802,48±731,70* 928,900±368,46 884,390±381,49 836,13±327,05
Суммарная S капилляров коры в мкм2 (М±т) 9373,320±2684,13* 8961,29±3184,45* 3635,900±579,500 2978,64±975,6
Суммарная S капилляров мозгового вещества в мкм2 (М±т) 25426,01±5770,65 31867,12±8096,22 12530,52±3029,04 19788,92±1098,24
Количество почечных телец на S = 317706 мкм2 (М±т) 8,70±1,84* 12,79±2,55 11,88±3,34 19,8±1,24
Средняя S центральных вен печени в мкм2 (М±т) 49127,53±2774,28* 47814,69±27466,31 23800,41±3110,34 27356,84±6112,05
Суммарная S печеночных капилляров в мкм2 (М±т) 43682,65±17092,83 47391,91±9536,68 61297,42±21777,73 50759,18±4043,91
Ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ) гепатоцитов 0,2 0,24 0,3 0,28
Количество ретикулоэндотелиоцитов в одном поле зрения среза (М±т) 9,5±2,82* 10,2±3,02 11,43±3,12 29,7±3,02
* Достоверность результатов по отношению к контролю р < 0,05.
женный отек слизистой и подслизистой оболочек, гидропическую дистрофию энтероцитов, неравномерное полнокровие сосудов подслизистой оболочки, местами отчетливое увеличение размеров одних бокаловидных клеток на фоне резкого опустошения других, изменение секреторного профиля последних в сторону накопления в них кислых мукополисахари-дов (КМПС). Клетки нейроэндокринной (APUD) системы (табл. 3) реагировали дегрануляцией, что приводило к уменьшению количества апудоцитов во всех отделах кишечника. Наименьший показатель количества апудоцитов в тонком кишечнике крольчат 1-й группы регистрировали на введение холерных вибрионов штамма V. сЫ1ете М674 - 3,75±0,32 клеток (у эталонного вирулентного штамма V. ^о1егае 569В -4,5±0,25 клеток). Наивысшее значение - на введение вибрионов штамма V. сЫ1ете М1268 - 5,40±0,78 клетки. В функциональном отношении преобладали опустошенные клетки. Количество опустошенных апудоцитов в группе достигало (78,65±11,83) % (в группе «К» - 18,92 %), а для крольчат, зараженных холерными вибрионами классического биовара и погибших с развитием максимальной холерогенной реакции в кишечнике, этот показатель достигал 91,11 %. Холерные вибрионы классического биовара не вызывали активации синтетических процессов в апудоцитах, в отличие от вибрионов биовара еЬог. при введении которых регистрировали разной степени усиление синтетических процессов в клетках APUD-системы. Так, на заражение V. сЫ1ете М674 показатель гистохимической активности клеток значительно превышал аналогичный показатель у животных из группы «К» и составлял 10,67 %. В толстом кишечнике сохранялась тенденция к уменьшению в 2,2 раза количества клеток APUD-системы, по сравнению с показателем в группе «К», и усилению процессов опустошения апудоцитов.
Во 2-й и 3-й группах отмечали гибель единичных животных в первые 48 ч наблюдения с развитием в кишечнике энтеропатогенной реакции на фоне неравномерного умеренного полнокровия сосудов внутренних органов при заражении штаммами: V. ^о1-егае М1258, М1256, М1262, М1191. Максимальные макроскопические изменения были характерны для введения культуры штамма V. с^1ете М1191 (генотип - СхА-, zot+, асе+, tcpА+). Регистрируемые при
гистологическом исследовании дистрофические и гемодинамические нарушения были умеренными. По результатам морфометрического исследования более выраженное полнокровие капилляров коркового и мозгового вещества почек отмечали у животных, зараженных холерными вибрионами с генотипом ctxA-, tcpA+ - 2-я группа (табл. 2). Холерные вибрионы с генотипом ctxA-, tcpA- (3-я группа) вызывали развитие неравномерного кровенаполнения капилляров коркового и мозгового вещества почек. У крольчат 2-й и 3-й групп регистрировали уменьшение в 1,5 раза по сравнению с показателем для группы «К» количества почечных телец, в первую очередь при введении штаммов V. cholerae М661 и М1191. Отмечали очаговую гидропическую дистрофию эпителия извитых канальцев почек и незначительное полнокровие сосудистых клубочков у животных, зараженных холерными вибрионами штаммов V. cholerae: М1242, М661, М1183, М1191, среди которых лишь штамм V. cholerae М1242 был лишен генов, кодирующих синтез Zot и Ace токсинов.
В печени крольчат 2-й и 3-й групп регистрировали умеренные признаки нарушенного белкового и жирового обмена, без резкого изменения в системе печеночной гемоциркуляции. ЯЦИ гепатоцитов в группах был близок к показателю у контрольных животных. Отмечали снижение активности экстраме-дулярного кроветворения. На фоне незначительного полнокровия внутридольковых синусоидальных печеночных гемокапилляров у крольчат, зараженных штаммами V. cholerae М1242 и М1257, и умеренного запустения капилляров при введении штамма V. chol-erae М1191 регистрировали относительное полнокровие центральных вен. Наблюдали снижение количества ретикулоэндотелиоцитов в 2,9-2,6 раза соответственно по сравнению с показателем у крольчат из группы «К». На фоне умеренного снижения синтетической функции гепатоцитов, при введении отдельных штаммов как с генотипом ctxA-, tcpA+, так и ctxA-, tcpA- страдала детоксицирующая способность органа. Изменения со стороны лимфоидных органов не носили четкой зависимости от генотипа штаммов, используемых для заражения, и отражали функциональную незрелость иммунной системы крольчат. Реакция надпочечников свидетельствовала о включении адаптационных механизмов макроорганизма.
Таблица 3
Реакция апудоцитов кишечника крольчат-сосунков, зараженных V cholerae О1 серогруппы
Определяемый показатель
Группы Тонкий кишечник Толстый кишечник
штаммов Количество апудоцитов (М±т) Опустошенные клетки,% Гистохимически активные клетки, % Количество апудоцитов (М±т) Опустошенные клетки,% Гистохимически активные клетки, %
1-я 4,69±0,53* 78,65±11,83* 6,07±3,86* 2,34±0,57* 36,51±5,64 22,25±5,45
2-я 6,56±0,99 31,36±3,44 8,92±4,07* 3,83±0,84 40,13±6,75 7,04±2,14*
3-я 6,02±0,87 32,99±3,42 7,46±4,25* 3,77±0,73 41,39±2,45 7,22±3,07*
Контроль (К) 7,92±0,98 18,92±1,48 2,13±0,96 5,13±0,64 24,95±4,6 23,78±3,8
* Достоверность результатов по отношению к контролю р < 0,05.
В кишечнике животных наблюдали очаговый умеренный отек слизистой оболочки, гидропиче-скую дистрофию отдельных энтероцитов, умеренное полнокровие сосудов подслизистой оболочки. У отдельных крольчат, зараженных культурами штаммов М661, М1183, М1191, 203, отмечали полнокровие млечных синусов, увеличение количества бокаловидных клеток в толстом кишечнике на фоне умеренного повышения среди них числа клеток, содержащих КМПС. Эти изменения чаще регистрировали у животных, зараженных холерными вибрионами, в геноме которых присутствовали гены zot и ace. У животных 2-й и 3-й групп наблюдали умеренное функциональное напряжение апудоцитов кишечника (табл. 3), несколько активировался процесс накопления биологически активных веществ (БАВ) в клетках, с увеличением гистохимически активных форм. При этом процентное содержание опустошенных апудоцитов было в 1,7 раза выше, чем у животных из группы «К». Максимальное опустошение клеток регистрировали на введение V. cholerae М1242.
Данные о генетическом разнообразии клинических штаммов возбудителя холеры [5] свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения особенностей пато- и морфогенеза инфекционного процесса, обусловленного ими.
Выявленные при морфометрическом анализе особенности в реакции крольчат на внутрикишеч-ное введение различных по набору детерминант вирулентности холерных вибрионов свидетельствуют о сложности механизма взаимодействия микро- и макроорганизма. Показателями функционирования генов холерного вибриона в макроорганизме являются нарушения, возникающие в ответ на инокуляцию микроба, морфологическими эквивалентами которых можно считать развитие патологических или адаптационно-компенсаторных реакций.
Показано, что патогенетическая потенция микроба носит выраженный полидетерминантный характер, но необходимым условием для развития холерогенной реакции у крольчат является обязательное присутствие в геноме холерного вибриона гена ctxA. CtxA+ штаммы холерного вибриона вызывали у экспериментальных животных почти 3-кратное превышение учитываемых морфометрических параметров в почках по сравнению с интактными крольчатами, изменение в большей степени, чем в других группах, показателей функционального состояния печени, но имел место определенный разброс величин определяемых характеристик внутри группы животных, зараженных такими штаммами. Между тем, при отсутствии гена ctxA, несмотря на наличие в геноме исследуемых штаммов генов zot, ace и tcpA, отмечали формирование иных нарушений в организме биомодели, носящих в большей степени адаптационнокомпенсаторный характер и в незначительной мере обусловленных ZOT и ACE токсинами холерного ви-
бриона. Полученные данные согласуются с результатами исследования роли вариабельности генома профага СТХф в изменении вирулентности V. смієте биовара эльтор [9].
Процессы синтеза и секреции БАВ апудоцита-ми лежат в основе взаимосвязанной деятельности различных органов и систем макроорганизма [7]. По результатам исследования реакция апудоцитов кишечника крольчат находилась в зависимости, с одной стороны, от отдела кишечника, а с другой - от особенностей генотипа штаммов холерного вибриона, используемых для заражения, и коррелировала со степенью выраженности морфологических изменений в кишечнике и внутренних органах экспериментальных животных.
Таким образом, морфометрическая оценка изменений у крольчат-сосунков при введении холерных вибрионов штаммов с разным набором детерминант вирулентности, повышая информативность исследования, позволила уточнить роль отдельных факторов патогенности микроба в формировании экспериментального инфекционного процесса.
СПИСОК ЛИТЕРЛ.ТУРЫ
1. Кветной И.М., Южаков В.В. Окрашивание ткани эндокринных желез и элементов ЛПУД- системы. Микроскопическая техника. М.; 1996. 328 с.
2. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.; 1969. 645 с.
3. Меркулов ГА. Курс патогистологической техники. М.; 1969. 367 с.
4. Монахова Е.В., Писаное Р.В. Токсины холерных вибрионов. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2005; 1:7-18.
5. Осин А.В., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ геномов холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры. Генетика. 2005; 41(1): 53-62.
6. Пирс Э. Гистохимия. В.В. Португалова (ред.). М., 1962.
962 с.
7. Райхлин И.Т., Кветной И.М., Осадчук М.А. APUD-система (общепатологические и онкологические аспекты). Обнинск, 1993. 174 с.
8. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей геномов и их эволюционных преобразований у возбудителей холеры, чумы и сибирской язвы. Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. 2006; 2:9-19.
9. Смирнова Н.И., Осин А.В., Нефедов К.С. и др. Вариабельность генома профага СТХф и ее роль в изменении вирулентных свойств Vibrio cholerae биовара эльтор. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2007; 6:20-6.
10. Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Бардых И.Д., Винокур Н.И. Aдгезивность и некоторые другие свойства Vibrio cholerae с tcp+ctx- генотипом, изолированных из объектов внешней среды на территории Ростовской области в 2002 году. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004; 6:3-6.
11. BasuA.,Mukhopadhyay A.K., SharmaC. etal. Heterogeneity in the organization of the CTX genetic element in strains of Vibrio cholerae O139 Bengal isolated from Calcutta, India and Dhaka, Bangladesh and its possible link to the dissimilar incidence of O139 cholera in the two locales. Microb. Pathog.1998; 24(3):175-83.
12. DuttaN.K., HabbuM.K. Experimental cholera in infant rabbit: a metod for chemotherapeutic investigation. Brit. J. Pharmacol. 1955; 10:153-9.
13. KaraolisD.K., LanR., Kaper J.B., ReevesP.R. Comparison of Vibrio cholerae pathogenicity islands in sixth seventh pandemic strains. Infect. Immun. 2001; 69(3):1947-52.
14. Keasler S.P., Hall R.H. Detection and biotyping Vibrio cholerae O1 with multiplex polymerase chain reaction. Lancet. 1993; 341:1661.
15. WaldorM.K., Lasar S., KimseyH., Williams J.,MekalanosJ.J. СТХф: a novel filamentous phage encording cholera toxin. Bacterial Protein Toxins: Eight European Workshop. 1998; 29:363-71.
S.A.Bugorkova, N.A.Ossina, T.V.Bugorkova, L.F.Livanova, N.I.Smirnova, V.V.Kutyrev
Morphometric Assessment of the Influence of Vibrio cholerae Strains with Different Set of Virulence Determinants on Experimental Animal Organism
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Comparison of clinical and morphological analysis data and the results of morphometric assessment of changes in suckling rabbits infected intra-intestinally with cholera vibrios with different set of virulence determinants proved the presence of ctxA gene in Vibrio cholerae genome to be the necessary condition for the development of choleragen reaction. Experimental infection in this case is followed by the excess of the considered morphometric parameters in kidneys and liver in comparison with those of the intact animals. Changes in suckling rabbits infected with ctxA- strains are mainly of the adaptive and compensatory character and are determined by ZOT and ACE toxins of Vibrio cholerae to some extent. The reaction of the suckling rabbits' intestinal apudocytes depends on the genotype of V cholerae strains used for
challenge and correlates with the intensity of morphological changes in the intestine and internal organs of experimental animals.
Key words: cholera vibrio, virulence determinants, experimental infection.
Об авторах:
Бугоркова С.А., Осина Н.А., Бугоркова Т.В., Ливанова Л.Ф., СмирноваН.И.,КутыревВ.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: microbe@san.ru
Authors:
Bugorkova SA., OssinaN.A., Bugorkova T.V., LivanovaL.F., Smirnova N.I., Kutyrev V.V. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. 410005, Saratov, Universitetskaya St., 46. E-mail: microbe@san.ru
Поступила 03.09.09.
